Agradecemos a Daniel Veit de assistência técnica e Pedro Gouveia no Electricidade em Pó (electricidadeempo.net) para customizar o software de rastreamento para nossas demandas. Agradecemos também a Tom Retzke para apoio durante o processo de filmagem. Este estudo foi apoiado pela Sociedade Max Planck.

As técnicas de construção e detalhes de Flywalk foram descritos em outro 26 (no caso de eventuais problemas de estabelecer esta configuração, mais informações podem ser obtidas a partir de MK). Aqui vamos nos concentrar em obter instruções detalhadas sobre o manuseio do paradigma que vai ajudar a obter resultados confiáveis. 1. Fly Manuseamento <ol><li> Voa traseira em baixa a média densidade culturas em meio de comida 27 horas sob uma luz 12: 12 horas: regime escuro a 23-25 ​​° C e 70% de umidade relativa. Para este fim, permitir 20-30 adulto recém-surgido voa para reproduzir em um grande frasco de comida para uma semana, em seguida, descartar moscas adultas e esperar por descendentes a surgir. </li><li> Recolha 30-40 recém-emergidas (idade &lt;24 horas) moscas adultas e idade-los em no novo um frasco contendo meio alimentar 27 para 3-5 dias. </li><li> Vinte e quatro horas antes do início do experimento comportamental: Transferir todos 30-40 previamente coletadas 3-5 d de idade (ver 2.2) voa para uma nova vial contendo um tampão de espuma de borracha úmida ou um lenço de papel úmido usando um aspirador. NOTA: Não anestesiar moscas usando CO 2. </li></ol> 2. Preparação do Setup Flywalk <ol><li> Use 250 ml garrafas como umidificadores. Encha humidificadores com 100 ml de água destilada. </li><li> Prepare frascos de odor. <ol><li> Preparar 500 ul 10 -3 diluições dos odores puros de acetato de etilo, butirato de etilo, acetato de isopentilo e 2,3-butanodiona em óleo mineral solvente. </li><li> Anexar duas válvulas de retenção bola por odor frasco. Note que o check válvulas permitem unidirecional única fluxo de ar. Por conseguinte, conectar válvulas de retenção de tal forma que o ar possa entrar no frasco de um lado e deixá-la no outro lado. </li><li> Remover a tampa de um tubo de reacção de PCR de 200 uL. Pipetar 100 ul de cada diluição de odor num tubo de reacção separado e coloque os tubos em frascos separados de odor. Também preparar um frasco contendo apenas o odor oi solvente mineraleu. </li><li> Firmemente selar os frascos de odor por fechá-los usando tampões de aço inoxidável e juntas de borracha. </li><li> Ligar os frascos de 5 (4 odor contendo odores e 1 contendo óleo mineral) para o sistema de libertação de odores. Certifique-se de conectá-los na direção do fluxo direita. Uma conexão errada não só irá comprometer a experiência projectada, mas também podem contaminar o sistema de entrega. </li></ol></li><li> Verifique a existência de fugas por meio de selagem da saída da câmara de mistura do dispositivo de estímulo. Certifique-se que todos os fluxos de ar antes do dispositivo de estímulo agora cair progressivamente a zero. Se não, verifique se há vazamentos que agora podem ser identificados pelo som de assobio de ar que sai do sistema. </li><li> Transferir cuidadosamente 15 moscas individuais para 15 tubos de vidro individuais usando um aspirador e tubos de vidro perto de ambos os lados usando os adaptadores correspondentes. Nota: Como o sistema deve ser hermeticamente fechado por experiências bem sucedidas, verifique se os adaptadores caber tubos de vidro hermeticamentee note que os tubos de vidro podem quebrar durante esta etapa. Tome cuidado para evitar lesões através do uso de luvas e óculos de protecção. </li><li> Ligue os tubos de vidro para a configuração Flywalk e, a partir de agora, espere pelo menos 15 minutos antes do início do experimento para permitir moscas para se habituar ao novo ambiente. </li><li> Depois de prender os tubos de vidro: verifique a leitura dos medidores de vazão a jusante digitais no computador 1 se os 16 fluxos de ar após os tubos de vidro adicionar até o fluxo de ar que entra no sistema. Além disso, verifique no computador 1, se a umidade é entre 60% e 80%. </li><li> Projeto do protocolo de estímulo controlar a sequência e tempo de estímulos odor apresentadas às moscas. Para obter os dados descritos por exemplo, odores e 4 apresentam o controlo (óleo mineral) isoladamente e todos ternário possível e as misturas quaternário dos odores simultaneamente para 40 vezes cada um. Definir a duração do pulso para 500 ms, com um intervalo de 90 segundos interstimulus e aleatório seqüência de estímulo. </li><li> Ligue o lifonte ght (LED-cluster; λ = 630). Certifique-se de fornecer luz suficiente para o acompanhamento eficiente sem aumentar a temperatura no interior dos tubos de vidro. </li><li> Defina-se uma região de interesse do sistema de seguimento, arrastando uma moldura em frente da área a ser monitorizada, de tal modo que todos os 15 tubos de vidro estão incluídos e aproximadamente 5 mm das extremidades dos tubos são excluídos. </li><li> Configure 14 linhas de separação entre tubos paralelos individuais no sistema de rastreamento alterando suas posições Y no script correspondente para manter indivíduo identificável moscas durante todo o experimento. Certifique-se de posicioná-los de tal forma que há sempre um tubo de vidro entre duas dessas linhas separadoras, porque apenas uma mosca serão rastreadas entre qualquer conjunto de duas linhas. </li><li> Certifique-se de definir os parâmetros da câmara de tal forma que as moscas são controladas de forma confiável ao longo dos tubos de vidro. Se moscas são perdidos nas extremidades da região de interesse, aumentar o brilho ou o ganho de seguimento software. Evite vibrações mecânicas do sistema de rastreamento. Acompanhe utilizando software comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Iniciar a experiência, iniciando o protocolo de estímulo. Grave flies&#39; XY coordenadas a 20 fps (frames por segundo) e log em combinação com o estado da válvula odor em arquivos de texto. </li></ol> Análise 3. Dados NOTA: Os passos seguintes na análise de dados são automatizadas utilizando rotinas escritas personalizados programados em R. Porque estes passos são cruciais para a obtenção de resultados significativos na análise irá, todavia, ser apresentados em uma maneira passo-a-passo. Os dados brutos para a análise são-arquivos .csv que contêm informações sobre o estado sincronizado válvula odor, número de pulsos no experimento e 15 posições mosca-x em cm em um eixo de tempo comum para um ciclo de estimulação odor. Código personalizado para análise de dados podem ser fornecidos mediante solicitação. <ol><li> Open-arquivo .csv, encontrar tempo ponto de abertura da válvula indicado por um chaESL na coluna que representa o estado da válvula. </li><li> Calcula-se a função linear da posição da forma de odor F (t) = s * t + i onde t é o tempo no ciclo de estimulação, s é a velocidade do vento (aqui 20 cm / seg) e a intersecção i pode ser calculado usando o ponto de tempo entra o odor dos tubos na posição 0 (abertura da válvula mais atraso). </li><li> Encontre o ponto de tempo em que o odor e voar x-posição cruzam para cada voar e definir esse ponto de tempo para 0. Nota: Esta maneira posições mosca estão alinhados para cada individual&#39;s encontro com o odor. </li><li> Excluir moscas sentadas nas próprias bordas da região de interesse. </li><li> Calcular a velocidade de X-posições, dividindo o deslocamento ao longo do eixo x por o intervalo de tempo (100 msec) e repetir o procedimento para cada ciclo de estimulação. </li><li> Para acelerar o tempo de obtenção de pratos, como mostrado na Figura 2E calcular curso de tempo da velocidade média para cada mosca e de odor e aqueles do curso de tempo significativo para um determinado odor. </li><li> Para obter o deslocamento líquido, tal como mostrado na Figura 3C calcular o deslocamento de líquido dentro de 4 segundos após o pulso de odor para cada evento de controle e, depois, o deslocamento líquido médio por mosca e odor. </li></ol> 4. Procedimento de Limpeza <ol><li> Limpe o vidro Tubes <ol><li> Remover moscas e adaptadores de tubos de vidro e tubos de vidro de molho com detergente. </li><li> Lavar tubos de vidro em água corrente destilada e seque-as usando ar pressurizado. </li><li> Tubos de vidro térmico a 200 ° C durante 8 h. </li></ol></li><li> Limpe Odor Delivery System <ol><li> Remove todos os frascos de odor e a tubagem da câmara de mistura central. </li><li> Remover adaptadores de tubos a partir da câmara de mistura. </li><li> Câmara de mistura limpa, lavando-o com solução de limpeza de laboratório e solventes (por exemplo, etanol, acetona). Execute estas etapas sob o capô laboratório. </li><li> Câmara de mistura a seco usando ar sob pressão e aquecer a 200 ° C durante 8 h. </li></ol></li><li> Limpe Odor Frascos e Válvulas de retenção <ol><li> Remova o plugue de aço (junta de borracha de descarte) e válvulas de retenção de frascos de odor e aproveitar todos os componentes na solução de limpeza de laboratório. </li><li> Componentes sonicate em um banho de ultra-som e lavá-los com água destilada. </li><li> Limpe todos os componentes, exceto válvulas de retenção com etanol e acetona. Execute estas etapas sob o capô laboratório. </li><li> Componentes secos que utilizam ar pressurizado e aquecê-los a 200 ° C durante 8 h. </li><li> Válvulas de retenção limpo por dentro por rubor-los com etanol e acetona, utilizando uma seringa (considere direção do fluxo). Execute estas etapas sob o capô laboratório usando óculos de laboratório. Porque acetona ataca peças de borracha, imediatamente válvulas de retenção secas por rubor-los com ar pressurizado. </li><li> Remover os odores residuais pulsando ar através de válvulas de retenção por vários dias. Utilize uma incubadora a 60 ° C e de 1 seg no ar / 1 seg de ar fora regime para este passo de limpeza. </li></ol&gt; </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Embora o sistema Flywalk parece bastante sofisticado, à primeira vista, uma vez configurado e funcionando, é fácil de usar e produz resultados muito robustos. Para enfatizar a consistência dos resultados produzidos com o bioensaio pode-se dizer que os resultados representativos mostrados aqui foram obtidos quase 2 anos depois alguns dos resultados apresentados em estudo anterior 29 com uma configuração modificada usando um novo software de rastreamento e fonte de luz. No entanto, as respostas são atrac...

A meta primordial de qualquer investigação neuroetológica é estabelecer um nexo de causalidade entre os estados de atividade de neurônios individuais ou circuitos neuronais eo comportamento de um organismo. Para alcançar este objetivo a atividade neuronal e comportamento devem ser monitorados em condições idênticas de estímulo e essas condições de estímulo deveriam idealmente ser semelhantes aos do sistema nervoso sob escrutínio evoluído para fazer sentido. Especialmente quando se trata de bioensaios comportamentais, estas exigências têm historicamente se mostrado bastante exigente em Drosophila melanogaster neuroethology olfativo. Uma vez liberada a partir da fonte, plumas odor quebrar rapidamente se em filamentos finos com difusão turbulenta causada pelo movimento do ar é o principal determinante da distribuição odor 1. Como resultado, um inseto navegar para atingir uma fonte de odor experimenta a estimulação intermitente com pacotes de odor intercaladas com intervalos variáveis ​​de ar limpo. ambosandando e insetos voadores - incluindo Drosophila - foram demonstradas para explorar essa regime estimulação intermitente para a navegação de afluência contra o vento em cima de encontro pluma e predominantemente movendo cross-vento na ausência de odores 2 - 5. Considerando que os procedimentos de estimulação em experimentos fisiológicos imitar em grande parte aqueles um inseto pode enfrentar em seu ambiente natural, quer proporcionando puffs únicas de odores intercalados com longos períodos de ar limpo ou sequências de estimulação dinâmica 6 - 11, muitas bioensaios comportamentais utilizados na Drosophila neuroethology como ensaio armadilha , arenas em campo aberto ou T-maze contar com odor gradientes 12 - 15. No entanto, porque os gradientes de odor, por definição, são variáveis ​​na concentração, dependendo da distância a partir da fonte de odor, um comportamento particular não pode ser atribuída a uma concentração de odor usando preciso desses paradigmas. Além disso, a inclinação daum gradiente de odor depende criticamente sobre as propriedades físico-químicas do odorante. Um gradiente de um composto altamente volátil será mais rasa do que o criado por um composto menos volátil e, portanto, também mais difícil de controlar de um organismo depender de medição de diferenças de concentração no espaço como o único meio de navegação 16 - 20, o que pode conduzir a uma interpretação incorrecta de preferências olfativas particularmente em ensaios escolha. Este efeito também é altamente prejudicial ao investigar comportamento em relação a misturas de odores, pois leva a diferentes proporções de mistura de componentes em cada ponto no espaço e, portanto, mais uma vez se opõe a uma clara correlação entre a fisiologia e comportamento. Enquanto moscas do vinagre tendem a se agregar em fermentação de frutas, eles são solitários em sua navegação em direção a fontes de alimento e locais de oviposição. No entanto, em vez de testar animais individuais muitos paradigmas comportamentais utilizados em Drosophila neuroetholoGy examinar o comportamento guiado por odor de coortes de moscas e atração é marcado como a fracção de moscas que escolhem o odor ao longo de um estímulo controle. Estas experiências de coorte têm contribuído grandemente para a compreensão da mosca neuroethology e muitas das observações feitas por usá-los pode ser confirmada em experimentos single-mosca. No entanto, tem sido observado que voa pode influenciar cada decisão alheia 21 e em casos extremos, a avaliação de um odor pode mudar de indiferença à evasão dependendo da densidade populacional 22. Além disso, os resultados destes tipos de experimentos muitas vezes fornecem apenas o ponto final de uma sequência de decisões comportamentais ao invés de observar o que a mosca está fazendo enquanto ele estiver fazendo isso, o que seria desejável ao tentar correlacionar o comportamento com a atividade neuronal. Estas experiências de coorte, em vez de baixa resolução são contrastados por métodos de alta resolução single-mosca, como arenas de voos cativos e esteiras que permitempara uma observação directa das respostas de comportamento no momento em que o estímulo é apresentado 20,23,24. No entanto, as experiências de coorte ainda são populares, porque eles são muito eficientes e fornecem resultados robustos, mesmo em baixo comparativamente tamanhos de amostra, porque a variabilidade inter-individual e inter-julgamento são parcialmente média para fora devido à observação de populações ao longo de períodos de tempo prolongados. Enquanto voo tethered e esteira provavelmente fornecer o padrão-ouro, relativa apresentação do estímulo e resolução temporal, as arenas utilizadas são projetados para animais individuais e por isso é necessário para obter os tamanhos de amostra para uma análise estatística demorado. Várias outras abordagens têm sido recentemente desenvolvidos para permitir uma aquisição eficiente de alta-resolução dos dados comportamentais em combinação com um regime de estímulo bem definida. Estes incluem não vigiada seguimento 3D de várias moscas do vinagre em um túnel de vento em combinação com um modelo 3D preciso da pluma de odor 5 </sup&gt;, o rastreamento de vários moscas individuais em câmaras escolha fornecidas com correntes de ar de ambos os lados 25 e o paradigma Flywalk 26. Em Flywalk, 15 moscas individuais situam-se em pequenos tubos de vidro e continuamente monitorizada por uma câmara de suspenso, sob condições de luz vermelha. Os odores são adicionados a uma corrente de ar contínua de 20 cm / seg e viajar através dos tubos de vidro a uma velocidade constante. A corrente de ar é humidificado fazendo-o passar através de 250 ml garrafas contendo água destilada (humidificadores) antes de entrar no sistema de libertação de odores. As posições flies&#39; são registados dentro de uma região quadrado de interesse (ROI) que abrange a maior parte do comprimento dos tubos de odor (mas excluindo as bordas exteriores dos tubos (aproximadamente 5 mm de cada lado), em que as moscas não pode mover-se mais para cima ou a favor do vento) em torno do tempo de apresentação de odor (Figura 1A, B). Voar identidades são mantidas constantes pelo sistema de rastreamento de turante o experimento com base em suas posições Y (ou seja, os seus limites de tubo de vidro). Estimulação odor é conseguida usando um dispositivo de estímulo multi-componente que permite a apresentação de até 8 odores individuais possíveis e todas as suas misturas 26,29 (Figura 1B). O curso de uma experiência é controlada por um computador de regulação do sistema de entrega e recolha de odor temperatura e humidade informações (computador 1, Figura 1C). Este computador também controla um datalogger (iniciar / parar a gravação) em um segundo computador que rastreia continuamente posições voar a 20 quadros por segundo (computador 2). Voe posições, estado da válvula odor (ou seja, ponto de tempo de abertura da válvula), odor ID, ​​temperatura e umidade em torno de ciclos de estimulação odor são registradas no computador 2. Desta forma, informações sobre odor e voar posições são sincronizados e exportados como .csv-arquivos que podem continuar a ser processados ​​e analisados ​​utilizando rotinas de análise escrito sob medida. porquetodo o sistema é controlado por computador, sem intervenção humana, é necessário durante uma sessão experimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="866">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flywalk setup</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:207px;">details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stimulus device</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED cluster</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HD Pro Webcam C920</td>
			<td style="width:325px;">Logitech, Lausanne, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Computers</td>
			<td style="width:325px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Flywalk Reloaded v1.0 software</td>
			<td style="width:325px;">Electricidade Em P&#243; (electricidadeempo.net)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labview 11.0 software</td>
			<td style="width:325px;">National Instruments, Austin, TX</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly food</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">aspirator</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mineral oil</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">odors</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">200 &#181;l PCR reaction tubes</td>
			<td style="width:325px;">Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution quantification of odor-guided behavior in drosophila melanogaster using the flywalk paradigm

Em seu ambiente natural, insetos, como o vinagre voar Drosophila melanogaster são bombardeados com uma quantidade enorme de odorants quimicamente distintos. Para complicar ainda mais, os odores detectados pelo sistema nervoso dos insetos geralmente não são compostos isolados, mas misturas cuja composição e rácios de concentração variar. Isto leva a uma quantidade quase infinito de diferentes estímulos olfactivos que têm de ser avaliados pelo sistema nervoso. Para entender quais aspectos de um estímulo odor determinar a sua avaliação pela mosca, é desejável, portanto, examinar de forma eficiente o comportamento guiado por muitos no sentido de odor odores e misturas de odores. Para se correlacionam diretamente comportamento para a atividade neuronal, o comportamento deve ser quantificada em horários similares e em condições idênticas às de estímulo em experimentos neurofisiológicos. No entanto, muitos bioensaios olfativos usados ​​atualmente em Drosophila neuroethology são bastante specialized quer no sentido da eficiência ou em direção a resolução. Flywalk, um sistema de entrega de odor e monitoramento automatizado, preenche a lacuna entre eficiência e resolução. Ele permite a determinação de um pacote exactamente quando odor estimulada uma mosca que anda livremente, e para determinar as ANIMAL reacção comportamental dinâmica.

Como as moscas são autorizadas a distribuir livremente nos seus tubos de vidro entre os pulsos de odor e o pulso de odor viaja através dos tubos de vidro a uma velocidade constante moscas encontrar o odor em momentos diferentes, dependendo da sua posição-x, no momento da estimulação. Como resultado, os inícios das trajectórias de fluxo ascendente evocados por um pulso de 500 ms de um atraente 10 -3 diluição de acetato de etilo são atrasadas em cerca de 1 segundo para as moscas na extremidade a jusa...

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High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

high-resolution-quantification-odor-guided-behavior-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

9.2K visualizações.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster. 

Vídeo: High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.