This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

As práticas utilizadas para obter os tecidos de camundongos foram aprovadas pelo corpo para a Protecção dos Animais (OPBA) da Universidade de Trento (Itália), o Protocolo n. 04-2015, o Decreto conforme art.31 Legislativo n. 26/2014. Todos os ratos foram mantidos no Centro Organismo Modelo do Centro de Biologia Integrativa (CIBIO), da Universidade de Trento, Itália. Cuidado: Para evitar qualquer degradação RNA das amostras, preparar todos os buffers que utilizam água tratada com DEPC para minimizar a contaminação RNase. 1. Preparação de polissomas a partir de cérebros inteiros <ol><li> Reunindo tecidos cerebrais (15 min) <ol><li> Eutanásia de tipo selvagem estirpe de murganho C57BL / 6 com asfixia com CO2 durante 5 min 36. Cuidadosamente dissecar o cérebro para fora a partir do crânio 36, colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml e colocá-lo imediatamente em azoto líquido. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Preparação de lisado (30 min) <ol><li> Pulverizar todo o tecido cerebral usandoum almofariz e pilão em azoto líquido. </li><li> Transferir cerca de 25 mg de pó para um tubo de microcentrífuga e imediatamente a frio (para evitar o descongelamento do tecido pulverizado) adicionar 0,8 ml de tampão de lise (ver Tabela 1) e interromper a célula por pipetagem para cima e para baixo 25 vezes rapidamente. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação e manter o tubo em gelo durante 15 min. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e as mitocôndrias. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Armazenar o sobrenadante a -80 ° C durante um máximo de 6 meses ou utilizá-lo imediatamente. </li></ol></li><li> preparação em gradiente de sacarose e centrifugação (2 horas e 30 min) <ol><li> Lavagem de ultracentrífuga tubos extensivamente com RNase água (dietilpirocarbonato água tratada (DEPC-água) ou comercial) umd 3% de H 2 O 2 / DEPC H2O solução. </li><li> Colocar os tubos em gelo e adiciona-se 5,5 ml de solução fria de 50% de sacarose na parte inferior de cada tubo (ver Tabela 1 para as soluções de sacarose). Adiciona-se cuidadosamente a 15% gota a gota uma solução de sacarose, permanecendo perto da interfase, a fim de preservar uma interfase afiado, até que o tubo está completamente cheia. Quando o tubo está completamente cheia, a fechar com uma tampa de borracha para evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> Em uma sala fria suavemente fixar os tubos na horizontal e mantê-lo nessa posição durante 2 horas. Após este tempo, os tubos de endireitar-se lentamente de volta para a posição vertical e colocá-los em gelo. Os gradientes está agora pronto para ser usado. Em alternativa, preparar o gradiente de sacarose de 15-50%, utilizando um gradiente convencional ex. </li><li> Em um quarto frio remover cuidadosamente 1,0 ml a partir do topo do gradiente e sobrepor a gota sacarose a gota, com o lisado citosólica (isto é, o sobrenadante obtido no step 1,2). </li><li> Cuidadosamente abaixe as para dentro dos baldes de rotor basculante. Centrifugar os gradientes de 100 min a 180000 xg, a 4 ° C usando uma ultracentrífuga. </li><li> Depois da centrifugação, os tubos em deixar os baldes durante 20 min a 4 ° C para permitir que os gradientes de estabilizar. </li></ol></li><li> fraccionamento em gradiente de sacarose (2 h) <ol><li> Remova cuidadosamente um tubo de ultracentrífuga do rotor de ultracentrífuga e montá-la no dispositivo coletor de um gradiente de densidade Fracionamento do sistema. Recolher fracções de 1 ml monitorizando a absorvância a 260 nm com um detector de UV / VIS (Ver Figura 1 Painel superior). Mantenha as fracções recolhidas em gelo. </li><li> Preparar alíquotas de 30-40 uL das fracções de interesse, mantê-los em gelo antes de as armazenar a -80 ° C até utilização. Não use alíquotas ou fracções de sacarose que foram submetidos a mais de dois ciclos de congelamento-descongelamento (ver Figura 1 painel inferior). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparação de Amostras para Microscopia de Força Atômica (3 horas) <ol><li> Usando a fita, retire as folhas de mica. </li><li> Lave as folhas de mica 3-4 vezes com DEPC-água e colocá-lo em uma pequena placa de Petri. Em seguida, seque a superfície com o ar. </li><li> Cobrir a mica com 200 ul de 1 mM de 4 Niso e incubar durante 3 min a RT. </li><li> Remover a solução de níquel e, em seguida, seca-se a superfície utilizando ar. Realizar todos os passos futuros, a 4 ° C através da colocação da placa de Petri com a mica em gelo. </li><li> Descongelar uma aliquota obtida em 1.4.2 em gelo e cuidadosamente adicionar toda a amostra gota a gota na mica. Utilizando uma ponta de pi 100-200, espalhar a amostra em toda a superfície da mica. Incubar a amostra em gelo durante 3 min. </li><li> Cobrir a gota folha de mica a gota com 200 ul de Tampão de frio-AFM (ver Tabela 1) e incubar durante 1 hora em gelo. </li><li> Imaging no líquido <ol><li> Retire cuidadosamente o tampão de-AFM e lavar as folhas de mica 3-4 vezs com 200 ul fria Tampão-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lavar as folhas de mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1), deixando a superfície mica coberta por alguns microlitros de solução. </li><li> Ir ao ponto 3 (aquisição de imagem). </li></ol></li><li> Imaging no ar <ol><li> Cuidadosamente remover o tampão e lava-se a AFM mica 3-4 vezes com 200 ul de Tampão de frio-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lava-se a mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1) e drenar o excesso de água, utilizando papel. </li><li> Deixar a secagem da amostra sob o capô química com a parte superior da placa de Petri parcialmente aberta. Após 2 horas, feche a placa de Petri e armazenar a RT. Medir a amostra depois de 2-3 horas, à medida que eles são estáveis ​​durante anos. </li></ol></li></ol> 3. Aquisição de Imagem (15 min por imagem após estabilização térmica) Nota: polissomos imobilizadas em mica podem ser visualizados no ar ou no estado líquido, usando o modo AC. <ol><li> Fixe a mica ao titular da amostra usando fita dupla face. </li><li> Insira o suporte da amostra na fase AFM seguindo as instruções do fabricante. Quando imagiologia no estado líquido, se possível, para tentar manter a amostra a uma temperatura inferior a 25 ° C para aumentar a estabilidade no tempo polissoma. </li><li> Selecione um cantilever adequado para imagiologia AC e montá-la no suporte a ponta seguindo as instruções do fabricante. Aqui, o uso de consolas com força constante entre 2-20 N / m para a imagem latente do ar e cerca de 0,1 N / m para a imagem latente líquida. </li><li> Ajustar o ponto de laser sobre o braço de suporte e zero os sinais de detector de quadrante. </li><li> Selecione uma frequência de condução oportuno e conduzir o cantilever com uma amplitude de 10-20 nm. </li><li> Aproxime-se da amostra até a ponta engata na superfície. </li><li> Selecione uma área de digitalização de mm 2x2, adquirir pelo menos 512x512 pixel imagens (pixels de largura &lt;4 nm), seleccionar um modo de subtração de fundo ao vivo e uma escala Z de 20-25 nm. </li><li> Inspecione tele imagem procurando a presença de objectos redondos, caracterizado por a altura entre 10 e 15 nm, quando a aquisição de ar e 25 e 30 nm, quando no estado líquido e a largura na gama de 25-30 nm. Ajustar os parâmetros de referência e de opinião até objetos pontiagudos são visualizados. O fundo deve aparecer relativamente plana em boas amostras, com alguns objetos de altura 2-4 nm (ver Figura 2A e B). </li><li> Se a imagem parece ser bom (como indicado no ponto 3.8), adquirir vários (pelo menos dez) scans 2x2 mícron em diferentes áreas de amostra. </li><li> (opcional). Se necessário, adquirir imagens de alta resolução de polissomos selecionadas (veja a Figura 2C). </li><li> Aplicar correções de software (subtração de avião e linha por linha de algoritmos de correção) para corrigir as imagens de AFM remoção de inclinação arbitrário e efeitos à deriva. </li></ol> 4. Análise de Dados (30 min por imagem) <ol><li> Exportar imagens em ImageJ (opcional: aplicar um fator de escala) preferentei ra me usando um formato de compressão sem perdas, por exemplo, o formato TIFF (ver Figura 3A). </li><li> Use a macro RiboPick.ijm conjunto de ferramentas ImageJ (a ser copiado no ImageJ macro / conjunto de ferramentas subdiretório) para contar ribossomos em polissomos (ver Figura 3B) e calcular propriedades estatísticas da amostra (ver Figura 3C). <ol><li> Começar a carregar uma imagem usando o &lt;image Leia&gt; ferramenta que inicializa o programa. </li><li> Escolha os centros de ribossomas com o padrão &lt;selecção Point&gt; ImageJ ferramenta (Shift + clique esquerdo permite que o multi-seleção de ribossomas). Marque os ribossomos selecionados com o &lt;Marcos ribossomos&gt; ferramenta. coordenadas ribossomas aparecerá em uma janela de texto personalizado. </li><li> Adicionar mais ribossomos ao mesmo polysome repetindo o procedimento indicado no ponto 4.2.2. </li><li> Remover ribossomos erroneamente marcados usando o &lt;Undo última escolha&gt; ferramenta (começa a remover a partir do último ribossomo adicionado ao primeiro212; na polysome atual). </li><li> Quando o polysome for concluída, use o &lt;polysome Novo&gt; ferramenta. Como o número polysome é adicionado como uma sobreposição à imagem, a janela de texto é atualizado. </li><li> Use o &lt;Guardar resultados e perto&gt; para escrever o ribossomo coordena uma imagem PNG que resume ribossomas e polissomos o escolhido arquivo (as unidades padrão da imagem são usados) e. A imagem original é fechado sem ser salvo. </li></ol></li></ol>

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<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Como a estrutura do DNA foi provado ser de suma importância para descrever o processo de transcrição e como a organização da cromatina avançado nossa compreensão do controle transcricional da expressão do gene, é essencial analisar a organização e estrutura do polissomos para melhorar a compreensão verdadeiras da tradução e da sua regulação. Com o protocolo descrito, uma densidade óptima de polissomas suavemente imobilizados sobre uma superfície plana, adequados para imagio...

A síntese de proteínas é o processo que consome mais energia nas células 1,2. Por isso, não surpreende que a abundância de proteína são controladas principalmente para a translação em vez de 3,4,5 nível da transcrição. O polissoma é o componente macromolecular fundamental que converte a informação em leituras de ARNm proteicos funcionais. Os polissomas são até agora reconhecida como complexos macromoleculares, onde vários controlos traducionais convergem 6-13. Apesar das centenas de estudos sobre a estrutura do ribossoma 14- 16, os insights moleculares detalhados sobre a dinâmica da tradução e da topologia da polissomos encontrou um interesse limitado. Como consequência, a organização do complexo polissomal ribonucleoproteï¿½a nativa e seu efeito potencial sobre a tradução ainda são questões bastante obscura. Polissomos pode esconder organizações ordenadas e funcionais ainda desconhecidos, potencialmente um reflexo do que nucleossomos e contro epigenéticals ter representado para o campo de transcrição. Na verdade, a investigação desta hipótese intrigante requer estudos adicionais e novas abordagens técnicas. Nesta linha, as técnicas estruturais e de microscopia de força atômica pode proveitosamente colaboram para desvendar novos mecanismos para controlar a expressão do gene, à semelhança do que foi conseguido para a nucleossomo 17,18. Desde a descoberta do ribossoma 14-16, a sua estrutura foi extensivamente caracterizado em procariotas, levedura 19,20 21 e, mais recentemente, em 22 humana, proporcionando a descrição molecular dos mecanismos na base da síntese de proteínas. Polissomas foram reconhecidos inicialmente na membrana do retículo endoplasmático, formando organizações geométricas 2D típicos 14. Como mencionado antes, polissoma montagem não tenha sido o objecto de interesse constante à medida que a estrutura do ribossoma. No passado, têm sido estudados polissomas essencialmente por trtécnicas ansmission EM-base. Só recentemente, técnicas de crio-EM permitiu a reconstrução 3D do polissomos purificados a partir in vitro sistemas de tradução 23-26, lisados ​​celulares humanos 27 ou em células 28. Estas técnicas ofereceu informações mais refinado sobre a organização ribossomo-ribossomo em polissomos 23, 26-28 e uma descrição molecular preliminar das superfícies de contato dos ribossomas adjacentes em polissomos gérmen de trigo 24. Assim, a tomografia crio-EM permite a divulgação de interações ribossomas-ribossomo com detalhes molecular, mas é sobrecarregado por extensa pós-processamento e análise de reconstrução que exigem recursos computacionais pesadas para a manipulação de dados. Além disso, para obter os detalhes moleculares das interacções ribossoma ao ribossoma, um mapa altamente resolvidas do ribossoma é necessário, e este tipo de ribossoma de referência está disponível apenas para algumas espécies. É importante ressaltar que a tomografia crio-EM não é capaz de detectar RNA livre. Therefminério, novas técnicas são necessárias para compreender plenamente a organização da maquinaria de tradução. Ao lado de crio-EM, AFM foi também empregado como uma ferramenta útil para a imagem latente direta de polissomos em eucariotos inferiores 29-33 e humanos 27. Em comparação com EM, AFM não requer a fixação da amostra ou rotulagem. Além disso, as medições podem ser efectuadas em condições fisiológicas próximo e com a possibilidade única de identificar claramente ambos os ribossomas e cadeias de ARN nus 27. Imagiologia de polissomos individuais podem ser realizadas de forma relativamente rápida, a obtenção de milhares de imagens em nano-resolução com pouco esforço pós-processamento em comparação com a extensa e pesada de pós-processamento e análises de reconstrução exigida por microscopia crio-EM. Consequentemente, AFM manipulação e análise de dados não precisa de estações de trabalho caras e poder de computação de alta. Como tal, esta técnica recolhe informação sobre formas polissomal, características morfológicas (tais comoaltura, comprimento e largura), densidades de ribossomas, a presença de RNA livre eo número de ribossomas por polysome 27 com um caudal superior a crio-EM. Em tal forma, AFM representa uma abordagem poderosa e complementar às técnicas de EM para retratar polissomos 27. Aqui nós apresentamos um gasoduto completa de purificação para análise de dados, onde AFM é aplicado à imagem e analisar polissomos cérebro do rato. O protocolo proposto concentra-se em problemas de purificação e na deposição precisa de polissomas em substratos de mica que são usados ​​para imagiologia AFM. Além da análise convencional de partícula que pode ser facilmente realizada com o software comum utilizado pela comunidade AFM, um plug-in ImageJ 34, chamado RiboPick, é apresentado para a contagem do número de ribossomas por polissoma 27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

A maquinaria de tradução, ou seja, o polysome ou polyribosome, é uma das maiores e mais complexas máquinas citoplasmáticos nas células. Polissomos, formadas por ribossomas, mRNAs, várias proteínas e RNAs não-codificantes, representam plataformas onde os controles de translação ocorrem integrado. No entanto, enquanto o ribossomo tem sido amplamente estudada, a organização do polissomos carece ainda de compreensão abrangente. Assim, muito esforço é necessário, a fim de elucidar a organização polissoma e qualquer novo mecanismo de controlo de tradução que pode ser incorporado. microscopia de força atômica (AFM) é um tipo de microscopia de varredura por sonda que permite a aquisição de imagens 3D em resolução nanoescala. Em comparação com técnicas de microscopia electrónica (ME), uma das principais vantagens da AFM é que ele pode adquirir milhares de imagens, tanto no ar e em solução, permitindo que a amostra a ser mantida sob condições fisiológicas próximo, sem qualquer necessidade de coloração e fixação próprocedimentos. Aqui, um protocolo detalhado para a purificação precisa da polissomos de cérebro do rato e sua deposição em substratos de mica é descrito. Este protocolo permite a imagiologia polissoma no ar e líquido com a AFM e a sua reconstrução de objectos tridimensionais. Complementar ao microscópio crio-elétron (crio-EM), o método proposto pode ser convenientemente utilizado para analisar sistematicamente polissomos e estudar sua organização.

Sacarose profiling gradiente polissomal de cérebro inteiro de rato É possível purificar polissomas a partir de um ligado celular por perfis polissomal, que separa as macromoléculas de acordo com o seu peso e tamanho. Com perfis polissomal, lisados ​​citoplasmáticos obtidos a partir de células ou tecidos em cultura, tal como neste exemplo, são carregados sobre um gradiente de sacarose linear e proces...

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K visualizações.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Vídeo: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Engenharia

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Bioquímica

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Imunologia e Infecção

 Imaging Polysomes Isolated from a Mouse Brain Using Atomic Force Microscopy

Source: Lunelli, L.,&#160;et. al. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy.&#160;J. Vis. Exp.(2016).This video demonstrates the imaging of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Synaptic & Cellular Imaging

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...