Este trabalho é apoiado pelo Projeto KAIST-financiado K-Vale VERMELHO &amp; B para 2014 eo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional da Coreia Research (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Atenção: Consulte as folhas de dados de segurança de materiais (MSDS) antes do uso de acetona e clorofórmio que são cancerígenos. 1. Preparação de Phospholipid Monolayer a uma água-Air Interface Plano <ol><li> Formação de uma monocamada de fosfolípidos <ol><li> Preparação de uma solução de fosfolípido <ol><li> Limpe um frasco de 4 ml com uma tampa revestida de politetrafluoretileno utilizando acetona, etanol e água deionizada, pelo menos, três vezes, e soprar azoto gasoso cuidadosamente para dentro do frasco para se livrar de água. </li><li> Dissolve-se 1 mg de fosfolípido (por exemplo, dioleoilfosfatidilcolina, DOPC) e 1 ml de clorofórmio no frasco para obter 1 mg / ml de concentração. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. Use concentrações mais baixas ou mais altas de solução de fosfolípido, se necessário. </li><li> Adicionar corante etiquetado fosfolípidos (por exemplo, rodamina dipalmitoilfosfatidiletanolamina, DPPE Rodamina) com menos de 1 mol% de fosfolípido de Solução, a fim de visualizar a monocamada de fosfolípido com um microscópio de fluorescência. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. </li><li> Envolver o frasco com uma fita de politetrafluoretileno para evitar a evaporação do solvente, e armazenar a amostra num congelador a -20 ° C. </li></ol></li><li> Deposição de fosfolipídios na interface ar-água <ol><li> Limpar uma placa de Petri (55 mm de diâmetro e 12 mm de altura) com etanol, e água desionizada, pelo menos, três vezes. </li><li> Encher a placa de Petri com 10 ml de água desionizada para criar uma interface ar-água. </li><li> Espalhe alguns microlitros da solução de fosfolípido com uma micro-seringa para uma interface limpa para atingir a pressão de superfície desejada e espere durante pelo menos 30 minutos para evaporar o solvente completamente, antes de fazer a experiência. Nota: Uma calha de Langmuir pode ser utilizado em vez de uma placa de Petri, se é necessário um controlo preciso da pressão de superfície. </li></ol></li></ol></li><li> Sumedição de pressão rface <ol><li> Medir a pressão superficial da monocamada de fosfolípido com uma placa de Wilhelmy tensiómetro. Espera durante pelo menos 30 minutos para obter o papel de filtro humedecido suficiente se o papel de filtro é usado como uma placa de Wilhelmy. O protocolo detalhado está disponível em Kuhn et al. 20. </li><li> Ajustar a quantidade depositada do fosfolípido para controlar a pressão de superfície precisamente. Adicionar 4 ml da solução de DOPC (1 mg / ml) para a 30.25 cm 2 -Área da interface se ~ 5 mN / m de superfície de pressão é necessário. Nota: Se o papel de filtro não é completamente molhado, a pressão de superfície muda dramaticamente durante os primeiros 30 minutos da experiência, devido à mudança de peso do papel de filtro. </li></ol></li><li> Minimização do fluxo convectivo da monocamada <ol><li> Usar um aparelho em forma de cone que contém um reservatório de 3 mm com dois canais finos, ligado a uma grande parte da placa de Petri, para suprimir o fluxo convectivo dea monocamada, que pode perturbar o imaging morfologia e medição de pressão de superfície. </li><li> Certifique-se de combinar os níveis de água entre o interior eo exterior do aparelho de cone-forma para garantir que fosfolipídios circular livremente em toda a região antes de depositar fosfolipídios na interface ar-água. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Fosf monocamada na superfície curva de uma gotícula <ol><li> Processo afinando de um capilar de vidro usando micropipeta extrator <ol><li> Coloque um capilar de vidro (1 mm OD, ID de 0,78 mm, comprimento 100 mm) sobre um suporte de capilar de um puxador de micropipeta. </li><li> Projetar um programa para puxar os capilares com os valores dos parâmetros apropriados (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 e de pressão 200) e puxe os capilares com o programa projetado de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: Um capilar acabar com alguns micrômetros de diâmetro é necessário para formar uma gota de 100 um-por Applying com uma pressão de 10 kPa ~. Se a extremidade da ponta do capilar é muito pequena, muito mais elevada pressão,&gt; 600 kPa, é necessário para obter a gota, ao mesmo tempo que é difícil controlar o tamanho das gotículas com uma muito grande extremidade da ponta capilar. </li></ol></li><li> Absorção de fosfolípidos na superfície da gotícula Nota: Para formar uma monocamada de fosfolípidos na interface curvo de uma gota, uma solução de fosfolípido, sem corante fosfolípidos com etiquetas é usado para se obter um contraste de intensidade, contra a monocamada plana, preparada por procedimento 1. Além disso, ambos os processos 2.2.1 e 2.2 .2 são permitidas aqui. Se é necessário um controlo preciso da pressão de superfície à superfície da gotícula, 2.2.2 procedimento é altamente recomendável. No entanto, se não, o procedimento 2.2.1, que é uma forma muito mais fácil do que o procedimento 2.2.2, é útil. <ol><li> Processo de fosfolípidos revestimento a uma extremidade da ponta <ol><li> Limpe a lâmina de vidro usando acetona, etanol e água deionizada, pelo menos, três vezes. </li><li> Place o capilar cônico em uma lâmina de vidro limpa, e incline o capilar para facilitar a tocar a lâmina de vidro com uma extremidade de ponta. </li><li> Deixar cair algumas gotas de solução de fosfolípido (1 mg / ml) para a extremidade de ponta de um capilar que é aderida à lâmina de vidro usando uma seringa de vidro, e esperar, pelo menos, 30 minutos para evaporar o solvente completamente. Nota: É altamente recomendável para aderir a extremidade da ponta do capilar para a lâmina de vidro durante o processo 2.2.1.3 porque o perímetro da extremidade da ponta é demasiado pequeno para conter a gota dos fosfolípidos na extremidade da ponta apenas por força de capilaridade. </li></ol></li><li> Preparação de uma solução de vesículas <ol><li> Limpe um frasco, e remover a água do frasco, tal como foi introduzido no processo 1.1.1.1. </li><li> Seca-se num volume de 2 ml de solução de fosfolípido (1 mg / ml) através da aplicação de gás de azoto suavemente, e desidratar o frasco durante 1 h à TA para eliminar qualquer solvente remanescente. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. </li><li> Adicionar 2ml de água desionizada num frasco para injectáveis ​​contendo lípidos secos, e incuba-se o frasco num forno a 60 ° C durante 1 h. </li><li> Agitar o frasco várias vezes, e sonicate (HF-frequência: até 40 kHz, potência: 370 W) por 30 min para obter vesículas. </li><li> Executar processos de extrusão e de congelamento e descongelamento para obter vesículas unilamelares monodispersas. O protocolo detalhado para a preparação de vesículas é descrito em Mayer et al. 21. Nota: pressão de superfície da interface de gotículas é controlado com precisão ajustando-se o tempo de espera após a formação da gotícula que contém vesículas unilamelares monodispersas. Usando um método de gota pendente 22, é necessário medir a variação de pressão de superfície em função do tempo, antes de fazer a experiência. </li></ol></li></ol></li><li> Formação de uma gota que contém uma monocamada de fosfolípidos na superfície curva <ol><li> Preencha o capilar afilado com 10 ml de água deionizada de Procedure 2.2.1. Em alternativa, utilizar 10 ml da solução de vesículas a partir de procedimento 2.2.2. </li><li> Ligue o capilar para um micro-injector automatizado para proporcionar a pressão para formar a gota. </li><li> Montar o capilar que está ligado a um micro-injector a um micromanipulador para controlar a posição do capilar precisamente. </li><li> Prepare um microscópio de campo brilhante (Microscópio 1, lente objetiva: 10X NA 0,3) para geração de imagens a vista lateral do capilar com uma câmera CCD. Microscópio 1 permite, assim, para observar a posição precisa da gotícula ao longo do eixo z e estimar o tamanho da gotícula. </li><li> Mover a extremidade da ponta para uma posição onde a vista lateral da extremidade da ponta é bem visualizado por microscópio 1 utilizando um micromanipulador, e aplicar uma pressão variável (~ 100 hPa) com a extremidade da ponta do capilar, até um tamanho apropriado (~ 100 um de diâmetro) de gotícula é formado. Nota: Recomenda-se que micro-injector e micromanipulador automatizada ser usod, se é necessário um bom controle do tamanho das gotas e localização da gota. Também é possível utilizar os manuais. </li></ol></li></ol> 3. imagens de fluorescência de Recuperação Após a fusão da gota Nota: Os princípios fundamentais deste protocolo são idênticos aos da técnica FRAP, excepto para o processo de coalescência gota. O Protocolo e afins teorias detalhadas de FRAP estão disponíveis em A. Lopez et al. 15 e D. Axelrod et al. 16. <ol><li> Monitorizar e controlar a localização da gotícula <ol><li> Preparar um microscópio invertido definido (Microscópio 2, lente objectiva: 10X NA 0,3, lente do tubo: distância focal 17 de cm) que permite tanto um microscópio de fluorescência com um conjunto de filtro adequado para Rodamina-DPPEs (excitação a 560 nm, emissão a 583 nm) e um microscópio de campo brilhante. Use uma câmera CCD aqui para visualizar os melhores vistas da gotícula com um microscópio de fluorescência mode e um modo de microscópio de campo brilhante. </li><li> Mover a gota revestido com um fosfolípido para uma interface ar-água plana ao longo do eixo Z, mas não se fundem a gota, no entanto, utilizando o micromanipulador. Use Microscópio 1 para visualizar a vista lateral da gota. </li><li> Localizar a gota no centro da vista de topo da monocamada plana, utilizando o micromanipulador. Use o modo de microscópio de campo brilhante de Microscópio 2 para visualizar visão de cima de monocamada plana. </li></ol></li><li> Mesclando a gota na interface ar-água plana <ol><li> Mover a gota ainda mais para a interface plana até que a gota se funde na interface, utilizando o micromanipulador. Se o processo de fusão é feita com sucesso, uma região escura com uma forma circular, que está rodeado por um fundo branco, observa-se fluorescência utilizando o modo de microscópio 2. </li><li> Gravar a série de imagens fluorescentes de acordo com o tempo após a fusão a gota, utilizando o modo de fluorescência de micros2. Use enfrentar uma taxa de quadros mais rápido do que a escala de tempo de difusão da monocamada aqui. Em DOPC monocamada, que leva alguns minutos para difundir para a área escura 200 um completamente. </li></ol></li></ol> 4. Determinar o coeficiente de difusão por Análise de Imagem Nota: Para determinar o coeficiente de difusão a partir de uma série de imagens, programa personalizado para análise de imagem é construído como descrito abaixo. Um código fonte detalhada deste programa está disponível no site Jove. <ol><li> A detecção de uma região circular de interesse <ol><li> Detecção do centro da região de interesse <ol><li> Obter uma série de imagens fluorescentes que foram gravados durante um processo de recuperação que contém uma área circular escuro e um fundo branco, e definir a primeira imagem da série como uma imagem de referência. Aqui, R D é o raio da área escura de uma imagem de referência em. </li><li> Convolute a imagem de referência com um círculo branco queSE intensidade é uniforme ao longo de toda uma região. Use função incorporada com o nome &#39;conv2&#39; para convolution como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 124. Aqui, o raio do círculo branco é ligeiramente menor do que R D. </li><li> Encontrar uma posição que indica um valor mínimo no cálculo de convolução, e definir esta posição como o centro da região de interesse na imagem de referência. </li></ol></li><li> Determinação de um raio da região de interesse <ol><li> Convolute a imagem de referência com um círculo branco que contém uma posição central, determinada por um procedimento de 4,1 e intensidade uniforme ao longo de toda uma região. Aqui, R S é o raio do círculo branco. Use iteração como &#39;para&#39; ou &#39;enquanto&#39; com a equação de um círculo para fazer o círculo branco, como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 102-109. </li><li> Convolute a imagem de referência com outro círculo branco que tem um poucoraio maior (5% -10%), L R, a R S. Usar o mesmo método com o procedimento 4.1.2.1 para fazer o círculo como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 113-120. </li><li> Obter a diferença de valor entre os dois cálculos convolução de 4.1.2.1 e 4.1.2.2. </li><li> Repita os procedimentos acima de R S R = D / 2 a R S = 2R D, aumentando ambos os R e R S L com um nível de pixel. Faça uma iteração que contém códigos de origem de todo procedimento 4.1.2.1 a 4.1.2.3 para repetir. </li><li> Encontre o raio de R S que indica a máxima diferença de valor entre os dois cálculos convolução. Use função incorporada denominada &#39;max&#39; para encontrar o raio indica a máxima diferença de valor, como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 148 a 149. Isso R S indica, assim, o raio da área escura na imagem de referência. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Cálculo de uma intensidade fraccionada <ol><li> Definir um círculo que contém uma posição central e um raio, determinado pelo procedimento 4.1 como uma região de interesse. </li><li> Calcular as intensidades médias da região de interesse em uma série de imagens de fluorescência em função do tempo. Convolute cada quadro com a região de interesse e dividi-lo pela área da região de interesse para calcular a intensidade média. Os detalhes estão disponíveis no código-fonte do programa personalizado que está disponível no site Jove. </li><li> Calcular uma intensidade fraccionada, definida como a equação abaixo, em que F (t) é a intensidade média do círculo que é uma região de interesse de acordo com o tempo, F I é a intensidade inicial no círculo, e Fo é a intensidade de um fundo branco. F (t) = (F (t) - M I) / (F O - F i) (Equação 1). </li></ol></li><li> Montagem da fintensidade ractional a teoria FRAP <ol><li> Montar a intensidade fracionária com a equação abaixo, onde τ é um tempo de difusão característica e eu 0, I 1 são funções de Bessel modificadas, utilizando um programa de ajuste, e obter τ <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Equação 2). </li><li> Obter um coeficiente de difusão a partir da relação, um τ = 2/4 D, em que D é o coeficiente de difusão e a é o raio da área escura. Nota: Durante o processo de ajuste, é possível mudar o perfil de intensidade fraccionada ao longo de um eixo de tempo, quando o processo de recuperação já começou, antes de gravar as imagens. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interest.

Fram partilha uma grande quantidade de princípios fundamentais com FRAP, especialmente para medir a recuperação de fluorescência após branqueamento de uma área específica, mas FRAM utiliza um processo de fusão de uma gota sobre a interface plana para formar uma área branqueados, em vez de aplicar uma luz intensa. O processo de fusão é, portanto, passo mais importante no FRAM e, especialmente, a forma da mancha escura na monocamada plana após a fusão uma gota determina a precisão da medição diffusivity. Especificamente, com base num método de corrente, só definir o círculo com um raio R tal como uma região de interesse para calcular a intensidade média da mancha escura, mostrado no Procedimento 4, e se houver um excesso desvio da forma circular, esta iria perturbar a medição precisa de um coeficiente de difusão. Portanto, é necessário para obter uma forma circular região escura, mas, formatos não circulares são formados por vezes, devido a várias razões. Em primeiro lugar, se existe um fluxo convectivo na Petprato RI, a forma da área escura se torna alongada ao longo da direcção do fluxo. Como mencionado no procedimento 1.3, um aparelho de cone em forma de ajuda a suprimir o fluxo convectivo, e este alongamento seria minimizado. Em segundo lugar, se a extremidade da ponta do capilar toca a interface plana durante um processo de fusão, a área escura é formado com uma variedade de formas, desde o final capilar interrompe o processo de fusão. Através da obtenção de uma gota que só é pendurado a partir do fim do capilar, esta interrupção pode ser evitada. Em particular, um tratamento hidrofóbico do capilar ajuda a gota a sentar-se no final do capilar. Portanto, tiroteios problemas acima e modificações nos permitirá medir propriedades de difusão mais precisamente. Este processo também permite que solucionou assim FRAM ter várias vantagens significativas sobre FRAP. Em primeiro lugar, FRAM requer equipamento mais simples em comparação com FRAP. Para FRAM, é suficiente utilizar um simples micros fluorescênciaface, em vez de um microscópio confocal de laser caro, com um elevado poder de cujo comprimento de onda deve coincidir com o espectro de absorção do corante. Além disso, é necessária a utilização de material adicional para ajustar o tamanho da área branqueada na FRAP, enquanto o FRAM controla o tamanho da área facilmente ajustando o tamanho da gotícula, ou a pressão superficial na superfície da gotícula. Em segundo lugar, é possível utilizar espécies diferentes de corantes em FRAM. FRAP utiliza apenas moléculas de corante cujo processo de branqueamento é muito mais rápido do que o processo de difusão. Se a difusão dos corantes ocorre durante o processo de branqueamento, é difícil estimar com precisão a propriedade de difusão. Fram, no entanto, não necessita de um processo para o branqueamento de corantes e isto permite assim a utilização de vários tipos de tintas na imagem de fluorescência. Além disso, o FRAP requer lasers de alta potência e conjuntos de filtros adicionais para alterar as espécies de corante, embora seja apenas necessária para substituir os conjuntos de filtros no fram. Finalmente, Uma vez que as monocamadas na superfície das gotículas e a interface plana pode ser formada de forma independente, permitindo assim o estudo das diferenças inter-difusão ou de mistura entre duas monocamadas de lípidos diferentes por fusão de tipo A monocamada de tipo B em monocamada, enquanto o FRAP mede apenas o autodifusão de uma monocamada. Apesar dessas vantagens, o processo de fusão uma gota em uma interface ar-água plano pode potencialmente limitar esta técnica devido a vários problemas que podem ser motivo de preocupação, como uma incompatibilidade de pressão à superfície entre as duas monocamadas, a escala de tempo do processo de fusão , e um aumento da pressão superficial da monocamada de gotículas plana após a fusão. Estes problemas, no entanto, não afectam de forma significativa a medição de difusão pelas seguintes razões. Primeiro, embora as pressões de superfície nas duas monocamadas diferentes são bastante diferentes, um processo de equilíbrio é completada numa fase muito cedo durante o processo de recuperação. Por exemplo, se Tque a superfície de pressão da monocamada na superfície da gota que é superior ao da monocamada na interface ar-água plana, a área escura expande até que a pressão se equilibra superfície. Uma vez que este processo é completado dentro de 10 ms, a pressão de superfície irá ser equilibrada antes que afecta significativamente o processo de difusão. Em segundo lugar, se o intervalo de tempo do processo de fusão é suficientemente rápido, que não limita a difusão de medição em tudo. Felizmente, um processo de fusão típica também está concluída dentro de 10 ms. Finalmente, mesmo fusão de várias das gotículas para a interface plana não aumentar a pressão à superfície uma vez que a área da superfície da calha é muito maior do que a área de superfície da gotícula. De acordo com os tamanhos de cocho e as gotículas, descrito no protocolo, a área por molécula aumenta menos do que 0,015%, mesclando uma gota. Por conseguinte, o aumento da pressão superficial, devido à alteração da área por molécula é inferior a 0,1%, que é negligible porque é muito menor do que o erro típica na pressão de superfície, tal como medido pela placa de Wilhelmy tensiómetro. Em resumo, nós introduzimos um novo método para medir a propriedade difusão lateral de uma monocamada de fosfolípido, mesclando uma monocamada gota para a interface plana. Esta técnica exige um equipamento relativamente simples e também permite o uso de vários tipos de espécies de corante. Fram é, portanto, potencialmente aplicáveis ​​para a medição da difusão de quaisquer agentes tensio-activos, incluindo os fosfolípidos, copolímeros de bloco, proteínas e até nanopartículas numa interface fluido-fluido. Além disso, espera-se que o FRAM fornece um novo modo para estudar a inter-difusão ou de mistura entre dois agentes tensio-activos diferentes.

<html> Os fosfolípidos são os principais componentes das membranas celulares e as membranas de organelos, e a fluidez destas camadas de membrana frequentemente afecta as funções celulares através da alteração da actividade de proteínas de membrana 1 - 3. Por exemplo, a membrana &#160; homeostase de lípidos é conseguido através do controlo da fluidez da membrana, que é detectada por proteínas de membrana, e um nível anormal de fluidez provoca doenças graves, tais como colestase e esteatose hepática 4. Além disso, a fluidez de uma monocamada de fosfolípidos na interface fluido-ar alvéolos tem implicações importantes em suas funções. Alta fluidez da monocamada de surfactante pulmonar phospholipid facilita a propagação da camada durante a inalação, ao passo que uma fluidez baixo permite que a camada para permanecer dentro dos alvéolos durante a expiração 5,6. Assim, é importante para estimar a fluidez das camadas de fosfolipídios para entender seus papéis. _content &quot;&gt; uma medida directa da fluidez é a viscosidade, e a viscosidade das camadas de fosfolípidos foi medido por meio de colóides de tamanho micron-7, 8,9, magnéticos agulhas e micro-6,10,11 botões magnéticos. No entanto, estas técnicas estão limitados a películas relativamente rígidos, e não se pode medir filmes menos viscosos. Para tais casos, difusividade seria uma alternativa para quantificar a fluidez das camadas de fosfolípidos. Durante várias décadas, uma variedade de técnicas para medir as propriedades de difusão de camadas de fosfolípidos têm sido desenvolvidos, tais como fluorescência método de têmpera 12, gradiente de campo pulsado 13 RMN e espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) Um dos métodos mais representativas 14. é a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) 15,16. Devido à simplicidade do processo de medição e relacionada teorias, vários estudos sobre as propriedades de difusão de camadas de fosfolípidos foram realizadas utilizando FRAP <sup&gt; 17 - 19. No entanto, FRAP geralmente requer uma configuração de microscópio confocal caro, com um laser de alta potência. Aqui, nós apresentamos uma nova técnica para medir a difusão lateral de monocamadas de fosfolipídios, denominado como recuperação de fluorescência após a fusão (FRAM). A principal diferença entre FRAP e FRAM é que o passo fotodegradação passa a ter a coalescência gota. Juntar uma gota coberto por não-fluorescência monocamada numa monocamada plano marcado por fluorescência deixa uma mancha escura circular em uma monocamada plano brilhante, estabelecendo assim o mesmo estado inicial com o passo fotodegradação. Nós, então, observar a recuperação de fluorescência na mancha escura com o tempo para medir a difusividade lateral. Este novo &quot;branqueamento&quot; passo a coalescência gota fornece vantagens significativas em relação FRAP: Fram requer apenas um microscópio de fluorescência, em vez de um microscópio confocal caros com um laser de alta potência, que é necessário para FRAP. Eun disso, FRAM tem uma vasta selecção de corantes fluorescentes, uma vez que não envolve o processo de fotodegradação. Finalmente, as duas monocamadas diferentes, uma monocamada de gotículas e uma monocamada plana, pode ser preparado de forma independente, permitindo assim que a interdifusão a ser medido, enquanto FRAP só mede a autodifusão de monocamadas. FRAM fornece uma ampla gama de medidas de difusão de materiais de elevada viscosidade para materiais quase invíscidos. Em princípio, FRAM pode medir a difusividade máximo de 10 6 uM 2 / seg, que é comparável com as técnicas existentes, quando a difusão ocorre através da área de 100 um até 100 um, durante o tempo para o processo de coalescência gota (~ 10 ms). Além disso, o processo de difusão lenta pode ser facilmente medido a menos monocamadas são sólidos. Fram pode ser usado para quaisquer tipos de materiais tensio-activos, desde que as moléculas marcadas por fluorescência adequados estão disponíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Uma série de imagens de fluorescência foram obtidas com o tempo durante o processo de recuperação após a fusão de uma gotícula revestida com uma monocamada de DOPC sobre uma monocamada de DOPC plana, conforme indicado na Figura 1. A monocamada DOPC na interface ar-água plana foi dopado com pequenas quantidades de Rodamina-DPPE, e, assim, este tornou possível a visualização de um fundo com uma cor brilhante e uma região escura recentemente adicionado à interface plana. Há, um processo de recuperação foi observada a 23 mN / m de superfície de pressão fixa. Um ajuste da equação 1 para a mudança de intensidade fraccionada de acordo com o tempo é mostrada na Figura 2. O valor de R2 de este ajuste é 0.999, e este ajuste ainda funciona bem, mesmo a pressões de superfície elevadas ou mais baixas. O coeficiente de difusão da monocamada DOPC obtido a partir deste ajuste foi 27,54? M 2 / s a 23 mN / m de superfície de pressão. Para mais validação da FRAM, coeficientes de difusão da DOPC e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) as monocamadas foram medidos de acordo com a pressão de superfície. Como mostrado na Figura 3, FRAM capta a rápida diminuição do coeficiente de difusão da monocamada de DPPC em ~ 9 mN / m de pressão de superfície, onde LC (líquido condensado) - LE (líquido expandido) de transição de fase ocorre 10, e os valores de coeficientes de difusão são também concordaram bem com as medidas anteriormente por Peters et al. 19. Além disso, um decaimento exponencial do coeficiente de difusão com a pressão de superfície foi observada em monocamada DOPC, e esta tendência é quase idêntico àquele medido por Caruso et al. 12. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Ilustração esquemática da FRAM (recuperação de fluorescência após a fusão) técnica. Como o lábioID de monocamada gota revestida é mesclado a interface ar-água plana, a monocamada lipídica sem fluorescência marcado lipídica é inserido no plano monocamada lipídica fluorescente. (Imagens B) microscópio de fluorescência com o tempo durante o processo de recuperação de uma monocamada de DOPC a 23 mN / m de superfície de pressão (escala bar = 100 pm). A região escura da monocamada DOPC está totalmente recuperado pelo processo de difusão dentro de alguns minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Figura 2. Fracção de intensidade versus tempo. Círculos pretos e a linha pontilhada cinza indicam os valores das intensidades fracionários obtidos a partir de análise de imagem (procedimentos 4.1 e 4.2) e o ajuste da equação 1 para as intensidades fracionários com o tempo,mostrado no procedimento 4.3, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> Figura 3. Os coeficientes de difusão de DOPC (triângulo) e DPPC (quadrado vazio) monocamadas em função da pressão à superfície. As linhas com a cor cinzento claro e com a cor cinzento escuro indicam os valores do coeficiente de difusão anteriormente relatado por Peters et ai. e Caruso et al., respectivamente. Este valor foi modificado a partir Jeong et al. 23. Reproduzido com permissão de Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Direitos de autor 2014 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique dela</a>e para ver uma versão maior desta figura.

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...