O cuidado e uso de peixes gerado por resultados representativos descritos neste protocolo foi realizado em plena conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional do Hospital Infantil de Boston, protocolo nº 14-05-2673R.

1. Rotifer Cultura <ol><li> Componentes básicos de um sistema de cultura utilizando um recipiente de 100 L Cultura <ol><li> Reúna todos os componentes para a instalação cultura de rotíferos. A configuração cultura rotíferos consiste de um recipiente de cultura (CV) para cultivar as rotíferos; um recipiente semelhante para manter rotíferos desabastecimento dos silos (vaso de cultura desabastecimento dos silos, FCV); um frasco de fundo redondo de incubação (alimentação Reservoir, FR) para o armazenamento da mistura de alimentação algas (AFM); um suprimento de ar (AS) para arejar o CV, FCV e FR; uma bomba peristáltica com um temporizador de medição (PMT) para controlar o fornecimento de alimentos para as algas para o CV e FCV; e um filtro de partículas fio (FPF) que fica dentro do CV. NOTA: A lista completa de consumíveis e componentes é fornecida na Lista de Materiais. </li></ol></li><li> Configuração <ol><li> Eleve o CV e FCV em um carrinho ou mesa para que as culturas podem ser facilmente colhida através de um dreno encaixe em um cont coleçãoainer (Figura 1). Utilize uma tubagem de alimentação de ar flexível para ligar o AS a um comprimento de tubagem rígida em cada recipiente de cultura. Certifique-se de que a tubagem é suficientemente longo para fornecer ar para a parte inferior do CV ou FCV. </li><li> Usar uma linha de ar com pequena capacidade para ligar o AS a um comprimento de tubagem rígida que se estende para a parte inferior da FR que contém a AFM. Instale uma válvula em cada linha de ar para regular o fluxo de ar. Ligue o FR para o PMT com tubagem de alimentação, e rodar o tubo do PMT para um buraco perfurado no lado do CV / FCV, perto do topo. Figura 1. </li></ol></li><li> Comece <ol><li> Encher o vaso de cultura a 90% do volume disponível com água de osmose reversa (RO). Se RO não estiver disponível, usar, água limpa sem cloro municipal; No entanto, uma avaliação de risco a segurança biológica deve ser realizada para assegurar que não há organismos potencialmente patogénicos estão presentes na água da fonte. NOTA: Tal análise pode ser realizadapor qualquer laboratório de ensaio de água qualificado. </li><li> Dosear a água vaso de cultura com sal aquário para chegar a uma salinidade de 15 g / L. Definir o fluxo de ar para dentro do recipiente de modo a que mantém uma &quot;ferver&quot;, e, em seguida, adicionar lentamente a quantidade medida de sal para o recipiente de cultura até que esteja completamente dissolvido por o arejamento. Continue gaseificar a água for&gt; 1 hora para garantir que ele está totalmente oxigenado. </li><li> Faça a mistura de alimentação de algas. Para 3 L de limpo, sem cloro (0 ppm) de água doce adicione 100 g de NaHCO3 e 100 g de amoníaco neutralizador (hydroxymethylsulfonate de sódio). Este último reagente fornece o benefício adicional de neutralizar qualquer cloro residual da água da torneira ou água sanitária resíduos de desinfecção de equipamento de cultura. Ele é fundamental para garantir que estes compostos são totalmente dissolvido. Em seguida, adicionar 1 L de concentrado de algas (peso seco de biomassa ~ 15%). Adicione a mistura de alimentação para o FR e armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicionar uma cultura inicial de 5-10.000.000 <em&gt; rotíferos Brachionus plicatilis ao CV contendo o aerado 15 g / L salinidade da água. Se os rotíferos foram refrigerados durante o transporte ou armazenagem, devem ser gradualmente (durante 30 minutos ou mais) aclimatados à temperatura da água no vaso de cultura (25 - 27 ° C). </li><li> Ligue o PMT e começar a bombear a alimentação para o recipiente de algas de cultura de rotíferos. Usando o recurso de temporizador da PMT, definir a taxa de entrega de mistura de alimentação algas para que ~ 1,6 ml de mistura de alimentação algas é entregue por milhão de rotíferos na cultura, por dia. Distribuir as alimentações em pequenas porções, a intervalos regulares ao longo de um período de 24 horas; a mais frequente das mamadas, o melhor. </li><li> Calibrar a taxa de entrega da bomba rodando manualmente na PMT por um determinado período (por exemplo, 1 min) e recolher as algas que ele bombeia durante este intervalo em um cilindro ou proveta graduada. Por exemplo, se as doses de CGP 5 ml de algas em 1 min, em seguida, a taxa de dose seria5 ml de algas / min. </li><li> Calcula-se a taxa de alimentação diária requerida através da multiplicação do número de rotíferos presentes, em milhões, por 1,6 ml. Por exemplo, uma cultura de rotíferos com um tamanho da população de 100 milhões de rotíferos exigiria ~ 160 ml de ração por dia (100 x 1,6 mL). </li><li> Defina a PMT para dosar a exigência alimentação diária total em intervalos regulares ao longo de um período de 24 horas. Por exemplo, a entrega de uma quantidade diária total de alimentação de 160 mL pode ser entregue em porções, uma vez a cada 3 horas ao longo de um período de 24 horas utilizando um conjunto PMT com uma taxa de bombagem de dosagem de 5 ml / min, durante 4 min, 8 vezes por dia (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 alimentações = 160 mL). </li><li> Permitir que a cultura a crescer até que ele gera a população necessária, normalmente para 48-72 h, antes da colheita. Aos 24 h pós-arranque, adicione os filtros de partículas fio dental para o recipiente de cultura e começar a manutenção normal. </li></ol></li><li> Manutenção NOTA: A cultura opera em uma base contínua e exige routinmanutenção e que, idealmente, deve ser realizada ao mesmo tempo em cada dia, na seguinte sequência. <ol><li> Encha o FCV a 90% do volume disponível com limpo, sem cloro água doce, dosados ​​com / L sais aquário de 10 g. Assegure-se que a água é bem misturado, e que todo o sal estar completamente dissolvido. Definir o fluxo de ar para dentro do recipiente de modo a que mantém uma &quot;ferver&quot;. Meça a salinidade com um refratômetro e garantir que a salinidade é de 10 g / L. É fundamental para atingir este objectivo e não exceder esse valor. </li><li> Experimente os rotíferos no CV: Certifique-se de que a cultura é bem misturado, em seguida, recolher amostras de 3 por 2 - 3 ml cada um usando uma pipeta de transferência ou autopipettor, a partir de diferentes partes da cultura. Ao combinar estas amostras em um tubo ou frasco de tamanho conveniente (por exemplo, 10 ml). </li><li> Transferir 1 - 2 ml da amostra combinada para uma placa de Petri de modo que possa ser visualizada sob um microscópio de dissecação. Para verificar a qualidade da cultura (do comportamento de nataçãorotíferos, presença de ovos isoladas, contaminando protozoários). </li><li> Imobilizar os rotíferos na amostra combinada restante através da adição de 100 ul de 50% de solução de iodo de Lugol a amostra. Em poucos segundos depois da adição dos Lugols, observar os rotíferos para parar de nadar. Agora, conte facilmente os rotíferos. NOTA: O etanol, água sanitária diluída, ou o vinagre pode ser usado em lugar de Lugol. Vinagre (2 gotas / 10 ml) tem a vantagem de ser não perigosos, não perder resistência ao armazenamento em soluções de branqueamento e de iodo pode, e não fazendo com que o contrato de rotíferos, de modo que a coroa de cílios e o &quot;pé&quot; permanece estendido e o animais olhar mais natural. </li><li> Garantir que a amostra é bem misturado (rotíferos imobilizadas vai resolver rapidamente), em seguida, tomar rapidamente uma ml subamostra ~ 2 em uma pipeta de plástico e dispensam 1 ml em uma contagem de slides Sedgewick-Rafter (20 x 50 quadrados de 1 mm) (Figura 2 ). Usando um microscópio de dissecação ou composto, contar os rotíferos intactas e a total número de ovos associadas a estes rotíferos (Figura 2). Contagem tanto da área de slide como necessário contar ~ 100 rotíferos. Calcule o número de rotíferos por ml, e gravar isso em uma planilha ou um diário de bordo. </li><li> Colheita ~ 30% do volume dos rotíferos na cv: Remover o fornecimento de ar e filtro de fio, abrir lentamente a válvula na parte inferior da CV e permitir que a água flua para dentro de um colector de plâncton com um crivo de malha 53 | im. Recolher a água que flui para fora do fundo do colector depois de filtrar dentro de um balde ou de drenagem. Use uma suave para o fluxo moderado para evitar danos aos rotíferos. Não permita que os rotíferos para secar na tela. </li><li> Por razões de consistência, é conveniente estabelecer o FCV com um número padrão de rotíferos cada dia. Portanto, com base no volume CV densidade de rotíferos e colheita conhecido, ajustar o volume total de FCV para alcançar uma densidade final coerente (por exemplo., 1500 rotíferos / ml). Adicione o roti colhidaferências ao FCV: Gentilmente transferir os rotíferos a partir da tela da coleção utilizando um frasco de lavagem preenchido com água salgada limpo (10 - 15 g / L). Inverter a tela sobre o FCV e lavar os rotíferos no FCV com um fluxo suave de água salgada. Inicie a PMT para entregar alimentos para animais (~ 1,57 ml por milhão de rotíferos por dia) para o FCV. </li><li> Esfregue todo o interior do CV com uma escova de nylon limpo e macio ou uma almofada matagal. </li><li> Fazer uma nova mistura de 15 g / L de água, adicionando a quantidade apropriada de sal a uma quantidade medida de água RO limpos em um balde de 5 galões para substituir o volume de água perdida para a colheita. Adicionar o sal à água no balde e agita-se vigorosamente até que esteja completamente dissolvido, e em seguida, adicionar ao CV. </li><li> Usando um spray de alta pressão em uma pia, lavar o filtro fio até que ele esteja livre de detritos, e, em seguida, devolvê-lo ao CV. </li><li> Ajustar as taxas de alimentação de algas entregue ao CV, alterando a duração de cada evento de dosagem, de acordo com a contagem diária de rotíferos / ml.Use os cálculos apresentados no passo 1.3.8, acima, para determinar a quantidade adequada de alimentação para ser entregue. </li><li> Aproximadamente 24 horas mais tarde, repita o processo. Comece a colheita das rotíferos restantes no FCV (que não eram necessários para o dia anterior) da mesma maneira como descrito acima (etapas 1.4.2 - 1.4.10). Concentrá-las em 2 L de água fresca e limpa sem cloro (5 g / l de sal). Estes podem ser armazenados a 4 ° C, como uma fonte de apoio, ou usado para alimentar fases posteriores de peixe, para além do que é descrito neste protocolo. NOTA: Este protocolo permite até 2 - 3 dias de manutenção de cultura reduzida (com alimentação automática normal), porque os rotíferos no CV pode tolerar a omissão de colheitas sem consequências graves. </li></ol></li></ol> 2. A policultura <ol><li> Configuração <ol><li> Coletar embriões de peixe-zebra de um evento de desova por vazamento embriões gerados através de um coador de chá e, em seguida, enxaguar cuidadosamente com fis estéreish de água (ou qualquer outra fonte de não-contaminada da solução apropriadamente condicionado, por exemplo, meio de embrião, E3, etc.) a partir de um frasco de lavagem em placas de Petri. </li><li> Incubar os embriões a 25 - 28 ° C em placas de Petri a uma densidade de 40 - 50 embriões por placa durante 5 dias. </li><li> Começar a fase de policultura no dia 5 pós-fertilização, ou quando maior do que 90% das larvas eclodidas natação são activamente-se na coluna de água. </li></ol></li><li> Inoculação <ol><li> Adicionar 500 ml de cultura de rotíferos directamente a partir do FCV a um tanque de viveiro 3,5 L; inclusão de água cultura de rotíferos fornece alimentação de algas que mantém o conteúdo nutricional dos rotíferos durante policultura. </li><li> Delicadamente despeje a larvas de uma placa de Petri para o tanque viveiro. Assegure-se que nenhuma larva permanecem no prato. </li><li> Adicionar 500 ml de água limpa e peixes condicionado a partir de um sistema de recirculação de água ou fonte dedicada ao tanque para atingir um volume final de 1 L e um s definitivaalinity de 5 g / L. NOTA: Este salinidade é fundamental, porque a sobrevivência larvas do peixe será negativamente impactada se a salinidade é&gt; 7 g / L e sobrevivência rotifer será negativamente impactada se a salinidade &lt;2 g / L. </li></ol></li><li> Fase policultura NOTA: A fase policultura deve durar até 4 dias após a inoculação (de um total de 5 dias, correspondendo a 5-9 dias pós-fertilização). <ol><li> Observe a policultura tanque pelo menos uma vez por dia durante este período para garantir que os rotíferos e peixes estão presentes e em crescimento. Certifique-se de que os rotíferos são visíveis em toda a coluna de água. Certifique-se de que os os fishs também são visíveis na coluna de água, nadando entre os rotíferos. </li><li> Iniciar o fluxo normal de água através do tanque. Coloque uma tela ou defletor sobre o porto de drenagem para garantir que as larvas não são lavadas para fora do tanque. NOTA: No final desta fase, o peixe vai ser grande o suficiente para consumir itens maiores presas, como Artemiaitens de alimentação náuplios ou processados ​​na faixa de tamanho de 75-125 mm. NOTA: As dinâmica das populações de rotíferos dentro de um tanque de policultura representante foram medidos por amostragem / rotíferos contando a partir do tanque da mesma maneira como descrito nos passos 1.4.2 - 1.4.5. Isto foi realizado uma vez por dia desde o início da fase de policultura até que foi completada. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Henry CE é empregado por Reed Maricultura, Inc., uma empresa que fornece rotíferos, concentrados de algas, e outros suprimentos para os mercados amadores da aquicultura e da pesca.

A implementação bem sucedida do método policultura rotifer para a alimentação de peixes-zebra larval precoce exige protocolos eficazes para duas tarefas: o estabelecimento e manutenção de um sistema de cultura de rotíferos contínua para alimentar os peixes, e cultura de primeira alimentação larvas do peixe junto com rotíferos no mesmo tanque. A configuração para um sistema de produção de água salgada rotifer contínua para os laboratórios de peixe-zebra primeiro descritos p...

O peixe-zebra (Danio rerio) é um animal de laboratório pré-eminente utilizada em um número crescente de disciplinas científicas, incluindo, mas não limitado a genética do desenvolvimento, toxicologia, o comportamento, a aquicultura, biologia regenerativa, ea modelagem de muitas doenças humanas 1 - 5. Embora a espécie é relativamente fácil de manter em laboratório, há uma série de desafios de gestão associados à sua cultura 6. A mais proeminente delas é larvicultura, especialmente quando o peixe primeiro começa a alimentar a inflação subseqüente à bexiga de gás 7. Sob condições normais, controlados, este evento desenvolvimento ocorre na ~ 5 dias pós-fertilização (dpf), com os seguintes 3 ​​- 5 dias de crescimento, sendo particularmente crítico 7. A dificuldade técnica central durante este estágio é atender adequadamente as exigências nutricionais do primeiro larvas alimentação - itens de alimentação deve ser de tamanho adequado, Digestible, atraente e disponível em uma base quase contínua, sem a criação de desperdício excessivo em tanques de cultivo. Historicamente, este foi alcançado normalmente através da apresentação de numerosas pequenas quantidades de alimentos para os peixes em tanques, junto com a rotina 8,9 troca de água. Enquanto estes métodos são, até certo grau de sucesso, eles não são eficazes, requerem entradas de trabalho elevadas, e retornar única variável e as taxas de crescimento limitadas e sobrevivência de 10. Na natureza, larvas do peixe, presumivelmente, se alimentam de zooplâncton abundante pequeno presente na coluna de água 11. Por esta razão, os protocolos que incorporam larvicultura live feeds, tais como Paramecium, rotíferos e Artemia são tipicamente mais eficiente 7. Em 2010, Best e co-autores demonstraram que era possível crescer zebrafish larval em água salobra estática, juntamente com rotíferos de água salgada para os primeiros 5 dias de alimentação exógena 12. Esta abordagem, que aproveitares a alta produtividade natural de culturas de rotíferos para fornecer amplo, presa altamente nutritivos sem poluir a água, produz muito elevadas taxas de crescimento e sobrevivência das larvas com entrada de baixo de trabalho 12,13. Nos últimos anos, um número crescente de laboratórios em todo o mundo adotaram variações deste protocolo, e muitos estão agora a cultura de rotíferos de forma contínua para apoiar os sistemas de viveiro 14. Ao longo dos últimos anos, os métodos para ambos rotifer / policultura peixe-zebra e produção de rotíferos foram aperfeiçoada e melhorada para se tornar mais padronizado e facilmente escalável. Este artigo fornece instruções passo-a-passo para 1) produção de rotíferos contínuo e robusto e 2) o estabelecimento do sistema / policultura peixe-zebra rotifer usado para apoiar o crescimento robusto de peixe para os primeiros 5 dias de alimentação exógena.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Infrastructure</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">100 Liter Culture Vessel</td>
			<td style="width:135px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:264px;">Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">5 Gallon Culture Bucket Kit</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">CCS Starter Kit</td>
			<td style="width:264px;">Small volume culture vessel for small facilities</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing 1/2&#34; O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Mesh tube</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">RT444X</td>
			<td style="width:264px;">Mesh tube support for floss filter</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rotifer Floss</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotifer floss 12&#8221; x 42&#8221;</td>
			<td style="width:264px;">Particulate waste trap</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td>
			<td style="width:135px;">Grainger</td>
			<td style="width:119px;">38M003&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture)</td>
			<td style="width:135px;">Coral Vue</td>
			<td style="width:119px;">SKU: IC-LQD-DSR</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Silicone Tubing&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;">Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing &#34; O.D.,36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for algae delivery</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifers</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Type L 5 million</td>
			<td style="width:264px;">Rotifer stock culture for system startup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Feed</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Sodium hydroxymethylsulfonate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">ClorAm-X&#174; 1lb tub</td>
			<td style="width:264px;">Ammonia reducer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S25533B</td>
			<td style="width:264px;">pH buffer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Microalgae concentrate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotigrow Plus&#174; 1 liter bag</td>
			<td style="width:264px;">Nutritionally optimized rotifer feed</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Water Preparation</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:305px;">&#160;Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:135px;">That Fish Place</td>
			<td style="width:119px;">198210</td>
			<td style="width:264px;">Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Refractometer</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SR6</td>
			<td style="width:264px;">measuring salinity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Plankton Collectors 12&#34; Dia, 53 microns</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">BBPC20</td>
			<td style="width:264px;">Mesh screen for collecting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Scrub Pads</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SCR-58</td>
			<td style="width:264px;">Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Scrub Brush</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Bucket</td>
			<td style="width:135px;">Grainger Supply&#160;</td>
			<td style="width:119px;">43Y530</td>
			<td style="width:264px;">Graduated bucket for mixing culture water</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Hatching Jar</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">J30</td>
			<td style="width:264px;">Storage of algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Lugol&#8217;s Solution, Dilute</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S99481</td>
			<td style="width:264px;">Agent used to immobilize live rotifers for counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Eco-Systems</td>
			<td style="width:119px;">M415</td>
			<td style="width:264px;">Counting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Miscelleneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Tea Strainer</td>
			<td style="width:135px;">Kitchenworks</td>
			<td style="width:119px;">971972</td>
			<td style="width:264px;">Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

O sistema de cultura de rotíferos contínuo descrito aqui é dinâmica, e é normal que os números de rotíferos a flutuar numa pequena extensão ao longo do tempo se há variações nas taxas de alimentação e de colheita diárias. A população das rotíferos em uma das culturas activas nas instalações de aquacultura do Hospital de Crianças de Boston, mantida na forma descrita acima, foi monitorizado durante 30 dias (Figura 3). A densidade da cultura médio duran...

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The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

A completa e atualizada &quot;Rotifer policultura Method&quot; para a criação de Primeira Zebrafish Alimentar

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.3K visualizações.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Biologia do Desenvolvimento

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...