Yazarlar işbirliği ve aşağıdaki araştırma fonu ajansı mali katkılarını kabul etmek istiyorum: Alberta Hayvancılık ve Et Ajansı Ltd., Domuz CRC, Alberta domuz, Hypor A Hendrix Genetik Firma ve NSERC CRSNG.

Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile ve Fakülte Hayvan Politikası ve Refah Kurulu onayı gereğince - Alberta Üniversitesi&#39;nden Hayvancılık, hamile sows gebelik ve embriyo 30 toplandı yaklaşık Gününde eğitilmiş personeli tarafından ötenazi uygulandı. işlemleri sırasında her zaman muayene eldivenleri kullanın. 1. Örnek Toplama ve Numune Depolama <ol><li> kansız bırakılarak, ardından tutucu cıvata kullanılarak ekmek öldürülür. Her ötenazi ekmek üreme yolları ve embriyolar toplamak için muayene eldiven giyin. Not: örnekler ve embriyo transferi hızlı toplama buz veya sıvı azot gibi mikrodizi ve qPCR gibi diğer moleküler işler için daha yüksek kalitede dokularda neden olur kuru. </li><li> Rahim incelemek ve yavaşça yatan rahim duvarından 21 kendi extraembryonic plasental membranların içindeki tüm embriyolar ayırın. Hiçbir anne doku kirlenme olduğundan emin olun. </li><li> Yenidendonma önce tüm canlı embriyoların kordon uzunluğu ve ağırlığı. </li><li> her embriyo toplayın ve hemen ek sıvı azot ile dondurma önce bir alüminyum folyo içinde tamamlamayı. </li><li> doğrudan -80 ° C derin dondurucuda sıvı azot dondurulmuş embriyolar transfer. </li></ol> 2. Öğütme Embriyolar <ol><li> numune sayısı için gerekli Numune No Tüm numune tüpleri (15 mi) etiketi analiz edilecek. </li><li> yarım dolu kuru buz ile ısı kabı doldurmak ve kuru buz içinde önceden etiketlenmiş örnek tüp yerleştirin. </li><li> Buz kabı kuru ° C derin dondurucuda -80 önceden soğutulmuş harç ve havan aktarmak için üst muayene eldiveni başka bir çift ile kış eldiven giyin. </li><li> kuru buz üzerinde harç içinde donmuş embriyo yerleştirin. </li><li> embriyo kapak ve ince bir toz haline tokmak ile öğütmek için yeterli bir sıvı azot dökün. </li><li> Bir MICR ile önceden etiketlenmiş numune tüpü embriyo toz transferiospatula (Şekil 1) ve -80 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin. </li><li> Her embriyo için temiz bir ön-soğutulmuş havan kullanın ve örnekler arasındaki çapraz kontaminasyonu engellemek için her bir embriyo öğütüldükten sonra muayene eldivenleri değiştirin. </li></ol> 3. Genomik DNA Hazırlama Sodyum hidroksit Yöntemi Modifiye kullanarak <ol><li> numune sayısı için gerekli etiket Tüm mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mi), analiz edilecek. </li><li> elde edilen embriyo tozu içeren örnek tüplerini aktarın -80 ° C derin dondurucuda bir kapta kuru buz ile önceden başlamadan. </li><li> Her bir önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpüne 50 mM NaOH (sodyum hidroksit) ile 180 ul pipet. </li><li> 95 ° C&#39;ye kadar bir kuluçka öncesi ısı açın. </li><li> 50 mM NaOH çözeltisi ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne Örnek borusundan embriyo tozun doğru miktarda (yaklaşık 5-10 mg) (Şekil 2) aktarmak için bir kürdan. </li><li> u çekinp aynı kürdan yavaş yavaş bir yapışkan, aşırı duygusal, beyaz, şeffaf benzeri bir madde (Şekil 3) DNA lizatı görselleştirmek için. </li><li> Beş dakika süre ile 95 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir inkübatör DNA lizat ile mikrosantrifüj tüpleri aktarın. Hemen buz dolu bir strafor kutu tüp aktarın. </li><li> doğrudan mikrosantrifüj tüpüne 1 M Tris-HCI 20 ul ilave edin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. PH santrifüj önce yaklaşık 8.0 (Şekil 4) sağlamak için pH kağıdı kullanın. Not: Örnek hazırlıkları çok sayıda uğraşırken, rastgele pH&#39;ı kontrol etmek birkaç örnek almak kabul edilebilir. </li><li> çözülmemiş doku çöküntüsü ortadan kaldırılmaktadır oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 2,000 xg DNA lisatı ile tüp santrifüjleyin. </li><li> Devri, yeni bir tüp içine, berrak yüzer 150 ul ya da 96 gözlü plakalar. Not: berrak DNA lizat PC şablon olarak kullanıma hazırR, reaksiyon ve iki hafta içinde 4 ° C&#39;de stabildir, ya da, bir yıl boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 4. Tasarım Sex-spesifik PCR primerler <ol><li> NCBI web sitesinden http://www.ncbi.nlm.nih.gov gelen Domuz seks belirleyici bölge Y (SRY) için katılım numaralarını (NM_214452.3) ve ve çinko parmak protein X&#39;e bağlı (ZFX) genleri (XM_005673501.1) elde /. </li><li> Kopyala ve bir online astar tasarım aracı bu NCBI erişim numaraları yapıştırın. Not: Uzunluk, Tm ve GC% olarak PCR ürün hacmi (bp), bilgisayar ekranında oluşturulur (Şekil 5) de dahil olmak üzere iyi primerler bilgileri. </li><li> Bu dizilerin yalnızca sırasıyla SRY ve ZFX (Şekil 6) X ve Y kromozomu üzerinde yer sağlamak için mevcut domuz genomik veri tabanında 104 karşı nükleotit Blast programı (BLASTN) kullanarak bu primerlerin özgüllük doğrula. </li></ol> Doğrudan DNA Lisatlar 5. genomik DNA, PCR <ol><li> kullanım15 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak DNA, lizat yalnızca 1 | il. Not: 96 oyuklu plakalar PCR için bir yüksek veri akışı tarama yöntemi, bir çok kanallı pipet kullanarak benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. </li><li> İlk PCR için aşağıdakileri yapın: ticari olarak elde bilinen seks domuz genomik DNA 1 ul (0.5 ng) ekleyerek hiçbir şablon negatif kontrol ve pozitif kontroller için iki ek borular için bir PCR tüpü hazırlayın. Daha sonra, bir pozitif kontrol olarak, son başarılı cinsiyet tayini analizi bir örnek vardır ve cinsiyet tespiti için yeni bir PCR reaksiyonunda ile birlikte çalışır. </li><li> Herhangi bir HotStart hazır karışım PCR enzimi kullanın ve ekleyerek primerler tarafından ana karışımı hazırlamak ve PCR reaksiyonlarının toplam sayısına bağlı olarak ücretsiz su nükleaz. PCR Master Mix 14 ul önceden var olan bir PCR tüpü içerisine DNA lizat için 1 ul ekle. primerler ekleme gibi, iki cinsiyete spesifik genlerden primerlerin nihai konsantrasyon 15 | il PCR r, toplam 0.3 uM olduğunu,eaction. </li><li> termal siki üs cihazında Aşağıdaki PCR programı ayarlama: 3 dakika, 95 ° C 35 döngü 15 saniye uzatma adımı, ardından 65 ° C&#39;de 15 saniye tavlama aşamasına ve ardından bir 20 saniye Erime aşama 98 ° C, her 72 ° C&#39;de. Son bir adımda, 72 ° C&#39;de 1 dakika için reaksiyonlar inkübe ve cinsiyet belirlemek için jel elektroforezi doğrulama için PCR tüpü çıkarılması kadar 4 ° C&#39;de inkübe devam etmektedir. Not: PCR koşulları ve optimizasyon Malzemeleri Tablo belirtilen PCR kiti kılavuzuna göredir. </li><li> % 2 TBE agaroz jel hazırlanırken, toksik olmayan yeşil-floresan SYBR DNA jel leke uygun miktarda ekleyin. Not: mevcut değilse Ethidium bromür sera floresan leke ikame edilebilir. </li><li> PCR tüp içine yükleme boyası (10x) 1.5 ul ekleyin ve PCR reaksiyon tamponu yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. </li><li> oyuk ve r içine örnek yüklenebilir 10 ulun uygun voltaj ayarlarıyla agaroz jel (boya bant kadar 100 V küçük jel cihaz, 150 V, 96 oyuklu jel aparatı jeli içinden yarım çalışır). </li><li> Gözlemleyin ve bir lazer tarayıcı kullanılarak floresan ışığı ayarı altında bantları yoğunlukları ayarlayın ve jel bir görüntü yakalamak. Not: Genel jel görüntüleyici etidyum bromür jel için ikame edilebilir. </li><li> Bir kadın olarak bir bant ve bir erkek olmak üzere iki bant (Şekil 7) ile embriyolar tanımlayarak domuz embriyoların cinsiyeti belirlemek. </li></ol>

<ol>
	<li>Seidel, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economics+of+selecting+for+sex:+the+most+important+genetic+trait.">Economics of selecting for sex: the most important genetic trait.</a> Theriogenology. 59, 585-598 (2003).</li><li>Guti&#233;rrez-Ad&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+consequences+of+sexual+dimorphism+during+pre-implantation+embryonic+development.">Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development.</a> Reprod. Domest. Anim. 41, 54-62 (2006).</li><li>Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+diet+and+other+factors+affecting+offspring+sex+ratio:+a+review.">Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review.</a> Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).</li><li>Gorecki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+ratio+in+litters+of+domestic+pigs+(Sus+scrofa+f.+domestica+Linnaeus,+1758).">Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758).</a> Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).</li><li>Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+initial+length+of+uterus+per+embryo+and+gestation+stage+on+prenatal+survival,+development,+and+sex+ratio+in+the+pig.">Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig.</a> J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).</li><li>Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+restriction+in+lactating+primiparous+sows+selectively+affects+female+embryo+survival+and+overall+litter.">Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter.</a> Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).</li><li>Cassar, G., King, W. A., King, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+sex+on+early+growth+of+pig+conceptuses.">Influence of sex on early growth of pig conceptuses.</a> J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).</li><li>Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+detection+in+porcine+embryos+using+fluorescence+in+situ+hybridization.">Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization.</a> Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).</li><li>Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+detection+in+pigs+using+comparative+genomic+hybridization:+from+the+oocytes+to+blastocysts.">Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopsy+of+human+preimplantation+embryos+and+sexing+by+DNA+amplification.">Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification.</a> Lancet. 1, 347-349 (1989).</li><li>Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+single-cell+biopsy+and+cryopreservation+of+preimplantation+mouse+embryos.">Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos.</a> Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).</li><li>Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+sex+determination+assay+for+bovine+preimplantation+embryos+using+the+polymerase+chain+reaction.">A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction.</a> Theriogenology. 35, 547-555 (1991).</li><li>Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+in+vitro+developed+buffalo+(Buhalus+buhalis.)+embryos+by+DNA+amplification.">Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification.</a> Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).</li><li>Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Y-chromosome-detecting+ovine+embryo+sexing+assay.">A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay.</a> Theriogenology. 33, 245 (1990).</li><li>Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+porcine+during+preimplantation+embryos+via+y-chromosome+specific+DNA+sequences.">Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences.</a> Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).</li><li>Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+identification+in+mammals+with+polymerase+chain+reaction+and+its+use+to+examine+sex+effects+on+diameter+of+day-10+or+-11+pig+embryos.">Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos.</a> J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).</li><li>Aasen, E., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+the+ZFY+and+ZFX+genes+for+sex+identification+in+humans,+cattle,+sheep+and+goats.">Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats.</a> Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).</li><li>Oliver, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+feed+intake+in+lactating+primiparous+sows.+II.+Effects+on+subsequent+litter+sex+ratio+and+embryonic+gene+expression.">Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression.</a> Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).</li><li>Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29, 52-54 (2000).</li><li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+embryos.">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 43, 610-614 (2007).</li><li>Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+different+dietary+energy+sources+during+folliculardevelopment+on+subsequent+fertility+of+cyclic+gilts.">Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts.</a> Animal. 8, 293-299 (2014).</li><li>Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+programming+of+postnatal+development+in+the+pig.">Prenatal programming of postnatal development in the pig.</a> Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Domuz embriyolar DNA seks yazarak ilgili mevcut protokollerin en erken evre öncesi implantasyon aşamasında 15,16 için uygundur. Biz başarıyla Geç gebelik sırasında domuz embriyo tarama için uygun bir protokol geliştirmiştir. Daha önceki çalışmalarda 6,18 embriyoların içindeki gelişim aşamalarında çalışmalara dayanarak, bu protokol, daha güvenli ve daha düşük maliyetli olarak kabul edilir. Bu protokol, aynı zamanda, bir 96-yuvalı plaka için...

yerli domuz, insan ve hayvan sektörlerinde gelişme, genetik ve beslenme temel bir araştırma konusu haline gelmiştir. insan araştırma için biyomedikal model olarak domuz potansiyel fizyolojik benzerlikler isnat edilebilir. Hayvancılık, cinsiyet oranı manipülasyon seçimi ve genetik iyileştirme programları 1 etkinliğini artırabilir. Bireysel embriyolar sexing dahil ancak erken embriyo gelişimi 2 sırasında genotip, epigenetik ve cinsel dimorfizm X inaktivasyonu ile sınırlı değildir, birçok deneysel araştırmalarda kullanılan temel bir araçtır. Farelerde yapılan çalışmalar, anne beslenme ve diğer faktörler, cinsiyet dengesizliği 3 neden olabileceğini düşündürmektedir. Domuzlarda, cinsiyet oranı dengesizlik nedenleri baba cins 4, rahim kapasitesi 5 ve sow metabolik durumunu 6 içerir. embriyolar ve yavrularına gözlenen farklılıklar se etkilemiş olabilir berixual dimorfizm araştırmacılar araştırma ile ilgili kararınızı vermeden önce embriyo cinsiyet ve cinsiyet oranları farkında olmalıdır. gelişme 30. günde domuz embriyolar sexing verimli araçlar ve protokollerin geliştirilmesi burada ele alınacaktır. seks yazarak çeşitli yöntemler model organizmaların ve hayvancılık genetik çalışmalar için geliştirilmiştir. Özellikle hayvancılık, erkek ve kadın erken embriyolar belirlenmesi ıslah programları için genetik seçimi geliştirmek için çok yaygın bir uygulamadır. Giemsa 7 veya yoğun floresan 8,9 teknikleri kullanılarak domuz Karyotipleme erken embriyolar seks yazım için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu metodlar zaman alıcı ve hızlı ve doğru bir şekilde embriyo sayıda taranması için uygun değildir. En etkili seks yazım metodu, ısı sabit DNA polimeraz ve bir çift primer kullanılarak DNA amplifikasyon. PCR yöntemi ile DNA cinsiyet tayini O, daha özel bir hızlı ve duyarlı birnly hücresel malzemelerin bir dakika miktarda gerektirir. İlk PCR tabanlı embriyo cinsiyet tayini insanlarda 10 üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra fareler 11, sığır 12, manda, koyun 13 14 pre-implantasyon embriyoları oldu. Domuz, erken DNA seks yazarak yöntemi Y-kromozomu spesifik DNA primerleri 15 tek çifti üzerinden pre-implantasyon embriyoları için kurulmuştur. Bununla birlikte, cinsiyet tespiti için en yaygın PCR primerleri, bir erkek spesifik SRY 16 ve X ve Y kromozom 17 hem de yer alan bir çinko parmak geninin olmayan seks ayırt bölgenin Y kromozom seçilmiştir. Daha sonra, bu primer, bir çinko-parmağı genin sadece X kromozomu tespit etmek için primerler geliştirilmiş özgüllük bu çalışmada gün 30 embriyo cinsiyet belirleme uygulanmıştır. domuz pre-implantasyon embriyoları genomik DNA proteinas tamponu için sağlam bir blastosist maruz bırakılarak elde edilebilire K 16 veya bireysel erken bölünme birkaç hücre biyopsi alarak 15 embriyolar ve direkt PCR için bunları kullanarak. Bununla birlikte, domuz kanı, saç, dokular ya da boyut olarak birkaç santimetre üzerinde büyük konseptus DNA salgılanmasının etkin bir şekilde proteinaz K yöntemiyle yapılmaz. Bu malzemeler için DNA ekstraksiyon yöntemleri zaman alıcı fenol / kloroform protokolleri 6 ya da pahalı sütun tabanlı kitleri 18 kullanılarak kurulmuştur. potansiyel olarak toksik kimyasalların kullanımını önlemek için, ucuz, kolay ve fenol içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemleri geliştirmek için bir eğilim vardır. Fare 19 ve zebra balığı 20 dokularından elde edilen kalite genomik DNA izolasyonu için protokol Bu tür sıcak sodyum hidroksit ve tris (Hotshot) kullanılarak kurulmuştur. Bu çalışma, PCR seks için Hotshot değiştirilmiş ve yeniden tasarlanmış dubleks primer çiftleri Günün hücre lizatları 30 domuz embriyolar ile doğrudan yazarak DNA elde etmek için bir protokol sağlaryüksek doğruluk.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&amp;nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig female and male genomic DNA</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 &amp;amp; GP-160-M5</td><td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>other imaging system can be used</td></tr><tr><td>Free Soft Nitrile Examination Gloves</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>any other examination glove can be used</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, solid&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>heat resistant</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Use as a incubator for 95 &amp;#176;C , don&#039;t need to use the heater</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>Autoclaved before use each time.</td></tr></tbody></table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

domuz prenatal programlama içine Araştırma gelişen embriyonun veya fetüsün cinsiyet gelişim sonucunu etkilemeye göstermiştir. Bu nedenle, bir embriyonun cinsiyetini belirleme yeteneği özellikle erken gelişimi ile ilgili birçok deneyler gereklidir. Bu protokol, PCR ile kullanım için domuz genomik DNA ucuz, hızlı ve toksik olmayan hazırlanmasını ortaya koymaktadır. Gün 30 embriyolar insanca mevcut protokol için Kurumsal Hayvan Politikası ve Refah Komiteleri tarafından oluşturulan kurallara göre toplanan gerekir. Bu PCR bazlı cinsiyet tayini tekniği bütün embriyo hazırlanması sadece önceden soğutulmuş bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde donmuş embriyo taşlama içerir. PCR kalitede DNA alkalin liziz reaktifi sıcak inkübasyon uygulayarak embriyo tozu küçük bir miktar serbest bırakılmaktadır. Daha sonra, DNA solüsyonu nötralizasyon tamponu ile karıştırılmış ve PCR için doğrudan kullanılmıştır. İki primer çiftleri DETEC için oluşturulacakyüksek doğruluk ve özgüllük ile X- kromozomunun Y kromozomu (SRY) ve ZFX bölgenin bölgesini belirleyen t özgü seks. aynı protokol gün daha önce başka bir uzun embriyolar (gün 14 gün 10) uygulanabilir 30. otomasyon ve yüksek için uygun hale embriyo çok sayıda tarama Ayrıca, bu protokol 96 dönüştü plakalı yapılabilir verim seks yazarak.

PCR ile 345 DNA Lizatlar taramadan cinsiyet tayini temsili bir sonuç Şekil 7&#39;de gösterilen ve Tablo 1&#39;de özetlenmiştir. Şekil 7&#39;de görüldüğü gibi, 65 ° C &#39;de primer tavlama ısısı farklı örnekleri arasında, bu PCR protokolü içindeki yoğunluk ve esas amplikon boyutları üretilmesi (Şekil 5) uygun bir durumdur. <p class=...

Watch this Scientific Journal Video about Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR at JoVE.com

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

accurate-and-phenol-free-dna-sexing-of-day-30-porcine-embryos-by-pcr

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Görüntüleme.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Video: Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Gelişim Biyolojisi

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetik

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to laboratories for studies to further our understanding of marine mammal reproduction. Heterologous IVF, a replacement for homologous IVF, could provide a means to test the sperm fertility potential; to study gamete physiology and early embryo development; and to avoid the use of valuable dolphin oocytes, which are difficult to obtain. Here, we present protocols that have been successfully used to collect and cryopreserve dolphin spermatozoa. The collection of semen is performed by manual stimulation on trained dolphins. Cryopreservation is accomplished using a TRIS egg-yolk based extender with glycerol. In addition, we present a protocol that describes heterologous IVF using dolphin spermatozoa and bovine oocytes and that verifies the hybrid nature of the resulting embryo using PCR. Heterologous fertilization raises questions on fertilization and can be used as a tool to study gamete physiology and early embryo development. In addition, the success of heterologous IVF demonstrates the potential of this technique to test dolphin sperm fertilizing capacity, which is worth further examination.

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Here, we present protocols that have been successfully used for dolphin spermatozoa collection, cryopreservation, and heterologous IVF performance using bovine oocytes.

Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage that forms the placenta. This method, however, requires specialized skills, is invasive, and suffers from false positives and negatives because the chromosome numbers in the TE and the inner cell mass (ICM), which develops into the fetus, are not always the same. NICS, a technology requiring sequencing of DNA that released into the culture medium from both TE and ICM, may offer a way out to these problems but has previously been shown to have limited efficacy. The present study reports the full protocol of NICS, which includes culture medium sampling methods, whole genome amplification (WGA) and library preparation, and NGS data analysis by analysis software. Considering the different cryopreservation times in different embryo laboratories, embryologists have two methods for collecting embryo culture medium that can be selected according to the actual conditions of the IVF laboratory.

The present study reports a protocol for chromosome screening of human embryos that uses spent culture medium, which avoids embryo biopsy and enables chromosome ploidy identification using NGS. The present article presents the detailed procedure, including the preparation of culture medium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) library preparation, and data analysis.

İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Tek Hücreli Dizileme için Gastrolama Fare Embriyosunun İzolasyonu ve Genotiplemesi

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Soya Özgü Mutant Embriyoları Analiz Etmek İçin Bir Boru Hattı

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Transcriptome Profil

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon

İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar