A hibridização completa, in situ, WISH, proporciona uma alta resolução e um baixo resultado de fundo em comparação com os métodos tradicionais. Além disso, as placas de u-slide melhoram o foco na mesma distância focal usando menos WISH pode ser aplicado a embriões de camundongos, embriões de Drosophila e outros tecidos difíceis de manusear. O ensaio de formação do tubo pode ser aplicado a células-tronco células andrógenas diferenciadas.
O WISH facilita a compreensão do significado funcional da correção da mutação. A pessoa que vai demonstrar o procedimento é Yong Wang, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Trabalhando sob um microscópio, use o sistema FemtoJet para injetar dois nanogramas de Morpholinos e 500 picogramas de MRNA em embriões unicelulares.
Pratique a microinjeção de Morpholinos muitas vezes até que você possa injetá-lo nas células com sucesso e manter a integridade dos ovos. Incubar as zigotos até que sejam descorrioadas e alcancem o estado de desenvolvimento que corresponde ao experimento pretendido. Como descrito na mesa um do manuscrito.
Em seguida, use uma pipeta de plástico para transferir 20 a 40 embriões para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de solução 4%PFA recém-preparada à temperatura ambiente. Após a fixação, lavagem e desidratação dos embriões como descrito no manuscrito, coloque os embriões em uma peneira com malha de nylon na parte inferior.
Hidrate os embriões lavando-os sequencialmente em 75%50% e 25% de metanol por cinco minutos cada. Depois de lavar os embriões com PBST, adicione 50 microliters de proteinase K no tubo com os embriões. Após a digestão, remova a proteína K e lave os embriões com PBST três vezes por cinco minutos cada vez.
Adicione 50 a 100 microliters de sondas alvo mistas em cada tubo com os embriões. Incubar os embriões durante a noite a 40 graus Celsius. Após lavar os embriões como descrito no manuscrito, use 4% de paraformaldeído para corrigir os embriões por 30 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, lave os embriões em solução SSCT 2x três vezes por 15 minutos cada vez em temperatura ambiente. Remova a solução SSCT e substitua-a por 50 microliters de Amp 1. Em seguida, incubar os embriões a 40 graus Celsius.
Após 30 minutos, lave os embriões em solução SSCT 2x três vezes por 15 minutos cada vez em temperatura ambiente. Remova a solução SSCT e adicione 50 microliters de Amp 2. Depois de incubar por 15 minutos e lavar o embrião como feito anteriormente, adicione 50 microliters de Amp 3 e bata suavemente no tubo.
Incubar os embriões a 40 graus Celsius. Após 30 minutos lave os embriões como descrito anteriormente. Em seguida, adicione 50 microliters de Amp 4 dropwise e toque cuidadosamente no tubo.
Em seguida, incubar os embriões a 40 graus Celsius por 15 minutos e lavá-los três vezes com SSCT. Depois de preparar os embriões para imagens como descrito no manuscrito, use um kit de substrato de peroxidase DAB para manchar o espécime. Adicione 50 microliters cada um dos reagentes de cor A, B e C a um mililitro de água destilada.
E misture bem para obter um fluido de trabalho DAB completo. Adicione o fluido ao espécime e cubra por dez minutos. Depois de lavar completamente os espécimes, use um microscópio óptico para imagens.
Para começar a cultivar e controlar os iPSCs HHT, adicione matriz de membrana de porão a seis placas de cultura de células de poço para cobrir a parte inferior dos poços. Incubar as placas por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, remova a solução de matriz de membrana de porão usada dos poços e adicione dois mililitros de mTeSR 1 médio em cada poço.
Em seguida, emplaque os iPSCs colhidos da última passagem em aproximadamente dez vezes dez para as seis células por poço. Após cultivar os iPSCs por aproximadamente quatro dias, troque o meio de cultura celular com o meio BEL suplementado. Cresça as células por três dias para gerar células de mesoderme.
Para expandir as células endoteliais vasculares, substitua o meio por meio BEL suplementado por quatro dias. E então tratar as células com o mesmo meio e cultura por mais três ou quatro dias. Purifique as células endoteliais vasculares maduras usando dynabeads CD31 de acordo com as instruções do kit.
Em seguida, colete as células positivas CD31 por buffer de eluição. Manter e expandir as células endoteliais purificadas em meio EC-SFM contendo VEGF165, bFGF e FBS. Para emplacar as células endoteliais, comece adicionando 10 microlitadores de matriz de membrana por parte do poço às placas de angiogênese.
Incubar as placas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Colher as células endoteliais e resuspensá-las em crescimento endotelial médio 2 por pipetação repetidamente. Adicione 50 microliters desta suspensão celular à matriz solidificada em cada poço e, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius.
Após três a cinco horas de incubação, use um microscópio de alta resolução para avaliar a formação do tubo endotelial. Capture imagens de pelo menos dez áreas para cada grupo. Inspecione o comprimento geral do tubo, o número do tubo e os pontos do galho.
CISH e WISH foram realizados para determinar a expressão de endoglina em embriões pós-fertilização 24 horas. Um marcador endotelial hemogênico e um marcador progenitor endotelial foram usados para examinar o efeito do silenciamento da endóglina. As setas vermelhas indicam regiões onde a expressão desses marcadores, aplnrna e npr1a, diminuiu significativamente.
O ensaio de formação do tubo endotelial foi realizado no mutante de endoglina e controlou as células endoteliais derivadas do iPSC. A formação do tubo foi avaliada e fotografada após três horas. O comprimento do tubo, o número do tubo e a ramificação foram quantificados por meio do software ImageJ.
Células endoteliais mutantes formaram menos ramos do que controlar células endoteliais. E os ramos das células endoteliais mutantes aumentaram significativamente após a estimulação com fator de crescimento endotelial vascular. Este método também pode ser usado para a geração de iPS a partir de sangue periférico.
E pelo método esclarece o papel da endócrina na formação vascular in vitro e in vivo. Sabendo que corrigir a mutação pode fazer a diferença na angiogênese, é possível transplantar as células de volta em pacientes para uma potencial terapia com células-tronco.
