Tubo HUVEC-ensaio de formação para avaliar o impacto dos produtos naturais na angiogênese

O Ensaio de formação de tubos é um teste in vitro para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a vários passos que levam à formação de novos vasos sanguíneos. Este ensaio permite identificar compostos e sinalizar cascatas associadas à angiogênese. Com um teste, podemos mostrar que um composto natural como o RGWE reduz a capacidade das células endoteliais de formar estrutura semelhante a tubos, não afetam a viabilidade celular, e que esse efeito depende da ativação da via MEK/ERK. É importante realizar o teste com o número certo de células. Na verdade, poucas ou muitas células não poderiam permitir a formação correta de tubos. Por essa razão, é aconselhável realizar um teste preliminar para descobrir o número correto das células. Luca Olga Pastorino, doutoranda do meu laboratório, mostrará os procedimentos. Primeiro, coletar folhas de graves Ruta durante os meses de primavera e verão. Coloque 250 gramas de folhas picadas em um frasco cônico, e adicione um litro de água destilada, fervura e filtro, conforme descrito no manuscrito. No dia seguinte, use um liofilizador para liofilizar o extrato da folha. Depois de obter o pó, pese-o e divida-o em alíquotas. Cultura os HUVECs em meio de crescimento celular endotelial, de acordo com o protocolo de texto. Quando as células atingem 80% de confluência, passagem as células em uma proporção de um a três. Use as células obtidas entre a passagem dois e a passagem cinco. Uma vez que os HUVECs com passagem atinjam 70% de confluência, transfira-os com um micrograma do vetor contendo o gene de interesse.Combine um micrograma de DNA com três microlitadores de Lipofectamina diluída 2000.Em seguida, remova o meio dos HUVECs e substitua-o por um mililitro de meio completo fresco. Adicione a solução de transvecting às células, e incuba as células a 37 graus Celsius, e 5% dióxido de carbono. Três horas após a transvecção, adicione sete mililitros de meio completo fresco e incuba as células por mais 24 a 48 horas. Imediatamente antes da preparação do porão, coloque uma placa pré-refrigerada de 96 poços no gelo, e adicione 50 microliters de matriz fria a cada poço. Enquanto a placa incuba, lave os HUVECs com um mililitro de solução PBS/EDTA. Em seguida, adicione um mililitro da solução Trypsin-EDTA às células e incuba por cinco minutos a 37 graus Celsius.Colete o meio contendo as células suspensas e colme as células através da centrifugação. Então, resuspense as células em um mililitro de PBS. Transfira 0,2 mililitros da suspensão celular para 0,5 mililitros de PBS com solução azul trypan. Depois de segurar a suspensão em temperatura ambiente por cinco minutos, conte as células em um B