Esse método poderia ajudar a responder a perguntas-chave sobre biologia gastrointestinal, como como a expressão genética muda ou os desafios ambientais alteram a função intestinal. A principal vantagem dessa técnica é que leva menos tempo e é mais fácil de executar do que os métodos tradicionais de medição do trânsito intestinal. No dia do ensaio, larvas são alimentadas com alimentos contendo um rótulo fluorescente, e como eles comem esse alimento, o rótulo se acumulará em seu intestino.
Após a alimentação, eles são enxaguados, separados de alimentos não comidos e cada larva é transferida para um poço de um prato multi-poço. O poço tem um fundo cônico para que quando a matéria fecal é anulada, ela cai para o centro do poço. Agora lembre-se, há muitas larvas na placa multi-poço que podem ser monitoradas simultaneamente usando um espectrômetro de placa, que mede a quantidade de matéria fecal anulada.
E à medida que mais é anulado com o tempo, o sinal aumenta de acordo. Desta forma, temos um método de alta produtividade para medir o trânsito intestinal. No quarto dia pós-fertilização, polvilhe dois miligramas de alimentos de peixe larval em pó em cima da água em cada placa de Petri para alimentar as larvas.
Deixe as larvas quatro horas para se alimentar. Após a alimentação, transfira todas as larvas para um grande prato de lavagem contendo meio de embrião fresco. Usando uma pipeta sorológica de 50 mililitros, aspire suavemente o máximo possível de alimentos que sobrarem, tomando cuidado para não capturar nenhuma larva.
Transfira larvas para uma nova placa de Petri contendo 50 mililitros de meio de embrião fresco. Repita o processo de alimentação, lavagem e transferência por mais dois dias. No sexto dia pós-fertilização, comece a preparar os alimentos fluorescentes adicionando 200 miligramas de alimentos secos a um vidro de relógio de 10 centímetros.
Adicione 300 microliters de rótulo fluorescente e 100 microliters de água deionizada e misture brevemente. Espalhe a pasta resultante em uma camada fina no vidro do relógio e deixe-a secar à temperatura ambiente, no escuro, por pelo menos oito horas. Depois disso, raspe a mistura seca do vidro do relógio.
Esmague-o em um pó e armazene-o à temperatura ambiente, no escuro. No sétimo dia pós-fertilização, alimente os alimentos fluorescentes para as larvas, polvilhando dois miligramas dele em cima da água em cada placa de Petri. Deixe as larvas se alimentarem por duas horas.
Enquanto isso, prepare as soluções concentradas de dosagem dissolvendo cada composto de teste em meio de embrião para uma concentração que é duas vezes a dose alvo com um volume final de pelo menos 2,5 mililitros. No final do período de alimentação, use uma pipeta de transferência para movê-las para um grande prato de lavagem. Enxágüe todas as larvas descritas anteriormente com aspiração mais rigorosa.
É importante remover o máximo possível de alimentos fluorescentes durante a lavagem final para reduzir a possibilidade de que ele seja transferido inadvertidamente para o prato de 96 poços. Depois que cada larva é enxaguada, usei uma pipeta para retirá-la juntamente com 100 microliters de meio de embrião do prato de lavagem. Distribua a larva e os 100 microliters inteiros de meio em um poço de poliestireno de 96 poços, fundo cônico, placa multi-bem.
Uma vez que todas as larvas tenham sido transferidas, adicione 100 microliters das soluções de dosagem preparadas aos poços apropriados. Depois de todas as soluções de dosagem terem sido adicionadas, carregue a placa em um espectrômetro de placa. Meça a fluorescência da placa a partir da parte inferior, cinco vezes em sucessão imediata, sem balançar a placa.
A leitura mais baixa de cada poço será designada como sua fluorescência inicial durante a análise dos dados. Incubar a placa a aproximadamente 28 graus Celsius. Repita o processo de medição, lendo a fluorescência a cada 20 minutos durante as duas primeiras horas pós-dosagem e incubando entre leituras.
Meça a fluorescência a cada 30 minutos para a terceira e quarta horas pós-dosagem e, em seguida, faça medições horárias durante as horas cinco a oito. Incubar as larvas a 28 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, leia a fluorescência em 24 horas após a dosagem.
Este protocolo usa espectrofotometria baseada em placas para avaliar o trânsito de GI como uma substituição de alto rendimento para microscopia fluorescente. Os resultados representativos comparando esses dois métodos são gerados pela análise de peixes tratados de forma idêntica durante um período de 24 horas após a dosagem. Como visto aqui, os resultados são altamente correlacionados, com inclinação negativa porque a microscopia mede o sinal de fluorescência retida e a espectrofotometria mede o sinal transmitido.
A análise de compostos com mecanismos diferentes revela que, quando comparados aos controles tratados com veículos, o trânsito de AR lento amitriptilino e amitriptilina. Tegaserod e metoclopramida, por outro lado, são vistos para acelerar o tempo de trânsito. A eritromicina, que era esperada para acelerar o tempo de trânsito com base na resposta dos mamíferos, é vista como não ter nenhum efeito no tempo de trânsito de peixes-zebra.
Uma análise mais aprofundada demonstra que a atropina retarda o trânsito de GI, dose dependente, em larvas de peixes-zebra. A menor dose testada, 042 micromolar, não teve efeito significativo. Enquanto as duas doses mais altas são vistas cada uma com impacto significativo.
Este método tem muitas aplicações, incluindo a detecção de efeitos tóxicos do GI de drogas ou candidatos a medicamentos, modelagem de doenças, como síndrome do intestino irritável, descoberta de novas terapias para tais doenças, bem como a descoberta de compostos pró-cinéticos.
