We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Medição de Energia em um buffer Flux Instrumento Extracelular: Duas Variações NOTA: os cálculos e métodos descritos aqui foram desenvolvidos usando uma Extracelular Flux Analyzer. Para outros instrumentos, o volume de medição deve ser dimensionado apropriadamente. <ol><li> Prepare a 0,1 M de HCl em água padrão utilizando HCl concentrado (ver Materiais e equipamento) de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Um exemplo de cálculo para a preparação de injecções de HCl para utilização em todos os quatro orifícios de injecção é mostrado no Quadro 1: </li></ol><img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tabela 1. injecções HCl consecutivos em um ensaio de fluxo extracelular bem. <ol start="2"><li> Preparar diluições do padrão de HCl no meio a ser ensaiada como na Tabela 1 para o número de repetições técnicas sendo CarrIED em uma placa, além de um para permitir a pipetagem de erro, por exemplo, por quatro repetições técnicas do porto Uma injeção, preparar um estoque de (1,1 mL x 5) HCl 0,1 M em (48,9 ul x 5) meio de ensaio. </li><li> Distribuir 50 ul em cada porta do cartucho A sonda de medição. Repita esse procedimento para portas restantes B, C e D. </li><li> Executar um ensaio de fluxo extracelular de 10 com um ciclo de calibração padrão, seguido por dois ciclos de [2 min mistura, 1 min de espera, e 5 min de medição], para cada uma das quatro adições de porta (ver Figura 2). <ol><li> Programar a experiência acima no software do instrumento de acordo com as instruções de software. Carregar o cartucho preparado para a máquina e executar a calibragem de acordo com as instruções de software. </li><li> Quando solicitado pelo programa, retire a placa contendo calibração e insira a placa contendo meio de ensaio em cada poço no instrumento; continuar o programa. </li></ol></li><li> vc<html> cantar a média de 8-10 pontos de dados obtidos em estado estacionário (tipicamente os últimos 8-10) a partir de pontos, antes e depois de cada adição da porta, o cálculo da diferença (cumulativa) em pH (ΔpH) causada por cada injecção de ácido de referência. </li><li> Traçar ΔpH contra nmol H + contido no volume 7 ul preso pela sonda de medição. A inclinação linear é o poder de tamponamento (BP) em mph / pmol H +. </li><li> Como alternativa aos passos 1.2-1.3, efectuar as medições seguintes ΔpH um ensaio em que portas A, B, e C são usadas para a realização de uma experiência, seguida por uma injecção de HCl em Port D. Tal como na Tabela 2, quatro repetições são técnicas usado para gerar cada ponto de uma curva padrão de 5 pontos nos 20 poços experimentais (excluindo os poços quatro fundo) de correcção da temperatura da placa de ensaio de fluxo extracelular. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Tabela 2. HCl único injecção num ensaio de fluxo extracelular bem. 2. medição de energia Usando um buffer pH medidor externo NOTA: Para medir o poder tamponante de um meio utilizando uma sonda de pH externo, calibrar a sonda a 37 ° C e manter esta temperatura durante todos os reagentes durante a experiência. <ol><li> Prepare a 0,1 M de HCl em água padrão utilizando HCl concentrado de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Quente sonda de pH, os padrões de pH, o meio de ensaio cujo poder tamponante está a ser medido, e HCl 0,1 M a 37 ° C num banho de água. </li><li> Calibrar sonda de pH a 37 ° C de acordo com as instruções do fabricante. Manter todos os reagentes a 37 ° C durante todo o ensaio, utilizando uma placa de aquecimento ou banho-maria. </li><li> Alíquota de 10 ml do meio de ensaio para um pequeno copo ou tubo cónico. Monitorar continuamente pH utilizando uma sonda de pH mergulhados. </li><li> Adicionar HCl 0,1 M para o quantodizer médio em 10-20 mL alíquotas. <ol><li> Assegurar a mistura usando uma vareta de agitação ou agitando manualmente o recipiente depois de cada adição de ácido. </li><li> Aguarde alguns segundos para que a medição de pH para estabilizar, então gravar o pH após cada adição. </li><li> Tal como demonstrado na Tabela 3, efectuar um número suficiente de adições para assegurar cálculo da inclinação exacta e para cobrir o intervalo de pH esperado durante a experiência. </li></ol></li></ol><img alt="Tabela 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tabela 3. Medição poder tamponante usando um medidor de pH. Os dados representam uma experiência típica com seis adições de 20 ul de 0,1 M de HCl. <ol start="6"><li> Lote ΔpH contra nmol de H + por adicionado 7 ul, dando uma inclinação linear que representa o poder tamponante (Figura 1). </li></ol> Figura 1. Determinar poder buffering. HCl curva padrão medido como na Tabela 1, a Tabela 2 ou (aqui) como na Tabela 3. O declive da curva de ajuste linear dá o poder tampão (pH / nmol de H + em 7 ul). Cada ponto representa a média ± SEM de n = 9 repetições técnicas. <ol start="7"><li> Uma vez que o poder tamponante é conhecido através Método 1 ou 2 acima, converter o sinal ECAR (MPH / min) para PPR (pmol H + / min / mg de proteína) pela divisão ECAR por poder tamponante (BP) (MPH / pmol H +) e escala para o teor de proteína de cada poço: PPR tot (pmol H + / min / mg de proteína) = ECAR (MPH / min) / BP (MPH / pmol H + em 7 ul) / proteína por poço (g) Equação 6 </li><li> Como alternativa, use os mesmos experimentos em Métodos 1 ou 2, para calcular o valor de Capacidade Tampão (BC) usado pelo software do instrumento para calcular automaticamente PPR durante a recolha de dados. NOTA: O manual do usuário instrumento 12 (página 107) fornece informações detalhadas sobre como calcular e utilizar a capacidade de tamponamento, onde BC é descrito como BC (mol / L) = moles de H + / (ΔpH volume de tampão X (G)) Equação 7 NOTA: A capacidade de tamponamento, tal como definido na Equação 7 pode ser calculada no instrumento ou sonda de pH externo ensaios descritos acima. Conversão entre o poder tampão e capacidade tampão é feito facilmente (veja planilha em anexo): BC = 1 x 10 -9 / BP ((MPH / pmol H + em 7 ul) / 7 ul) Equação 8 NOTA: Se for conhecida antes da realização do ensaio, a capacidade de tamponamento podem ser inseridos diretamente no software do instrumento durante a configuração experimental. </li><li>Aplicar esse procedimento e os cálculos utilizados anteriormente para a maioria dos sistemas tampão convencionais, como descrito na publicação anterior 6. NOTA: A Tabela 4 lista o poder de tamponamento e de capacidade de buffer de vários meios de comunicação convencionais. </li></ol><img alt="Tabela 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tabela 4. Buffer poder e capacidade de tamponamento da mídia selecionada. 3. Realizar uma Extracelular Flux ensaio usando células C2C12 mioblastos NOTA: No passo 3.4.3, não houve diferenças observadas na produção de CO 2 -derived ácido dependente da presença de anidrase carbónica na cultura C2C12, sugerindo que a sua presença não é necessária para a conversão completa de CO 2 a HCO 3 - + H +. No entanto, testando empiricamente esta em diferentes sistemas experimentais é recomendada antes omanidrase carbônica itting. <ol><li> Cultura rato C2C12 myoblasts 13 a 37 ° C sob 95% de ar / 5% de CO 2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 11,1 mM de glicose, 2 mM de glutamina, 10% v v de soro / fetal de bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> 24 horas antes do ensaio, células / placa de semente em 100 mL do mesmo meio de cultura a 20000 células / cavidade em uma placa de ensaio de 24 poços de poliestireno fluxo extracelular (ver Materiais e Métodos) com nenhum revestimento adicional. </li><li> Diluir oligomicina, FCCP, e rotenona mais myxothiazol, e HCl (opcional) para 10x a concentração final em Krebs Ringer Fosfato de HEPES (KRPH) meio de ensaio (HEPES 2 mM, NaCl 136 mM, 2 mM de NaH 2 PO 4, KCl 3,7 mM, 1 mM de MgCl2, 1,5 mM de CaCl2, 0,1% w / v de albumina de soro de bovino isenta de ácidos gordos, pH 7,4 a 37 ° C). </li><li> Preparação de Células <ol><li> 30 min antes do ensaio, lavar as células aderentes três vezes por aspiração para GEntly remover a forma do poço e em seguida, adicionando-se lentamente 500 ul KRPH. </li><li> Incubar as células a partir do terceiro passo de lavagem a 37 ° C sob ar (não menos de 5% de CO 2, o que vai alterar o pH deste meio isento de bicarbonato). </li><li> No início do ensaio, substitui KRPH em poços com 500 ul KRPH fresco contendo anidrase carbónica 500 U / mL e qualquer glicose (10 mM) ou apenas meio, sem substrato adicional. </li></ol></li><li> Carregando o cartucho do sensor <ol><li> Pipetar 50 mL alíquotas de cada 10x composto preparado no passo 3.3 em portas de cartucho de um cartucho extracelular fluxo do sensor como se segue (as concentrações finais no ensaio bem determinada): Porta A: 2 ug / ml oligomicina, Porta B: 0,5 uM FCCP, Porta C : 1 rotenona uM, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (se realizar uma calibração em ácido-ensaio tal como descrito acima e na Tabela 2). NOTA: com a finalidade de completa inibição da cadeia respiratória aqui descritos, 1 mM meusxothiazol pode ser utilizado intermutavelmente com 1 uM antimicina A. </li></ol></li><li> Extracelular ensaio de fluxo: <ol><li> Realizar um ensaio de fluxo extracelular padrão para determinar controle respiratório, como descrito no 10. </li></ol></li></ol> NOTA: Para cada segmento da experiência, determinar a mistura, esperar, e tempos de medição desejada, bem como o número de ciclos por segmento. NOTA: Os dados da Tabela 5 foram recolhidos ao longo de dois ciclos de ensaio de 2 minutos de mistura, 1 min de espera, e 5 min medida para cada segmento, com três ciclos de ensaio que ocorre após a adição porta D de diferentes quantidades de HCl (para a calibração de tamponamento poder como na Tabela 2). <img alt="Tabela 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tabela 5. configuração ensaio de fluxo extracelular. 4. Measuring End-point concentração de lactato NOTA: Para validar o ensaio indirecto descrito aqui em algum sistema diferente, ponto de concentração de lactato final, no final de uma experiência de fluxo extracelular pode ser determinada directamente numa placa de 96 poços convencionais, medindo a velocidade inicial (durante 2 minutos) de redução de NAD + → NADH catalisada pela desidrogenase de lactato, descrito em pormenor na nossa publicação anterior 6. Para os dados apresentados na Resultados representativos, a concentração de lactato no ponto final em poços de ensaio contendo glucose era ~ 40? M. <ol><li> Prepare forma hidrazina 2x: Tris 1 M, EDTA 20 mM, 400 mM hidrazina a pH 9.8 a 22 ° C). Imediatamente antes do início do ensaio, adicionar NAD + para 4 mM e lactato desidrogenase (LDH) a 40 U / mL. Composição do meio de ensaio final (1x): Tris 500 mM, EDTA 10 mM, 200 mM hidrazina, 2 mM NAD +, 20 U / mL de LDH. </li><li> Imediatamente após o ensaio de fluxo extracelular, remover 100ul de meio de ensaio de cada poço da placa de ensaio de fluxo extracelular e transferir para um poço de uma placa opaca (preto) de 96 poços. </li><li> Para cada poço de amostra, adicionar 100 mL 2x meio de hidrazina. </li><li> Carregar imediatamente a placa para um leitor de microplacas e começar a monitorização de fluorescência de NADH a 340 nm de excitação / emissão a 460 nm. </li><li> Grave a velocidade inicial de cerca de 2 min. </li><li> Executar uma experiência similar para construir uma curva padrão através da representação gráfica da velocidade em função da concentração inicial de lactato para as concentrações de lactato adicionados entre 0 e 50 uM. </li><li> Calcular a concentração de lactato em cada poço experimental usando a curva padrão. </li></ol> 5. Medição de conteúdo de proteína <ol><li> Remover o meio de ensaio remanescente de cada poço da placa de ensaio. </li><li> Lavar os poços três vezes com 250 ul de BSA livre de KRPH, tomando cuidado para minimizar o desalojamento das células a partir da superfície de fundo bem. </li><li> Adicionar 25 ul de lise RIPAmédio (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, 1% v / v de Triton X-100, 0,5% w / v de desoxicolato de sódio, 0,1% v / v de SDS, pH 7,4 a 22 ° C) a cada poço da placa de ensaio. </li><li> Incubar a placa em gelo durante 30 min. </li><li> Agitar placa num agitador de placas a 1.200 rpm, durante 5 min. </li><li> Medir a concentração de proteína através de métodos padrão, por exemplo, por ensaio BCA, assegurando que a composição do tampão de lise é compatível com o método de medição. O teor de proteína no ensaio na Figura 2 foi de ~ 4 ^ g / cavidade. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li><li>Renner, K., Jansen-D&#252;rr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption.">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li><li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism.">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).</li><li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li></ol>

Dr. Shona Mookerjee declara que ela não tem interesses financeiros concorrentes. Dr. Martin Marca consultou para Seahorse Biosciences, que produz instrumentos e reagentes utilizados no presente artigo. Taxas de acesso aberto para este artigo foram pagos pela Seahorse Biosciences.

Acidificação extracelular é uma indicação facilmente medido da taxa metabólica celular. Para determinar correctamente a taxa de glicólise celular (tal como definido pela produção de lactato) é crítico saber o poder tamponante do meio de ensaio, e para converter as medições de fluxo extracelulares de consumo de oxigénio e a acidificação em protão taxas de produção. Ao realizar este cálculo, a acidificação resultante do CO2 libertado no ciclo do ácido cítrico pode ser subtraído, deixando a acidificação que resulta da produção de lactato. As múltiplas formas diferentes dadas aqui para medir a potência de tamponamento para esta correcção transportar diferentes vantagens e desvantagens. Medição externa usando uma sonda de pH é altamente preciso e reprodutível, mas pode não reflectir pequenas diferenças na detecção de pH introduzido pelos fluoróforos contidos no interior da placa de ensaio, a adição de compostos durante o ensaio, ou a presença de tele próprias células. A in-placa medições de pH abordar estas questões, mas também apresentar vários graus de ruído experimental. A correcção de CO 2 a ECAR permite pela primeira vez o cálculo inequívoca e quantitativa da taxa glicolítica, e revela uma variação na contribuição respiratória e glicolítico para ECAR total durante o decurso de uma experiência. Utilizando a Equação 5 e as medições de OCR, ECAR, e poder tamponante, taxa glicolítica pode ser calculada utilizando a folha de cálculo simples, desde que (Tabela 6). Esta taxa pode ser verificada por medição de lactato post-hoc, se desejado 6. Nas células em que a via da pentose fosfato é altamente activo, o uso de inibidores da via, tais como 6-aminonicotinamide pode ser útil para isolar taxa glicolítica. Cálculo das contribuições de ambos CO 2 - e derivados de lactato H + do total medido extracelular acidificação Taxa e oxigênio Consumption Taxa é uma ferramenta inestimável para a utilização de dados de fluxo extracelulares para fazer declarações poderosas e quantitativos sobre a atividade metabólica. Utilizando os procedimentos descritos aqui, incluindo as várias modificações para a medição da potência de tamponamento, e optimizar o fluxo extracelular experimento para as células sob investigação e os dados desejados, a taxa de glicólise em células intactas podem ser quantificados sob uma ampla gama de condições experimentais. Este método está limitado a células que podem crescer em cultura aderente em (ou células ou organelas que podem ser aderidos a) uma superfície de poliestireno. É mais fiável quando as células cultivadas são homogéneos e confluentes, embora os dados úteis podem ainda ser obtidos ao longo de um intervalo de estas condições. Os cálculos requerem algum conhecimento do metabolismo das células, como Max H + / O 2 varia de 0,65 a 1,0 para a oxidação completa dos diferentes substratos e mais para a oxidação parcial 6, no entanto, se as células forem Known para oxidar glicose, um valor de 1,0 pode ser assumida. Embora relevante para todos caracterização metabólica, este método pode ser particularmente útil quando utilizada em sistemas em que uma mudança entre o metabolismo respiratório e para manter a produção glicolítica do ATP celular é um fenótipo crítica, incluindo a caracterização de células estaminais e células de cancro derivadas de tumores. Compreender alterações controle metabólico desses e outros contextos permitirá um maior grau de sofisticação e precisão no desenho experimental e análise destes tipos de células.

O objetivo geral deste método é medir com precisão a taxa glicolítica de células usando a análise de fluxo extracelular. A medida quantitativa da taxa glicolítica usando acidificação extracelular é o ponto final desejado de muitos experimentos. No entanto, a taxa total de acidificação extracelular é a soma de dois componentes: a acidificação respiratória, sob a forma de CO2 (que hidrata a H 2 CO 3, em seguida, dissocia-se de HCO 3 - + H +), e acidificação glicolítica, sob a forma de lactato - + H +. As contribuições de CO 2 a acidificação extracelular totais têm até recentemente foi considerado insignificante na plataforma de medição utilizado aqui, o analisador XF24 7. No entanto, é evidente em vários outros sistemas que CO 2 pode ser um dos principais contribuintes para a acidificação extracelular 4-5. Vários papéis reconhecer este contribuição, mas não tente a quantificação direta de CO 2 -derived 3,8,9 ácido. Nós recentemente demonstrado quantitativamente que a produção de CO 2 é uma fonte significativa de acidificação extracelular neste sistema 6. Além disso, apesar de existirem várias vias metabólicas que geram CO 2 a partir de catabolismo da glicose, os realizados por desidrogenases matriz no ciclo do ácido cítrico são os contribuintes esmagadora e todas as outras fontes de gerar quantidades de CO 2 que estão dentro do erro experimental 6. Sem correcção para a produção de CO 2, a acidificação extracelular é, por conseguinte, um indicador de taxa de ambígua glicolítica e não pode ser utilizado quantitativamente. Nossa publicação anterior destaca vários casos em que respiratória CO 2 compreende a maior parte do sinal total acidificação, mesmo em células geralmente acredita-se usar principalmente glicólise 6. Além disso, orespiratório CO2 contribuição para a acidificação total varia amplamente durante o decorrer de experiências comuns perfis metabólicos, demonstrando que a correcta comparação da taxa glicolítica durante diferentes partes de um experimento requer correcção para o CO 2. Para medir a taxa glicolítica de células utilizando a taxa de acidificação extracelular, é necessário converter as alterações de pH às mudanças no total gerados H +, e para subtrair o acidificação extracelular causada por CO2 libertado durante a operação do ciclo do ácido cítrico. Aqui, descrevemos um método simples para medir a taxa de produção de prótons extracelular (a partir de mudanças extracelulares em pH eo poder calibrado tamponamento do meio de ensaio) e produção de CO 2 (a partir de mudanças extracelulares em O 2 concentração), e demonstrar como calcular taxa glicolítica usando estas medições. Este método força<html> ens a utilidade da medida acidificação extracelular, utilizando-o para calcular corretamente taxa glicolítica tal como definido pela produção de lactato. Sem correcção para o CO respiratória 2 (ou medição directa do lactato), é impossível determinar se e em que medida a taxa de acidificação dadas reflecte taxa glicolítica, confundindo a interpretação de experiências que utilizam acidificação extracelular total, como uma medição directa da produção de lactato. CÁLCULOS CO 2 e lactato são, dentro do erro experimental, os dois únicos contribuintes para a produção de ácido extracelular, com base em experimentos com células mioblastos 6. Portanto, a taxa de acidificação extracelular total de (PPR, a taxa de produção de protões) pode ser definida como: PPR tot = PPR resp + PPR Glyc Equação 1 . _content &quot;&gt; onde tot = total; resp = respiratória; Glyc = glycolytic Glicosidases PPR é assim: PPR Glyc = PPR tot - PPR resp Equação 2 Aqui, PPR tot = ECAR tot / BP Equação 3 onde ECAR = taxa de acidificação extracelular (MPH / min) e BP = poder tampão (MPH / pmol H + em 7 ul), enquanto PPR resp = (10 pH-pk 1 / (1 ​​+ 10 pH-pk 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Equação 4 1 onde K = constante de CO2 de hidratação e de dissociação de equilíbrio para o HCO 3 combinado - + H +; max H + / O 2 = the CO 2 a acidificação -derived para uma transformação metabólica em particular tais como a oxidação completa de glicose-6; OCR = taxa de consumo de oxigênio (O 2 pmol / min), e OCR rot / myx = não-mitocondrial OCR. Equação 4 isolados mitocondrial OCR subtraindo qualquer OCR não-mitocondrial (definida como o OCR que é resistente à mitocondrial respiratória venenos rotenona e myxothiazol) e representa a máxima H + gerada por O 2 consumido para cada substrato (max H + / O2 ) (ver 6), bem como a proporção de CO 2 dando origem a H + a uma temperatura experimental e pH (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1). Para a oxidação completa de glucose, oxigénio mitocondrial Taxa de Consumo (OCR) é exactamente igual à taxa de produção de CO 2. No volume de ensaio de medição do fluxo confinado extracelular, CO 2 produtosd pela respiração permanece preso no meio de ensaio. A maior parte do CO2 é preso hidratado a H 2 CO 3, que, em seguida, dissocia-se de HCO 3 - + H +. Uma fracção pequena permanece dissolvido mas não hidratada, e uma outra fracção pequena é hidratado mas não dissociada, como ditado termodinamicamente pela constante de CO2 de hidratação e de dissociação de equilíbrio combinado de HCO 3 - + H + a temperatura experimental (37 ° C) e pH (~ 7,4). Assim, a equação completa para o cálculo PPR g subtraindo PPR resp de PPR tot é: PPR Glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-pk 1 / (1 ​​+ 10 pH-pk 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Equação 5 EuN deste modo, as taxas de respiração e a glicólise, assim como as suas taxas de produção de ATP associados, pode ser determinada quantitativamente a partir de medições directas (consumo de oxigénio, de acidificação extracelular, capacidade tampão) e de importação, ou cálculo de outros valores necessários (H + / O2 , P / S, e a constante de equilíbrio K 1) 6. O experimento descrito aqui se expande sobre as técnicas padrão para usar o Extracelular Flux Analyzer como Seahorse XF24 10,11; para outros formatos de medição de fluxo extracelular (por exemplo, XF e 96, ou XFP), todos os volumes abaixo devem ser dimensionados de forma adequada. O poder de enchimento do meio de ensaio pode ser medido pela construção de uma curva padrão, quer directamente na plataforma de fluxo extracelular ou separadamente, utilizando uma sonda de pH calibrada. Aqui, três opções para medir a memória intermédia por meio de ensaio de fluxo extracelular são dadas, incluindo o uso de todos os injectinas portas do analisador de fluxo extracelular com poços de amostras livres de células, ou usando apenas a última porta de injeção em poços contendo células (seção 1) ou usando uma medição de pH externo (seção 2). Consulte a planilha em anexo para os cálculos completos de dados de exemplo. Para medir a potência de buffer usando a capacidade do instrumento de fluxo extracelular de detecção de pH, é mais seguro usar poços livres de células para minimizar a variação do sinal. No entanto, dentro do erro, não existe nenhuma diferença estatística entre poços e quando se realiza esta medição contendo celular isento de células (dados não mostrados). NOTA: A variação descrito no passo 1.7 transporta a vantagem de contabilização de quaisquer potenciais alterações ao buffer conferidos por compostos adicionados ou pela presença de células, com a desvantagem de sinal mais barulhento. No entanto, como indicado acima, não foram encontradas diferenças significativas na potência tamponante calculada entre a concepção livre de células mostrados na Tabela 1 eo projeto de pós-experimento na Tabela 2, nas condições experimentais descritas aqui. Além disso, sobre pequenos intervalos ΔpH (&lt;0,4 unidades; experimentalmente melhor a 0,2 unidades), a inclinação linear obtido através da representação gráfica Δ MPH / pmol H + aproxima adequadamente a relação logarítmica entre ΔpH e [H +]. O declive desta curva padrão representa, portanto, o poder de enchimento do meio de ensaio em ensaio de pH / nmol de H + em 7 ul, ou MPH / pmol H + em 7 ul. Recomendamos aumento do poder de tamponamento médio ou diminuindo a densidade celular para as amostras que excedem a alteração da unidade de pH 0,2 durante o tempo de medição. O tempo de medida pode também ser diminuída, mas isto pode diminuir a taxa de acidificação estado estacionário e introduzir um erro no cálculo da taxa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> A Figura 2 mostra os dados em bruto para uma experiência típica. Os últimos 10 pontos de medição a partir da gravação de ponto-a-ponto de tanto OCR e pH (sombreada barras verticais) foram utilizados para os cálculos. As preocupações iniciais de que o valor médio (medição ponto médio) de cada ciclo de ensaio não forneceria resolução suficiente de taxa para um cálculo preciso, nomeadamente no que parecia haver um ligeiro atraso entre a adição de porta e taxa de acidificação estado estacionário, não foram confirmadas, em que não se parecem contribuir significativamente para cálculo de erro (não mostrados). Como alternativa, se a capacidade de enchimento correto é inserido durante a configuração experimental, PPR pode ser lida directamente a partir da leitura do instrumento de coleta de dados, exibindo a saída PPR no software do aparelho ou no formato compatível com PC disponível como uma das definições de saída de dados. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. vestígios de fluxo extracelulares representativos de O 2 e H +. OCR e traça o pH para o exemplo experiência na Tabela 5, contendo 10 mM de glucose no início do ensaio. Port D tinham diferentes concentrações de HCl para a calibração de potência de tamponamento (não apresentados nestes rastreios em média). Dados de publicação anterior 6. Cada ponto representa a média ± SEM de n = 8 repetições biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A análise dos dados de resultados representativos Usando a planilha mostrada na Tabela 6 e fornecida como um anexo, valores de dados de poços individuais podem ser inscritos nas colunas mostradas com cabeçalhos amarelas. Todos os seis colunas para<html> à direita estão calculados a partir destas entradas. O exemplo na Tabela 6 mostra os cálculos de PPR e resp Glyc PPR usando ECAR e dados OCR a partir de poços individuais para as condições nativos com ou sem glucose adicionada, antes da Porta A adição de oligomicina. Repetições técnicas sobre cada preparação biológica são normalmente média para dar valores individuais das realizações nos últimos quatro colunas, em seguida, dados de diferentes preparações biológicas são calculados com a propagação adequada de estatísticas de erro no BP e destes quatro valores. <img alt="Tabela 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tabela 6. Cálculo dos respiratório e acidificação glycolytic. Colunas intituladas em amarelo indicam valores a serem inseridos a partir de cálculo (por exemplo, BP, max H + / O 2), ou de coleta de dados (por exemplo, tot ECAR, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">Por favor clique aqui para baixar esta tabela como uma planilha Excel .</a> Contribuições de glicólise e respiração para PPR após a correção A Figura 3 mostra a saída gráfica de dados calculados como na Tabela 6 para as taxas de acidificação nativas glicolítica e respiratório, as taxas de adição seguintes oligomicina (Porta A), e as taxas de adição seguintes FCCP (Porta B). Estes dados demonstram claramente como as proporções de mudança acidificação respiratória e glycolytic com escolha de substrato (glicose vs. controle (CTL) com nenhum extra) e com o status mitocondrial (função nativa vs. função farmacologicamente alterada). &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Figura 3. Proton taxa de produção (PPR) a partir de fontes glicolíticas e respiratórias. PPR da respiração (porções abertos) e glicólise (partes preenchidas) de células C2C12 calculado através da equação 5 com glicose adicionado (três barras da esquerda) ou sem glicose adicionado (três bares à direita). Os dados dos 6. Todos os dados representam a média ± SEM de n = 8 repetições biológicas.

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Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.9K visualizações.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

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Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Biologia

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...