Name: measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Swiss National Science (31003A_135278) à SST. MOP é o beneficiário de uma subvenção de doutorado do Fundo de Investigação AXA. Agradecemos Patricia Nigg para obter ajuda com o desenho da Figura 1.

Nota antes do início: Capa de Uso de fluxo laminar e biocontainment apropriado quando se trabalha com vírus vivo. Aqui, descrevemos as condições de crescimento adequadas para estirpe do vírus influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidade de infecção (MOI) de incubação e tempos podem variar dependendo da estirpe do vírus utilizado. 1. Preparação de biotinilada / WSN / 33 <ol><li> Semente de células para um balão T175 cm 2 utilizando Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby kindey canino (MDCK). As células de cultura a 37 ° C até cerca de 70% de confluência é atingido. </li><li> Antes de infecção, remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH7.0-7.3) pela adição de um grande volume suficiente para cobrir a monocamada de células. </li><li> Remover PBS e infectar as células com A / WSN / 33 com uma MOI de 10 -4. Dilui-se o vírus em PBS suplementado com 0,02 mg de Mg 2+, Ca 2+ de 0,01 mg &lt;/ sup&gt;, 0,3% de albumina de soro bovino (BSA), e 1% de Pen / Strep (infecção-PBS). Usar um inoculo de 4 ml para um balão T175 cm 2. </li><li> Incubar as células 1 h a 37 ° C. Remover por aspiração e inoculo de pipeta 10 ml de DMEM suplementado com 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES, e 1% de Pen / Strep para o balão. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante cerca de 3 dias até o efeito citopático (ECP) é visível, e depois da colheita sobrenadante. CPE pode ser reconhecido como arredondamento das células, seguido por descolamento e morte das células 14. </li><li> Rotação sobrenadante a 450 xg durante 5 min para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para um novo tubo falcon e repita este passo mais uma vez. Descartar as pelotas. </li><li> Sobrenadantes de transferência para tubos de ultracentrífuga e sobrenadantes underlay com 5 ml de sacarose a 30% diluído em tampão NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrar os tubos antes de ultracentrifugação e encher-se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Spin supernates em 112.398 xg (correspondente a 25.000 rpm durante um rotor SW28) durante 90 minutos em uma ultracentrífuga. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem e mergulhar pellet vírus durante a noite a 4 ° C em 250 mL PBS. Ressuspender pellet pipetando cima e para baixo. Medir o teor de proteína do vírus purificado pelo ensaio de Bradford 15. </li><li> Usar um kit de biotinilação para gerar biotinilado A / WSN / 33. Siga as instruções do fabricante. </li><li> Em breve, adicionar a quantidade apropriada de biotina para o vírus purificado e incubar durante 2 horas em gelo. Transferir vírus para um tubo de ultracentrífuga e o tubo de enchimento se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Gire vírus a 112.389 xg durante 90 min em uma ultracentrífuga. Remover o sobrenadante por pipetagem e adicionar 250 ul de PBS. Soak pelete durante a noite a 4 ° C. Alíquotas e armazenar o vírus biotinilado armazenado a -80 ° C altura em que será estável durante pelo menos 24 meses. NOTA: Pode ser útil para determinar o título do biotinilado preparação de IAV por ensaio de placa padrão. No entanto, deve notar-se que o protocolo subsequente só irá medir partículas de vírus biotinilados. Restante partículas não biotiniladas devido à biotinilação incompleta irá contribuir para o título infeccioso por ensaio de placas, mas não para o sinal medido no ensaio de fixação / internalização. </li></ol> 2. Determinar a quantidade necessária de Biotinilado Virus NOTA: Antes do ensaio de fixação / internalização é realizada, é importante para determinar a quantidade de vírus necessária para infectar biotinilado todas as células de uma amostra. <ol><li> Cultura e células A549 Trypsinize de acordo com as instruções do fabricante. Contar as células utilizando uma câmara de células. Pipeta células 200.000 A549 em FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 200 ul de PBS. Células arrefecer em gelo durante 10 min. </li><li> Prepare a 5 diluições em série do biotiestoque de vírus nylated em PBS-infecção. </li><li> Rotação tubos contendo as células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet com 100 ul contendo vírus infecção-PBS. Como o uso de controle de infecção simulada-PBS sem vírus biotinilado. Incubar os tubos em gelo durante 1 hr. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repita este passo mais uma vez. </li><li> Para a fixação, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de 3,7% de paraformaldeído (PFA). Incubar durante 10 min à TA. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4). </li><li> Para permeabilização, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS contendo 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min à temperatura ambiente. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4). </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 50 ul 2% BSA diluído em PBS contendo STV-Cy3. (Por favor, note que a concentração adequada de STV-Cy3 deve ser determinado antes do início do experimento Comece com uma concentração de 1:. 200 e teste de diluições de 2 vezes até 1:. 2400 Em nossas mãos, uma diluição de 1: 1000 provou para ser óptima.) </li><li> Incubar 1 hora no escuro à temperatura ambiente. Então, passo de lavagem de repetição descrito em 2.4, mas ressuspender o sedimento em 200 ul de BSA a 2% diluído em PBS. </li><li> Analisar amostras por citometria de fluxo 16. Porta na população Cy3 positivo. Escolha a concentração mais baixa de vírus biotinilado resultante do número máximo de células positivas Cy3 na população A549. </li></ol> 3. Determinar a quantidade necessária de Streptavidin NOTA: A eficiência de bloqueio o sinal obtido a partir do vírus extracelular determina o alcance de detecção do ensaio. Portanto, é importante para revogar o sinal STV-Cy3, tanto quanto possível. ºe quantidade necessária de STV necessário depende da quantidade de estoque de vírus biotinilado utilizado (determinado no ponto 2). <ol><li> Siga os passos 2,1-2,4, mas usar concentração de vírus determinado no ponto 2. </li><li> Preparar diluições em série de cinco vezes de STV diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1%. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 50 ul de diluição STV. Como o uso de controle simulado PBS contendo 2% de BSA e azida de sódio a 0,1%, sem STV. Incubar os tubos durante 30 min em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4. </li><li> Siga os passos 2,5-2,9. Para o ensaio de internalização, escolher a concentração mais baixa de STV resultando numa forte bloco do sinal de Cy3 (em comparação com a amostra na qual não estava presente STV). Para isso, a percentagem de células positivas com Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado. Idealmente, o sinal de Cy3 de amostras tratadas-STV deve ser o mais próximo do sinal de falsamente infectadascélulas possível. </li></ol> 4. Fixação / Interiorização Assay NOTA: Certifique-se de preparar todos os reagentes antes de iniciar o ensaio. Para os três grupos de controlo apresentados na seção de resultados (células infectadas simulados, células pré-tratadas neuraminidase e células azida de sódio tratados) pequenas alterações ao protocolo são obrigatórios. <ol><li> Preparar tubos de 16 poços profundos, cada um contendo 200.000 células A549. Ao lado do conjunto experimental que consiste em 4 tubos, há 3 condições de controle, cada um exigindo 4 tubos: células falsamente infectadas, neuraminidase (NA) -pretreated células e células tratadas com azida de sódio. Cada grupo é composto por 4 tubos rotulados como &#39;0 min&#39;, &#39;0 min + STV&#39;, &#39;30 minutos &#39;, &#39;30 min + STV&#39;. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 200 ul de DMEM contendo 0,3% de BSA, HEPES 20 mM e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de incubação). Incubar durante 30 min a 37 ° C. NOTA: Para o controlo de neuraminidase: Utilização neuraminidase bacteriana (por exemplo sialidase a partir de Vibrio cholera) a uma concentração de 200 mU / ml diluído em meio de incubação para ressuspender as células. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repetir este passo mais uma vez, em seguida, os tubos frescos para baixo sobre o gelo durante 10 min. </li><li> Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 100 ul biotinilados vírus (use a concentração de vírus determinado no ponto 2 diluída em infecção-PBS). Incubar 1 hora em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4. NOTA: Para o mock-infectados controle: Use infecção-PBS sem vírus. Para o controlo de azida de sódio: A utilização de vírus diluída em PBS-infecção suplementado com azida de sódio a 0,1%. </li><li> Prócessamento das amostras após a infecção em gelo: <ol><li> Para as amostras &#39;0&#39; mínimo, siga o passo 2.5 e armazenar amostras a 4 ° C até que as outras amostras são fixos. </li><li> Para a &#39;0 min + STV »amostras, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C. </li><li> Para as amostras &#39;30 min &#39;, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C. NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C. </li><li> Para o &#39;30 min + amostras STV &#39;girar tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Em seguida, os tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C. NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C. </li></ol></li><li> Siga os passos 2,6-2,8 e analisar amostras por citometria de fluxo. Determinar a percentagem de células positivas Cy3 em cada amostra. </li><li> Calcula-se a percentagem em anexo vírus e a quantidade relativa de vírus internalizado. <ol><li> Para calcular a quantidade de vírus anexado, use a percentagem de Cy3-positive células fechadas ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3. Para efeitos de comparação, não tratadas para definir células de 100% (Figura 4B). NOTA: O percentual do vírus ligado é descrita pela amostra &quot;0 minutos&quot;. </li><li> Para calcular a quantidade de vírus internalizado, levar a razão entre a &quot;30 min + STV&quot; amostra ao &quot;30 minutos&quot; de amostra (Figura 5B). NOTA: Como mencionado acima, a percentagem de células positivas fechado Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nosso protocolo descreve uma maneira fácil de medir fixação e interiorização do vírus por citometria de fluxo. Ele permite a utilização de vírus do tipo selvagem marcado que imita de perto mais infecções por vírus em comparação com a utilização de partículas do tipo vírus (VLP). Enquanto nosso protocolo foi optimizado para medir a fixação e internalização de IAV que pode ser facilmente adaptada para outros vírus. Além disso, como a citometria de fluxo é utilizada para leitura, co-colorações po...

A entrada do vírus influenza A (IAV) é um processo multi-etapas que começa com a ligação do vírus a receptores na membrana plasmática das células alvo 1. O receptor para IAV é ácido siálico que está presente em uma grande variedade de glicoproteínas e glicolípidos. A hemaglutinina (HA) de IAV proteína que está presente no envelope viral se liga ao ácido siálico e assim medeia a ligação das partículas virais na membrana plasmática das células alvo 2. O vírus entra nas células através de endocitose mediada por clatrina, mas também as vias de entrada alternativos, tais como macropinocitose, foram descritos 3-6. A interacção entre o HA e o ácido siálico parece ser suficiente para mediar os dois, a ligação e internalização de disparo de partículas virais 7. No entanto, os receptores de entrada alternativos foram propostos e seus papéis na entrada IAV estão sendo investigados 1,8,9. Curatualmente, são feitos esforços para identificar os fatores do hospedeiro que estão envolvidos no ciclo de vida viral com o objectivo de desenvolver terapias antivirais novos urgentemente necessários 10-12. A entrada do vírus seria um passo favorável para o direcionamento de crescimento IAV, a fim de bloquear a infecção viral em seu ponto mínimo. Medindo diferentes fases de entrada é um desafio IAV experimentalmente como geralmente grandes quantidades de vírus são necessárias para detectar o vírus de entrada. Além disso, a gama de detecção de mudanças na entrada do vírus é única linear devido à falta de replicação viral. Isso ressalta a necessidade de ensaios com alta sensibilidade. O ensaio apresentamos aqui permite a detecção de vírus ligados à superfície da célula, bem como a detecção de vírus internalizado em relação à quantidade total de vírus associados a células. A utilização de vírus de tipo selvagem biotinilado permite a medição conveniente através de coloração com a STV-Cy3 e leitura por citometria de fluxo. Vírus Biotinilado é frio-limite para celulars para permitir a ligação, mas impedir a internalização de partículas virais. As células podem ser fixadas, permeabilizadas e coradas com STV-Cy3 para medir vírus anexado. O sinal de viriões extracelulares, podem ser ligados revogada se um passo de bloqueamento é aplicada antes da fixação, em que as células são incubadas com estreptavidina não marcado (STV). Numa etapa seguinte, a seguir à fixação dos IAV biotinilado, a temperatura é deslocada para 37 ° C e internalização de partículas virais é permitido tomar lugar. Partículas internalizadas são protegidos de se ligar de STV permitindo assim a discriminação entre os vírus extra e intracelulares. Por condição experimental, são necessários quatro amostras: &#39;0 min&#39;: A primeira amostra, denominada &quot;0 min &#39;, é medir vírus do resfriado-bound na superfície da célula. &#39;+ 0 min STV&#39;: A segunda amostra, rotulado &#39;0 min + STV&#39;, dá a intensidade do sinal da linha de base do experimento. Vírus anexado é bloqueado sagacidadeh STV e o sinal após coloração com STV-Cy3 deve ser muito menor em comparação com a amostra &quot;0 minutos&quot;. Min &#39;30 &#39;: A terceira amostra, &#39;30 min&#39; contém em anexo e internalizado do vírus devido à mudança de temperatura para 37 ° C durante 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: A quarta amostra, &#39;30 min + STV&#39; medidas a fração intracelular do vírus. O passo de bloqueamento STV é aplicado após o período de incubação de 30 min. Como resultado, as partículas virais na superfície celular estão ligados por STV deixando somente vírus internalizados disponível para coloração com STV-Cy3. A quantidade relativa de vírus internalizado pode ser calculado como a razão entre vírus internalizado (medido na &#39;30 min + STV &#39;amostra) dividida pela quantidade total de vírus (descrito pela min &#39;30&#39; amostra). Como controlos sugerimos que incluem células não infectadas. O sinal seguinte STV-Cy3 coloração de células falsamente infectadas dá ao fundoresultante do protocolo de coloração. Um controlo para IAV fixação é o pré-tratamento das células com neuraminidase bacteriana (NA). NA cliva off ácido siálico de glicoproteínas celulares, removendo-se assim os receptores de ligação da superfície da célula. A azida de sódio (SA) é um potente inibidor metabólico e, desse modo bloqueia a endocitose 13. As células tratadas com azida de sódio deve ser positiva para a ligação do vírus, mas negativo para a internalização.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Um desenho que descreve as quatro condições experimentais diferentes é mostrada na Figura 1 Os resultados de uma experiência representativa são apresentados nas Figuras 2 -. 5. Na amostra &quot;0 minutos&quot;, vírus biotinilado é ligado a frio para células alvo que podem ser visualizadas através de coloração STV-Cy3 (Figuras 1 e 2). Quando um passo de bloqueio (no &quot;0 min + STV&quot; amo...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K visualizações.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologia

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Monitorando a sobrevivência do vírus da influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

Medindo a ativação de funções efetoras mediadas por Fc por anticorpos HA

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Detecção de aderência bacteriana às células hospedeiras usando imagens de fluorescência

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...