Este método ajudará os investigadores a estudar a biologia e a fisiopatologia das bactérias anaeróbicas que vivem e causam infecções no trato reprodutivo feminino. Modelos anteriores de inoculação vaginal murina se concentraram em bactérias cultivadas e recuperadas sob condições aeróbicas. Nosso método instrui sobre a inoculação e recuperação de bactérias obrigatoriamente anaeróbias, que requerem estratégias adicionais para minimizar a exposição ao oxigênio.
Dependendo de quão exigentes eles são, novas cepas bacterianas usadas neste modelo podem exigir mudanças em certas etapas. Fornecemos sugestões para possíveis modificações na tabela um do manuscrito. Para começar, adicione 200 microlitros de uma cultura bacteriana de 16 horas de idade a uma cubeta de 1,5 mililitro com 800 microlitros de meio fresco em uma câmara anaeróbica.
Em seguida, mediu-se a densidade óptica, ou OD, da cultura diluída a 600 nanômetros em um espectrofotômetro, usando uma cubeta separada com apenas meio em branco. Para obter o valor real de DO da cultura, multiplique a leitura do espectrofotômetro por cinco, determine o volume de inóculo necessário para o experimento e calcule o volume da cultura bacteriana necessária para atingir a densidade de inóculo necessária. Em seguida, pipete o volume necessário de cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga estéril e centrífuga a 16.000 vezes G por um a três minutos.
Após a remoção do sobrenadante, ressuscite o pellet em PBS anaeróbio para atingir o volume necessário de inóculo calculado anteriormente. Para determinar o número de unidades formadoras de colônias bacterianas no inóculo preparado, primeiro, use 10 microlitros da suspensão bacteriana para fazer várias diluições em série no PBS e use uma pipeta multicanal para detectar diluições de inóculo em placas em placas de ágar. Ao mesmo tempo, prepare os tubos de lavagem vaginal na câmara anaeróbica pipetando 70 microlitros de PBS anaeróbico estéril em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro marcados com números de camundongos.
Feche bem os tubos e retire-os da câmara. Para realizar a lavagem vaginal, primeiro, coloque um rato em cima de uma gaiola que ele possa agarrar com as patas dianteiras. Em seguida, segure suavemente a parte do meio da cauda e levante-a para que os quartos traseiros estejam ligeiramente elevados e a abertura vaginal seja exposta.
Depois de extrair 50 microlitros de PBS do tubo de lavagem rotulado, insira suavemente a ponta da pipeta de dois a três milímetros no lúmen vaginal para lavá-la com PBS pipetando para dentro e para fora três a quatro vezes. Em seguida, transfira o material de lavagem de volta para o tubo de lavagem original com os 20 microlitros restantes de PBS não utilizados. Imediatamente após esta lavagem vaginal, inocular cada rato transferindo por via vaginal 20 microlitros da suspensão bacteriana ou controle do veículo.
Para experimentos de co-inoculação com duas cepas bacterianas diferentes, inocular separadamente com 10 microlitros de cada suspensão bacteriana, em vez de misturar as cepas de antemão. Para evitar que o volume administrado se acumule imediatamente no introito vaginal, continue segurando a parte traseira do rato por 10 a 20 segundos. Transfira o rato inoculado para uma nova gaiola ou com companheiros de gaiola já inoculados e repita o procedimento com os outros ratinhos.
Depois de inocular todos os camundongos, obtenha as unidades formadoras de colônias pós-inóculo por diluição em série do inóculo na câmara anaeróbia. Para coletar órgãos de camundongos, prepare tubos de coleta de órgãos de cinco mililitros na câmara anaeróbica, adicionando um mililitro de PBS anaeróbico estéril a cada tubo para vaginas e cervices. Adicione 750 mililitros de PBS aos tubos marcados para chifres uterinos.
Para coletar a lavagem final no sacrifício, prepare outro conjunto de tubos de lavagem vaginal, conforme demonstrado anteriormente. Além disso, para enxaguar e esterilizar instrumentos de dissecção, prepare um copo de 50 mililitros de água deionizada e um copo de 50 mililitros de 70 a 90% de etanol. Imediatamente antes ou depois de sacrificar os ratos, execute a lavagem final, conforme demonstrado anteriormente.
Após o sacrifício, pulverize o abdômen e as costas de um rato com etanol a 70%. Em seguida, use tesouras esterilizadas e secas a etanol para abrir a cavidade pélvica abdominal do rato com cortes verticais. Em seguida, use a pinça para puxar a pele para trás.
Para expor o trato reprodutivo, empurre suavemente os intestinos para fora da cavidade do corpo para o lado do campo aberto e remova a bexiga do rato para acessar a porção inferior do trato reprodutivo. Depois disso, prenda o centro do osso púbico com uma tesoura sem cortar a vagina. Em seguida, use dois conjuntos de pinça para agarrar cada lado da pélvis e puxe a pélvis aberta lateralmente para expor a porção inferior da vagina por baixo.
Pegue suavemente o colo do útero com pinça e puxe-o para cima para expor o cólon. Depois disso, use uma pequena tesoura para liberar a vagina dos tecidos conjuntivos externos. Solte cuidadosamente a vagina do cólon sem perfurar o trato intestinal.
Quando a vagina estiver totalmente liberada do cólon, use uma tesoura para flanquear a vagina no introito e, em seguida, corte para removê-la do corpo do rato. Mantendo um aperto suave no colo do útero, puxe-o para cima para tornar os chifres uterinos mais visíveis e corte diretamente abaixo dos ovários nos lados direito e esquerdo para liberar os chifres uterinos. Em seguida, remova o trato reprodutivo do corpo do rato e coloque-o em uma placa de Petri estéril.
Em seguida, usando uma lâmina de barbear, separe os chifres uterinos, o colo do útero e a vagina. Coloque cada tecido em seu respectivo tubo de coleta rotulado. Para homogeneizar os órgãos, faça um homogeneizador portátil pronto em um gabinete de biossegurança.
Primeiro, prepare um conjunto de três tubos de 50 mililitros com água deionizada, etanol a 70% e PBS, respectivamente, para lavar as lâminas do homogeneizador após homogeneizar cada órgão. Para limpar o homogeneizador, mergulhe a lâmina no tubo de água e ligue a máquina a toda velocidade por cerca de três segundos. Em seguida, agite a lâmina em uma toalha de papel para remover o excesso de água.
Enxaguar a lâmina sucessivamente em etanol a 70% e PBS. Após o enxágue inicial, abaixe a sonda homogeneizadora para o fundo de um tubo com órgãos para prender o tecido por baixo. Em seguida, ligue o homogeneizador para moer o tecido e mova suavemente a sonda para cima e para baixo cerca de cinco vezes, mantendo-a submersa.
Desligue e remova o homogeneizador e assegure visualmente a ruptura completa do tecido. Após a homogeneização, recicle a amostra de volta para a câmara anaeróbia e realize a diluição em série para a recuperação da UFC. Seguindo este protocolo, a recuperação de bactérias viáveis e a enumeração de unidades formadoras de colônias das lavagens vaginais poderiam ser feitas com sucesso para as cepas bacterianas, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum.
Além disso, o número de unidades formadoras de colônias de Gardnerella vaginalis obtidas a partir de lavagens vaginais correlacionou-se com aquelas recuperadas dos homogeneizados do tecido vaginal. Este método também revelou que os títulos de Prevotella bivia e tecidos uterinos de camundongos foram significativamente maiores durante a co-infecção com Gardnerella vaginalis versus Prevotella mono-infecção. Além disso, este método poderia ser usado com sucesso para comparar a persistência vaginal de uma cepa mutante de Fusobacterium nucleatum com a do tipo selvagem em 24 e 72 horas após a inoculação.
Para investigar a resposta imune à inoculação bacteriana vaginal, ensaios de citocinas podem ser executados nos homogeneizados teciduais. Alternativamente, os tecidos poderiam ser salvos para exame histológico para avaliar sinais de inflamação.
