Os autores gostariam de agradecer a Tammy Esmaili por sua assistência na gestão de consumíveis de laboratório. AA é o destinatário de uma Bolsa de Doutoramento do Centro de Excelência para a Investigação da Doença de Alzheimer e Cuidados, Faculdade de Ciências Médicas, Edith Cowan University. MC recebe doutoramento apoio financeiro do Rotary Club, Perth. AM, GV, KT, e RNM são financiados pela fundação britânica Alzheimer Research McCusker.

1. Manutenção do Sistema <ol><li> Peixe-zebra são mantidos em um sistema de circulação que continuamente filtros e areja o sistema de água para manter a qualidade da água necessária para um ambiente aquático saudável. O sistema de circulação também ajuda a filtrar o excesso de alimentos e fezes dos peixes. Diferentes empresas fornecer sistemas de peixe-zebra, mas nós usamos sistemas de habitats aquáticos, EUA, em nosso laboratório. A temperatura ambiente ou a temperatura do reservatório é geralmente mantida entre 26-28,5 ° C e as condições de iluminação são 14:10 h (luz: escuridão). Um sistema de zebrafish de habitats aquáticos (por exemplo, sistema de bancada) custos ~ 9.000 USD. Este sistema de bancada com duas prateleiras pode conter seis de 10 litros, 12 litros, 3, 20 ou 1,5 litros tanques em cada prateleira. Várias linhas de peixe (por exemplo, transgénica, o tipo selvagem mutante) também pode ser alojado no mesmo sistema. </li><li> Um conjunto de diferentes tipos de filtros são usados ​​no sistema. No nosso sistema de água, a partir de todos os tanques passes através de um filtro de 120 micron almofada, de 50 micron canister filtro, filtro biológico, de carvão activo de absorção do filtro e filtro de desinfecção UV antes de ser circulado de volta para o tanque. Água De-chlorinated/aged é usado no sistema de peixe-zebra. A água pode ser de-clorados por envelhecimento durante pelo menos 48 h. Sob condições ideais, a água deve ser mantida num reservatório com uma bomba de circulação da água para o manter quente, e de acelerar a cloração. </li><li> O pH da água do sistema deve ser verificada diariamente e mantido entre 6,8 e 7,5. Quando necessário, o bicarbonato de sódio deve ser utilizado para aumentar o pH. </li><li> Tanques de peixes devem ser limpos regularmente. Para a limpeza de um tanque de peixe, fechar o fluxo de água para este tanque, drenar o excesso de água por tanque a inclinação para trás e para remover o tanque cuidadosamente a partir do sistema. Crescimento sujeira e algas serão aparentes na parte inferior e nos lados do tanque. </li><li> Coloque o defletor em um tanque limpo, e encha com água de-clorada (aka Sistema water). Transferir cuidadosamente o peixe para este tanque com uma rede de pesca. Fechar a tampa e transferir a etiqueta com o nome do tanque. Com cuidado, coloque o tanque limpo no sistema e ligar o abastecimento de água. </li><li> Para descontaminar o peixe líquido, spray com etanol 70%, lavar em água, e deixe secar antes de voltar a usar. Remova a placa defletora do tanque sujo e pulverizar as duas partes com etanol a 70%. Enxaguar abundantemente com água corrente e permitir que o tanque e defletor para secar completamente antes de voltar a usar. </li><li> Os filtros do sistema de circulação têm de ser verificadas e alteradas regularmente para assegurar a sua devida função. Estes filtros devem ser trocados regularmente para garantir o abastecimento de água adequado e limpo para todos os tanques de peixes. </li><li> O 120-micron almofada do filtro é normalmente reposicionado ou substituídos diariamente; reposicionar para o fluxo de água para usá-lo completamente, antes de substituir por uma nova. </li><li> O filtro Canister devem ser mudadas semanalmente. Para alterar o filtro da vasilha, retire o filtro torcendo formigaiclockwise com uma chave ou mãos. Coloque uma folha de plástico ou uma toalha abaixo para evitar ou absorver o derramamento de água. Substituir o filtro da vasilha com um novo e encaixar a unidade de volta para o sistema de filtro, aperte cuidadosamente com as mãos e uma chave, se necessário. </li><li> O filtro de carvão deve ser mudado quinzenal (de duas em duas semanas). Para trocar o filtro de carbono, remova a unidade de filtro de carbono cuidadosamente com uma chave. Descarte o carbono utilizado ativado e substituí-la com carvão ativado novo. Volte a colocar o suporte de carbono e colocá-lo de volta para a unidade de filtro. Encaixar a parte de trás da unidade de filtro dentro do sistema. Ligar o sistema e verificar se a água está a fluir para o filtro. Se necessário, lave um pouco de água através das tubulações para limpar a sujeira na tubulação antes de instalar o filtro no sistema. </li><li> O filtro biológico deve ser limpa a cada seis meses. Um filtro biológico é geralmente localizado entre o cilindro e do filtro de carbono no sistema de circulação. Para alterar o filtro biológico, remove a unidade de filtro a partir do sistema. Libertar a pressão do filtro, premindo o botão de libertação da pressão. Desaperte o filtro com uma chave. Geralmente são necessárias duas pessoas para esta etapa. Remover a tampa da unidade de filtro. Esvaziar o conteúdo do filtro para dentro de um recipiente peneirado para separar o siporax da água. Nota: Siporax é uma multa de poros bio-filtro de mídia que tem a capacidade de executar tanto de nitrificação e desnitrificação. </li><li> Se o siporax é muito sujo substituí-lo com o novo. Preencha o filtro com água do sistema (de-água clorada), feche a tampa, volte a unidade de filtro para o sistema e ligar o abastecimento de água. Nota: Em um aquário aclimatados, o siporax será o lar de várias bactérias nitrificantes. Estes microrganismos são essenciais para a manutenção do ciclo do azoto no interior do aquário, e remover o compartimento principal para o filtro biológico (o siporax sujo) pode resultar em um pico de amónia grave, acompanhada por um pico de nitrito, enquanto o new filtro biológico (com siporax novo) é re-estabelecer. Ambos estados intermediários do ciclo do nitrogênio pode ser tóxico para os organismos aquáticos, e pode matar peixe-zebra se não respondeu adequadamente. Portanto, é importante dispor de um filtro biológico secundário em outras partes do sistema de alojamento do peixe (por exemplo, no tanque de recolha de sistema de habitats aquáticos) para permitir que o repovoamento rápida destes microrganismos importantes na siporax novo. </li><li> Filtros UV são utilizados para controlar os contaminantes de sistemas biológicos (por exemplo, bactérias), e deve ser substituído a cada 9-10 meses. Deve notar-se que a taxa de dose de UV filtro de desinfecção é ~ 110 mJ / cm 2, no início da vida da lâmpada e diminui a taxa de dose ao longo do tempo, pelo que é necessária a substituição do globo, mesmo quando ele parece estar ainda funcional. </li></ol> 2. Alimentação <ol><li> Peixe-zebra pode ser alimentado com ração seca (tamanho de alimento a partir de 100 micra para t larvaso 300/400 microns para peixes adultos) ou alimentos vivos (camarão de água salgada). Artémia (Artemia sp.) Ovos estão disponíveis em lojas de animais locais e pode ser chocado em laboratório, seguindo os passos descritos abaixo. <ol class="lalpha"><li> Dissolver o sal do mar vermelho envelhecido em água, colocando uma proveta com o sal em um agitador magnético para uma melhor solubilidade. Alternativamente, o sal pode ser dissolvido em água por arejamento com o tubo de arejamento. Sal Instant Ocean também pode ser usado como uma solução de incubação, se o sal do mar vermelho não está disponível. Camarões de água salgada pode tolerar uma ampla gama de salinidade, no entanto, que eclodem nosso artémia (10-15 g) em 30-35 g / L de água salgada do mar vermelho. Nota: Em caso de Artemia salina ovos não estão facilmente disponíveis nas lojas de animais locais, em seguida, salmoura camarões encapsulados pode também ser utilizada depois de &quot;decapping&quot;-los em lotes antes de adicioná-los para a incubadora de camarão. Isso também pode evitar as viagens frequentes à loja de animais. </li><li> Preencha o nascedouro camarão de água salgada com salt de água e adicione os ovos de camarão a uma concentração de 1,2 colheres de sopa / litro. Arejar o nascedouro vigorosa, com uma bomba de ar e deixar os ovos para chocar camarão de água salgada para ~ 48 h. Nota: Deve notar-se que un enriquecido artémia perder valor nutricional de hora a hora após a eclosão. Por isso, pode ser apropriado ou escotilha durante 24 hr ou 48 hr enriquecer mais a fim de obter o máximo valor nutricional do artémia. </li><li> A água residual do sistema de incubação é adicionado aos resíduos de quarentena para ser desinfectados com lixívia e eliminados mais tarde. </li></ol></li><li> Para recolher os camarões salmoura, retirar o tubo de ar e permitir que a cultura que se contentar com 4-5 minutos, mas não mais de 10 min. Os camarões de água salgada nascidos reunir na parte inferior da Hatcher. <ol class="lalpha"><li> Colete camarões salmoura utilizando a torneira no fundo da incubadora. Descartar o fluxo inicial, que consiste em não-nascidos de ovos camarão de água salgada. </li><li&gt; Após descartar os camarões não-nascidos salmoura, recolher os camarões de água salgada nascidos que serão utilizados como alimento do peixe-zebra. </li><li> Separe os camarões de água salgada da água salgada, usando uma rede de coleta de salmoura camarão (~ 350 malha de nylon micron). Lave os camarões de água salgada a partir da rede em um recipiente com água do sistema. </li></ol></li><li> Os camarões salmoura recolhidos estão geralmente presentes em concentração elevada no fundo do recipiente dando-lhe uma cor, em vez de laranja. </li><li> Alimentar os camarões de água salgada para o peixe-zebra com uma pipeta ou um frasco conta-gotas / squeezy. A quantidade de alimento distribuído depende do tamanho da população dos tanques individuais. A relação geralmente aceite para o peixe-zebra consiste em receber a 4% do peso corporal em alimento por dia. Zebrafish nunca deve ser superalimentados pois isso pode aumentar o nível de nitrato na água, possivelmente afetando a sua reprodução, ou viabilidade, como alguns peixes podem morrer devido a excessos. <ol class="lalpha"><li> Após a injeção de alimentos para opeixes de água, com fome nadar para pegar os camarões de água salgada. </li></ol></li><li> Alimentação seca pode ser realizada através de um ecossistema aquático de / habitats aquáticos simples primavera baseada dispensador comida de peixe. Alternativamente, alimentação seca também pode ser realizada usando uma colher ou por corte simples, um conta-gotas de plástico com uma tesoura na diagonal para dar-lhe uma aparência de uma pequena colher. </li></ol> 3. Criação <ol><li> Zebrafish iniciar reprodução no início da luz. Ovos fertilizados podem ser obtidas através no tanque de criação ou reprodução em pares. Enquanto que em tanque de criação é um trabalho mais eficiente e é implementada para coleta de embriões regular em nosso laboratório, criação de pares é o preferido quando os genes ou mutações devem ser selecionados a partir de peixe. </li><li> Por no tanque de criação, o criador montar-tanque e cair lentamente para o tanque de peixes após o aparecimento de luz. Em alternativa, no tanque de reprodução de set-up podem ser deixadas durante a noite no aquário. </li><li> Lbeiral do reprodutor no tanque por cerca de 15 min para permitir que o peixe para acasalar antes de remover o criador do tanque e recolher os ovos. </li><li> Criação de pares-se habitualmente no final da tarde após a alimentação. </li><li> Monte o tanque de criação e preenchê-lo com água do sistema de idade. </li><li> Transferir uma fêmea e um macho para lados opostos do tanque de reprodução. As fêmeas podem ser distinguidos dos machos, devido à sua maior ventre. Os machos podem também ser distinguidos das fêmeas, porque eles são mais delgados e de cor mais escura do que as fêmeas. Além disso, os machos têm coloração mais amarelo na barbatana anal entre mulheres (ver Figura 1). Ao olhar em dúvida para o ovipositor no peixe-zebra fêmea (ver Figura 4). </li><li> Remover o divisor na manhã seguinte logo após o início da fase iluminada. Permitir que o acasalamento ocorrer em repouso durante 20 min ou até que um número suficiente de embriões são colocados no fundo do tanque. </li><li> Após o acasalamento,devolver o peixe para os seus tanques. Recolher os ovos usando um filtro. </li><li> Lavar os embriões cuidadosamente com água do sistema. </li><li> Transferir os embriões para uma placa de Petri, por lavagem do filtro com meio de embrião; aka EM3 (NaCl, 13,7 mM; KCl, 0,54 mM; MgSO4, 1,0 mM; CaCl 2, 1,3 mM, Na 2 HPO 4, 0,025 mM; KH 2 PO 4, 0,044 mM; NaHCO3, 4,2 mM). </li><li> Os embriões podem ser observados ao microscópio. Os ovos fertilizados são então separados dos ovos não fertilizados, usando uma agulha e uma pipeta (ver Figura 3). </li></ol> 4. Levantamento de larvas <ol><li> Os ovos fertilizados são mantidos na incubadora (~ 28,5 ° C) durante 72 horas até que as larvas tenham eclodido. </li><li> Agora as larvas estão fora do córion e natação livremente eles estão prontos para transferir para um tanque de peixes principal. As larvas devem ser alimentados a partir de 5 dias pós-fertilização (dpf) e são mantidas em meio de embrião (composição descrita noParte 3, 10) ou de água do sistema. As larvas podem ser mantidas em pratos redondos com ~ 50% ou mais de água nele mudado diariamente. A troca de água deve incluir a remoção de larvas mortas ou doentes e qualquer outros detritos. </li><li> Transferir as larvas suavemente para dentro de um tanque que contém um deflector de tamanho pequeno (cerca de 300-400 microns). Larvas mortas e doentes devem ser removidos e alguns mililitros de água deve ser adicionado lentamente, numa base diária. </li><li> Após 14 dias, os tanques de larvas podem ser arquivados no sistema, e é fornecido com uma pequena corrente de água de ciclismo (1-2 gotas por segundo). Como as larvas crescem, o fluxo de água pode ser aumentada. Os tamanhos diferentes de placas deflectoras pode ser utilizado, dependendo do tamanho das larvas (por exemplo, tamanho do deflector 300-400, 500, 700-750, e 1000 microns) e um deflector de plástico normal, devem ser usados ​​para o peixe adulto. </li><li> Ele normalmente leva três meses para os embriões se desenvolvem em adultos sexualmente maduros. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Zebrafish origem no rio Ganges, no norte da Índia e estão se tornando populares em pesquisa, tanto adulto e sua larva 2, revisado por Spence et al. 3. Peixe-zebra possuem várias vantagens sobre outros modelos animais, tais como elevada fecundidade, facilidade de manutenção, a depuração óptico de embriões, o desenvolvimento embrionário rápida e baixo custo de manutenção. Eles são passíveis de manipulação genética 6 e adequado para rastreio de alto rendimento de drogas 4,5. Sua fertilização é externa que é vantajoso para a sua utilização pelos biólogos do desenvolvimento. Devido a estas características favoráveis, zebrafish estão ganhando popularidade em genética 7, 8 farmacológica e pesquisa comportamental 9,10. Há um número de desafios para a manutenção de uma instalação de criação de peixe-zebra e para a obtenção de embriões de peixe zebra. Aqui, descrevemos nossas experiências e recomendações para enfrentar esses desafios e Øutline um protocolo para a manutenção do sistema, alimentação, reprodução e criação das larvas. Manutenção do sistema Para manter o peixe-zebra em condições saudáveis, é importante proporcionar-lhes com um ambiente limpo, em um sistema de aquário que funcione correctamente. Uma parte importante deste sistema é a troca dos filtros regularmente, de modo que todos os tanques de receber o fluxo de água adequada e água limpa. É vital para evitar a interrupção do fornecimento de água de bicicleta para cada tanque devido às tubulações do sistema bloqueadas. Os tubos podem ser limpos com um caudal mais elevado do que a pressão normal de água e se o bloqueio ocorrerá. O ideal, em torno de 10% da água do sistema deve ser substituído diariamente para manter a boa qualidade da água. Alternativamente, a água pode ser substituído enquanto mudando a vasilha ou filtro de carbono. Isto assegura que a sujidade depositada nos tubos de ligação destes filtros é removido. A qualidade da água deve ser verificado em uma base regular. Parâmetros como pH, alcalinidade, temperature, dureza, amônia, oxigênio dissolvido, salinidade e condutividade devem ser considerados como fatores importantes para representar a qualidade da água do sistema (ver Tabela 2 para detalhes). No mínimo, nitrato, pH, temperatura e devem ser monitorados em uma base regular para assegurar a boa qualidade da água para o peixe-zebra habitação. Ideal nitrato (NO 3 -), os níveis são &lt;50 mg / L 11, se estes níveis elevados pode ser reduzida através da substituição da água do sistema de circulação com a água do sistema de fresco. Ocasionalmente, os filtros não se encaixam bem e vazar por isso recomenda-se verificar se há algum vazamento após uma mudança de filtro. Se o fluxo de água do reservatório principal está bloqueada ou depois de alterar a bomba de água ou a alteração de um filtro, o caudal de água pode ser restaurado ou desapertar ou remover o filtro durante alguns segundos, para eliminar quaisquer vácuo sendo gerada nos tubos. O tempo necessário para mudar os filtros podem variar dependendo de vários factores tais como o total de carga biológica on do sistema, limpeza de filtros de outros, e sujidade depositada nos tubos. Assim, os filtros devem ser imediatamente alterado se eles aparecem sujos ou se todos os tanques não estão recebendo o abastecimento de água correta. Recomenda-se também de que a rede de pesca ser limpa com etanol a 70%, e enxaguada em água para descontaminar, e deixou-se secar antes de ser reutilizado. Secagem garante a evaporação do etanol, que de outra forma é tóxica para os peixes. A maioria dos sistemas de peixe-zebra de usar-clorados água da torneira, no entanto, alguns sistemas utilizam água desionizada. É importante manter a condutividade da água do sistema entre 300 e ~ 1500 uS pois isso reduz a energia do peixe tem de manter os sais do corpo. Portanto, peixe-zebra não podem ser mantidas em água desionizada, a menos que os sais são adicionados para manter os níveis de condutividade óptimas. Existe o risco de possíveis concentrações de cobre elevadas no sistema de água se a água da torneira é usado porque o filtro de carvão não remover o cobre. Assim, users deve verificar se as concentrações de cobre e evitar cobre tubulação onde for possível. Alimentação Zebrafish nunca deve ser superalimentados pois isso pode aumentar o nível de nitrato na água, possivelmente afetando sua criação 11, ou viabilidade, como alguns peixes podem morrer devido a excessos. Recomendamos não fornecendo mais alimentos durante qualquer uma alimentação de um tanque de peixes pode terminar dentro de 10 min. É muito importante para remover o sal da salmoura antes de os camarões alimentá-los para o peixe-zebra, como a concentração de sal em excesso provoca a morte. Se mais ovos zebrafish são requeridos, os peixes podem ser alimentados três vezes por dia. Limpeza dos tanques de peixes reprodutores diária também melhora os níveis de produção de ovos. Ao alimentar os sistemas aquáticos Habitats costumamos desligar a bomba de água e bomba de ar para permitir que o peixe para comer a comida para 10 min. Isso diminui a quantidade de alimentos que é arrastado para os filtros. No entanto, os usuários devem ter o cuidado de reaisbrasa para ligar as bombas novamente mais tarde. Criação Zebrafish são geralmente em condição de reprodução ideal entre a 3 e 18 meses de idade. Criação de pares não deve ser realizado durante dois dias consecutivos 11, porém, no tanque de criação pode ser realizado diariamente como um tanque pode conter muitos peixes que reduz a possibilidade de o mesmo par de peixes que estão sendo criados por dois dias seguidos. Reprodução deve ser feita em intervalos regulares, mesmo se os ovos não são necessários. Este processo irá assegurar o ciclo de reprodução do peixe é mantido. Recomenda-se que existem mais mulheres que homens em uma criação de set-up. Zebrafish Masculino mudar suas parceiras em um 12 base diária, que apóia essa recomendação. Além disso, dentro do nosso laboratório que inicialmente teve problemas com a reprodução, no entanto, usando mais mulheres que homens em uma criação de set-up ajudou a resolver o problema. Além disso, a alimentação com um alto teor de proteína content dieta e artémia 2-3 vezes por dia, a partir de tanques de peixes de mistura diferentes (de pais diferentes), mantendo a temperatura da reprodução set-up entre 27 e 28 ° C, e apertando as barrigas das fêmeas com tubos de ovário bloqueadas usando massagem suave melhorada produção de ovos. Recomendamos manter um registro de linhas de peixe / origens para evitar in-breeding entre irmãos. Isto melhora ainda mais a produção de embriões. Manter um registro do número de embriões definidos por peixes de cada tanque também é recomendado. Isto ajuda com a manutenção de uma faixa de tanques de piscicultura melhores e tomando medidas para melhorar a reprodução nos peixes não colocar ovos. Levantamento de larvas Alimentação das larvas deve começar a partir de 5 dpf (dias fertilização post). Larvas jovens podem ser alimentados com ração seca de ~ 100 microns de tamanho (por exemplo, ZM100) ou alimento vivo, como paramécio e rotíferos (que estimula o crescimento). O tamanho de alimentos pode ser aumentada lentamentea 200 microns (por exemplo, ZM200) ou 300/400 microns (por exemplo, ZM300). A população de peixes adultos devem ser em torno de 6-7 peixe por litro de água. Esta prática é recomendada para uma melhor manutenção de DBO (Demanda Biológica de Oxigênio) para os tanques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafish sistema circulante </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> AHAB autônomo, de bancada sistemas </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Dispensador de comida de peixe / alimentador alimento seco </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> AH19 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Olimpo </td><td> SZX12 </td><td></td></tr><tr><td> Comida seca </td><td> ZM alimentos para peixes, Reino Unido </td><td> ZM100, ZM200, ZM300 </td><td></td></tr><tr><td> Camarão ovos salmoura </td><td> Salt Creek, Inc., EUA </td><td> Premium Grade </td><td></td></tr><tr><td> No tanque de criadores</td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> ITSTS-A </td><td></td></tr><tr><td> O carbono ativado </td><td> Penn-Plax Pro-caranguejo, EUA </td><td> PBC3MF </td><td></td></tr><tr><td> Tanques de criação </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> SBTANK (1L) Criador Tanque-2 (2L) </td><td></td></tr><tr><td> Mar vermelho sal </td><td> Mar vermelho sal, EUA </td><td> Loja de animais / <a href="http://www.redseafish.com" target="_blank">www.redseafish.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Filtros (Canister, almofadas de filtro e UV) </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Siporax Mídia </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> BF 820 </td><td></td></tr><tr><td> Net artémia </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> BSN1 </td><td></td></tr><tr><td> Nascedouro artémia </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> BS252 </td><td></td></tr><tr><td> Chicanas </td><td> Habitats aquáticos, EUA </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Tabela de reagentes e equipamentos específicos utilizados neste protocolo. </td></tr></tbody></table>

regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: an introduction

Este protocolo descreve cuidados regulares e manutenção de um laboratório de peixe-zebra. Zebrafish estão ganhando popularidade em genética, a pesquisa farmacológica e comportamental. Como um vertebrado, partes zebrafish similaridade de sequência genética considerável com os seres humanos e estão a ser utilizados como um modelo animal para várias condições de doença humana. As vantagens do peixe-zebra, em comparação com os outros modelos de vertebrados comuns incluem fecundidade elevada, baixo custo de manutenção, os embriões transparentes, e rápido desenvolvimento. Devido ao estímulo do interesse em zebrafish pesquisa, a necessidade de estabelecer e manter uma instalação de alojamento produtiva do peixe-zebra também está aumentando. Embora a literatura esteja disponível para a manutenção de um laboratório de peixe-zebra, um protocolo de vídeo concisa é inexistente. Este vídeo ilustra o protocolo para regular da habitação, alimentação, reprodução e criação de larvas de peixe-zebra. Este processo vai ajudar os pesquisadores a entender o comportamento natural e ótimas condições de zebrafish criação e, portanto, solucionar problemas experimentais que se originam a partir das condições de criação de peixes. Este protocolo será de grande ajuda para os pesquisadores pretendem estabelecer um laboratório de peixe-zebra, e também para estudantes de graduação que estão pretendendo usar zebrafish como um modelo animal.

Zebrafish habitação e manutenção é mais fácil e mais barato do que os modelos tradicionais de roedores. Zebrafish mil Várias podem ser alojados em um pequeno laboratório. Como resultado deste protocolo, os pesquisadores serão capazes de gerir uma instalação zebrafish que irá proporcionar condições saudáveis ​​para o peixe-zebra. Além disso, os exemplos seguintes irão ajudar a identificar os ovos fertilizados, peixe-zebra adultos, e os seus alimentos. Uma ilustração de um peixe-zebra macho (Figura 1A) e peixe-zebra fêmea (Figura 1B e 1C) é mostrado para ajudar os investigadores a distinguir entre um macho e uma fêmea para reprodução zebrafish propósito A Figura 2 representa uma vista microscópica;. Camarões salmoura a 12X (Figura 2A), uma artémia único a 90X (Figura 2B), e de um ovo não fertilizado camarão salmoura a 90X (Figura 2C). Isso vai ajudar a compreender a diferença entre camarões de água salgada não fertilizados e fertilizados para propalimentação fins ER. Os ovos fertilizados e não fertilizados são mostrados na Figura 3. Figura 3A ilustra uma vista microscópica de embriões fertilizados e não fertilizados. Embriões não fertilizados são geralmente opacos e / ou com a célula rompido (s) no interior do córion (seta preta), ao passo que os embriões fertilizados parece intacto e em crescimento para o próximo estado de divisão celular (para leitura detalhada das diferentes fases de embriões zebrafish ver 1). Vista de uma maior ampliação Figura fertilizado e um ovo não fertilizado é mostrado na Figura 3B e 3C, respectivamente. 4 ilustra um ovipositor zebrafish fêmea para ajudar os investigadores a distinguir entre um macho e uma fêmea de peixe zebra. Vários problemas críticos que podem ocorrer em um laboratório zebrafish incluem o bloqueio do abastecimento de água para indivíduo / todos os tanques do sistema de habitação, má qualidade da água, e vazamentos em tubos ou reservatórios do sistema de circulação. Além disso,problemas na obtenção de embriões a partir de reprodução pode ser outra preocupação. Solução de problemas destas questões é discutido abaixo. <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Uma ilustração de um peixe-zebra macho (A) e peixe-zebra fêmea (B, C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Uma vista microscópica de camarões de água salgada a 12X (A), um artémia único a 90X (B), e de um ovo não fertilizado camarão salmoura a 90X (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Vista microscópica (16X) de ovos fertilizados e não fertilizados, em que apenas dois ovos não fertilizados são, os ovos não fertilizados são indicadas com setas pretas (A). Maior ampliaçãovisão (90X) de um. fertilizado (B) e um ovo não fertilizado (C) <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ovipositor Um peixe-zebra fêmea (indicado com a seta preta) ilustração. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Parâmetro </td><td fo:width="3in"> Faixa ótima </td></tr><tr><td> Alcalinidade </td><td> 50-150 mg / L CaCO3 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 6,8-7,5 (6,0-8,5 tolerada) </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 26-28,5 ° C </td></tr><tr><td> Dureza </td><td> 50-100 mg / L CaCO3 </td></tr><tr><td> Amônia não ionizada </td><td> &lt;0,02 mg / L </td></tr><tr><td> Nitrato (NO 3 -) </td><td> &lt;50 mg / L </td></tr><tr><td> O nitrito (NO 2 -) </td><td> &lt;0,1 mg / L </td></tr><tr><td> Oxigênio dissolvido </td><td> &gt; 6,0 mg / L </td></tr><tr><td> Salinidade </td><td> 0,5-1 g / L </td></tr><tr><td> Condutividade </td><td> 300 -1500 uS </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros de qualidade de água. Parâmetros de qualidade de água. Faixa ideal de parâmetros ambientais no aquário do peixe-zebra 11.

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Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Este protocolo descreve a manutenção regular e cuidados para manter as condições ideais para a criação de peixes-zebra. O vídeo ilustra o protocolo para a manutenção do sistema, regular da habitação, alimentação, reprodução e criação de larvas de peixe-zebra.

Cuidados e manutenção regular de um peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratório: Uma Introdução

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

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Research

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Biology

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

88.4K visualizações.  Edith Cowan University. Este protocolo descreve a manutenção regular e cuidados para manter as condições ideais para a criação de peixes-zebra. O vídeo ilustra o protocolo para a manutenção do sistema, regular da habitação, alimentação, reprodução e criação de larvas de peixe-zebra.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biologia

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoal usando uma tela de estrogênio de levedura otimizada para o laboratório de ensino de graduação

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Estabelecimento e Manutenção de Baratas Gnotobióticas Americanas (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.