Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Swiss National Science (31003A_135278) à SST. MOP é o beneficiário de uma subvenção de doutorado do Fundo de Investigação AXA. Agradecemos Patricia Nigg para obter ajuda com o desenho da Figura 1.

Nota antes do início: Capa de Uso de fluxo laminar e biocontainment apropriado quando se trabalha com vírus vivo. Aqui, descrevemos as condições de crescimento adequadas para estirpe do vírus influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidade de infecção (MOI) de incubação e tempos podem variar dependendo da estirpe do vírus utilizado. 1. Preparação de biotinilada / WSN / 33 <ol><li> Semente de células para um balão T175 cm 2 utilizando Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby kindey canino (MDCK). As células de cultura a 37 ° C até cerca de 70% de confluência é atingido. </li><li> Antes de infecção, remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH7.0-7.3) pela adição de um grande volume suficiente para cobrir a monocamada de células. </li><li> Remover PBS e infectar as células com A / WSN / 33 com uma MOI de 10 -4. Dilui-se o vírus em PBS suplementado com 0,02 mg de Mg 2+, Ca 2+ de 0,01 mg &lt;/ sup&gt;, 0,3% de albumina de soro bovino (BSA), e 1% de Pen / Strep (infecção-PBS). Usar um inoculo de 4 ml para um balão T175 cm 2. </li><li> Incubar as células 1 h a 37 ° C. Remover por aspiração e inoculo de pipeta 10 ml de DMEM suplementado com 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES, e 1% de Pen / Strep para o balão. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante cerca de 3 dias até o efeito citopático (ECP) é visível, e depois da colheita sobrenadante. CPE pode ser reconhecido como arredondamento das células, seguido por descolamento e morte das células 14. </li><li> Rotação sobrenadante a 450 xg durante 5 min para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para um novo tubo falcon e repita este passo mais uma vez. Descartar as pelotas. </li><li> Sobrenadantes de transferência para tubos de ultracentrífuga e sobrenadantes underlay com 5 ml de sacarose a 30% diluído em tampão NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrar os tubos antes de ultracentrifugação e encher-se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Spin supernates em 112.398 xg (correspondente a 25.000 rpm durante um rotor SW28) durante 90 minutos em uma ultracentrífuga. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem e mergulhar pellet vírus durante a noite a 4 ° C em 250 mL PBS. Ressuspender pellet pipetando cima e para baixo. Medir o teor de proteína do vírus purificado pelo ensaio de Bradford 15. </li><li> Usar um kit de biotinilação para gerar biotinilado A / WSN / 33. Siga as instruções do fabricante. </li><li> Em breve, adicionar a quantidade apropriada de biotina para o vírus purificado e incubar durante 2 horas em gelo. Transferir vírus para um tubo de ultracentrífuga e o tubo de enchimento se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Gire vírus a 112.389 xg durante 90 min em uma ultracentrífuga. Remover o sobrenadante por pipetagem e adicionar 250 ul de PBS. Soak pelete durante a noite a 4 ° C. Alíquotas e armazenar o vírus biotinilado armazenado a -80 ° C altura em que será estável durante pelo menos 24 meses. NOTA: Pode ser útil para determinar o título do biotinilado preparação de IAV por ensaio de placa padrão. No entanto, deve notar-se que o protocolo subsequente só irá medir partículas de vírus biotinilados. Restante partículas não biotiniladas devido à biotinilação incompleta irá contribuir para o título infeccioso por ensaio de placas, mas não para o sinal medido no ensaio de fixação / internalização. </li></ol> 2. Determinar a quantidade necessária de Biotinilado Virus NOTA: Antes do ensaio de fixação / internalização é realizada, é importante para determinar a quantidade de vírus necessária para infectar biotinilado todas as células de uma amostra. <ol><li> Cultura e células A549 Trypsinize de acordo com as instruções do fabricante. Contar as células utilizando uma câmara de células. Pipeta células 200.000 A549 em FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 200 ul de PBS. Células arrefecer em gelo durante 10 min. </li><li> Prepare a 5 diluições em série do biotiestoque de vírus nylated em PBS-infecção. </li><li> Rotação tubos contendo as células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet com 100 ul contendo vírus infecção-PBS. Como o uso de controle de infecção simulada-PBS sem vírus biotinilado. Incubar os tubos em gelo durante 1 hr. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repita este passo mais uma vez. </li><li> Para a fixação, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de 3,7% de paraformaldeído (PFA). Incubar durante 10 min à TA. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4). </li><li> Para permeabilização, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS contendo 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min à temperatura ambiente. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4). </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 50 ul 2% BSA diluído em PBS contendo STV-Cy3. (Por favor, note que a concentração adequada de STV-Cy3 deve ser determinado antes do início do experimento Comece com uma concentração de 1:. 200 e teste de diluições de 2 vezes até 1:. 2400 Em nossas mãos, uma diluição de 1: 1000 provou para ser óptima.) </li><li> Incubar 1 hora no escuro à temperatura ambiente. Então, passo de lavagem de repetição descrito em 2.4, mas ressuspender o sedimento em 200 ul de BSA a 2% diluído em PBS. </li><li> Analisar amostras por citometria de fluxo 16. Porta na população Cy3 positivo. Escolha a concentração mais baixa de vírus biotinilado resultante do número máximo de células positivas Cy3 na população A549. </li></ol> 3. Determinar a quantidade necessária de Streptavidin NOTA: A eficiência de bloqueio o sinal obtido a partir do vírus extracelular determina o alcance de detecção do ensaio. Portanto, é importante para revogar o sinal STV-Cy3, tanto quanto possível. ºe quantidade necessária de STV necessário depende da quantidade de estoque de vírus biotinilado utilizado (determinado no ponto 2). <ol><li> Siga os passos 2,1-2,4, mas usar concentração de vírus determinado no ponto 2. </li><li> Preparar diluições em série de cinco vezes de STV diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1%. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 50 ul de diluição STV. Como o uso de controle simulado PBS contendo 2% de BSA e azida de sódio a 0,1%, sem STV. Incubar os tubos durante 30 min em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4. </li><li> Siga os passos 2,5-2,9. Para o ensaio de internalização, escolher a concentração mais baixa de STV resultando numa forte bloco do sinal de Cy3 (em comparação com a amostra na qual não estava presente STV). Para isso, a percentagem de células positivas com Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado. Idealmente, o sinal de Cy3 de amostras tratadas-STV deve ser o mais próximo do sinal de falsamente infectadascélulas possível. </li></ol> 4. Fixação / Interiorização Assay NOTA: Certifique-se de preparar todos os reagentes antes de iniciar o ensaio. Para os três grupos de controlo apresentados na seção de resultados (células infectadas simulados, células pré-tratadas neuraminidase e células azida de sódio tratados) pequenas alterações ao protocolo são obrigatórios. <ol><li> Preparar tubos de 16 poços profundos, cada um contendo 200.000 células A549. Ao lado do conjunto experimental que consiste em 4 tubos, há 3 condições de controle, cada um exigindo 4 tubos: células falsamente infectadas, neuraminidase (NA) -pretreated células e células tratadas com azida de sódio. Cada grupo é composto por 4 tubos rotulados como &#39;0 min&#39;, &#39;0 min + STV&#39;, &#39;30 minutos &#39;, &#39;30 min + STV&#39;. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 200 ul de DMEM contendo 0,3% de BSA, HEPES 20 mM e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de incubação). Incubar durante 30 min a 37 ° C. NOTA: Para o controlo de neuraminidase: Utilização neuraminidase bacteriana (por exemplo sialidase a partir de Vibrio cholera) a uma concentração de 200 mU / ml diluído em meio de incubação para ressuspender as células. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repetir este passo mais uma vez, em seguida, os tubos frescos para baixo sobre o gelo durante 10 min. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 100 ul biotinilados vírus (use a concentração de vírus determinado no ponto 2 diluída em infecção-PBS). Incubar 1 hora em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4. NOTA: Para o mock-infectados controle: Use infecção-PBS sem vírus. Para o controlo de azida de sódio: A utilização de vírus diluída em PBS-infecção suplementado com azida de sódio a 0,1%. </li><li> Prócessamento das amostras após a infecção em gelo: <ol><li> Para as amostras &#39;0&#39; mínimo, siga o passo 2.5 e armazenar amostras a 4 ° C até que as outras amostras são fixos. </li><li> Para a &#39;0 min + STV »amostras, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C. </li><li> Para as amostras &#39;30 min &#39;, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C. NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C. </li><li> Para o &#39;30 min + amostras STV &#39;girar tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Em seguida, os tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C. NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C. </li></ol></li><li> Siga os passos 2,6-2,8 e analisar amostras por citometria de fluxo. Determinar a percentagem de células positivas Cy3 em cada amostra. </li><li> Calcula-se a percentagem em anexo vírus e a quantidade relativa de vírus internalizado. <ol><li> Para calcular a quantidade de vírus anexado, use a percentagem de Cy3-positive células fechadas ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3. Para efeitos de comparação, não tratadas para definir células de 100% (Figura 4B). NOTA: O percentual do vírus ligado é descrita pela amostra &quot;0 minutos&quot;. </li><li> Para calcular a quantidade de vírus internalizado, levar a razão entre a &quot;30 min + STV&quot; amostra ao &quot;30 minutos&quot; de amostra (Figura 5B). NOTA: Como mencionado acima, a percentagem de células positivas fechado Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado. </li></ol></li></ol>

<ol>
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J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nosso protocolo descreve uma maneira fácil de medir fixação e interiorização do vírus por citometria de fluxo. Ele permite a utilização de vírus do tipo selvagem marcado que imita de perto mais infecções por vírus em comparação com a utilização de partículas do tipo vírus (VLP). Enquanto nosso protocolo foi optimizado para medir a fixação e internalização de IAV que pode ser facilmente adaptada para outros vírus. Além disso, como a citometria de fluxo é utilizada para leitura, co-colorações po...

A entrada do vírus influenza A (IAV) é um processo multi-etapas que começa com a ligação do vírus a receptores na membrana plasmática das células alvo 1. O receptor para IAV é ácido siálico que está presente em uma grande variedade de glicoproteínas e glicolípidos. A hemaglutinina (HA) de IAV proteína que está presente no envelope viral se liga ao ácido siálico e assim medeia a ligação das partículas virais na membrana plasmática das células alvo 2. O vírus entra nas células através de endocitose mediada por clatrina, mas também as vias de entrada alternativos, tais como macropinocitose, foram descritos 3-6. A interacção entre o HA e o ácido siálico parece ser suficiente para mediar os dois, a ligação e internalização de disparo de partículas virais 7. No entanto, os receptores de entrada alternativos foram propostos e seus papéis na entrada IAV estão sendo investigados 1,8,9. Curatualmente, são feitos esforços para identificar os fatores do hospedeiro que estão envolvidos no ciclo de vida viral com o objectivo de desenvolver terapias antivirais novos urgentemente necessários 10-12. A entrada do vírus seria um passo favorável para o direcionamento de crescimento IAV, a fim de bloquear a infecção viral em seu ponto mínimo. Medindo diferentes fases de entrada é um desafio IAV experimentalmente como geralmente grandes quantidades de vírus são necessárias para detectar o vírus de entrada. Além disso, a gama de detecção de mudanças na entrada do vírus é única linear devido à falta de replicação viral. Isso ressalta a necessidade de ensaios com alta sensibilidade. O ensaio apresentamos aqui permite a detecção de vírus ligados à superfície da célula, bem como a detecção de vírus internalizado em relação à quantidade total de vírus associados a células. A utilização de vírus de tipo selvagem biotinilado permite a medição conveniente através de coloração com a STV-Cy3 e leitura por citometria de fluxo. Vírus Biotinilado é frio-limite para celulars para permitir a ligação, mas impedir a internalização de partículas virais. As células podem ser fixadas, permeabilizadas e coradas com STV-Cy3 para medir vírus anexado. O sinal de viriões extracelulares, podem ser ligados revogada se um passo de bloqueamento é aplicada antes da fixação, em que as células são incubadas com estreptavidina não marcado (STV). Numa etapa seguinte, a seguir à fixação dos IAV biotinilado, a temperatura é deslocada para 37 ° C e internalização de partículas virais é permitido tomar lugar. Partículas internalizadas são protegidos de se ligar de STV permitindo assim a discriminação entre os vírus extra e intracelulares. Por condição experimental, são necessários quatro amostras: &#39;0 min&#39;: A primeira amostra, denominada &quot;0 min &#39;, é medir vírus do resfriado-bound na superfície da célula. &#39;+ 0 min STV&#39;: A segunda amostra, rotulado &#39;0 min + STV&#39;, dá a intensidade do sinal da linha de base do experimento. Vírus anexado é bloqueado sagacidadeh STV e o sinal após coloração com STV-Cy3 deve ser muito menor em comparação com a amostra &quot;0 minutos&quot;. Min &#39;30 &#39;: A terceira amostra, &#39;30 min&#39; contém em anexo e internalizado do vírus devido à mudança de temperatura para 37 ° C durante 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: A quarta amostra, &#39;30 min + STV&#39; medidas a fração intracelular do vírus. O passo de bloqueamento STV é aplicado após o período de incubação de 30 min. Como resultado, as partículas virais na superfície celular estão ligados por STV deixando somente vírus internalizados disponível para coloração com STV-Cy3. A quantidade relativa de vírus internalizado pode ser calculado como a razão entre vírus internalizado (medido na &#39;30 min + STV &#39;amostra) dividida pela quantidade total de vírus (descrito pela min &#39;30&#39; amostra). Como controlos sugerimos que incluem células não infectadas. O sinal seguinte STV-Cy3 coloração de células falsamente infectadas dá ao fundoresultante do protocolo de coloração. Um controlo para IAV fixação é o pré-tratamento das células com neuraminidase bacteriana (NA). NA cliva off ácido siálico de glicoproteínas celulares, removendo-se assim os receptores de ligação da superfície da célula. A azida de sódio (SA) é um potente inibidor metabólico e, desse modo bloqueia a endocitose 13. As células tratadas com azida de sódio deve ser positiva para a ligação do vírus, mas negativo para a internalização.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Um desenho que descreve as quatro condições experimentais diferentes é mostrada na Figura 1 Os resultados de uma experiência representativa são apresentados nas Figuras 2 -. 5. Na amostra &quot;0 minutos&quot;, vírus biotinilado é ligado a frio para células alvo que podem ser visualizadas através de coloração STV-Cy3 (Figuras 1 e 2). Quando um passo de bloqueio (no &quot;0 min + STV&quot; amo...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K visualizações.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Vídeo: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Estudos do Vírus Influenza A em um Modelo de Infecção de Camundongos

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.