We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus. O protocolo padrão abaixo foi optimizada usando macho C57BL 6J / de 2-3 meses de idade. 1. Prepare Stocks e Suprimentos Solução em adiantado de Experimentos NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para equipamentos e materiais necessários. <ol><li> Prepare 1 L de cada uma das soluções seguintes, tal como indicado na Tabela 1:, Baixo Ca2 + / Mg2 + de Tyrode, solução modificada de Kraft-Brühe (KB) e Albumina de Soro Bovino (BSA) a solução completa de Tyrode. Use ultrapura filtrada água deionizada para todas as soluções. Dividir cada solução em alíquotas de 50 ml e armazenar a 20 ° C durante até seis meses. Descongelar alíquotas individuais imediatamente antes dos experimentos e armazenar por até uma semana a 46; C. </li><li> Preparar 50 ml de NaCl 10 mM e CaCl2 Solução Adaptação 1,8 por dissolução de NaCl e CaCl 2 em ultrapura filtrada água desionizada (Tabela 1). Armazenar à temperatura ambiente por até seis meses. </li><li> Preparar alíquotas 4,75 unidade de actividade da enzima (U) de elastase por pipetagem em tubos de microcentrífuga. Armazenar a 4 ° C por até três meses. </li><li> Preparar 375 ug (em alíquotas ultrapura H2O) de mistura de enzimas de colagenase-protease, pipetando em tubos de microcentrífuga. Armazenar a -20 ° C durante até três meses. </li><li> Prepare duas pipetas de Pasteur polidas ao fogo, para a transferência de um tecido (-1,5 mm de diâmetro de abertura final; 1Aiv Figura e Figura 1C) e uma para a dissociação (~ 2 mm de diâmetro; 1Aiii Figura e Figura 1C). <ol><li> Marque pipetas de Pasteur com um cortador de vidro e encaixe ao longo do marcador para produzir uma abertura ligeiramente maior do que o tamanho desejado. Fogo-polish o corte final de cada pipeta para ~ 30-60 segundos em fogo baixo em um queimador de Bunsen para produzir uma parede polida de espessura e uma abertura do diâmetro desejado. Garantir a abertura polido-fogo está livre de todas as rachaduras ou arestas. </li></ol></li><li> Preparar dois pratos de dissecação por adição de ~ 25 mL de elastómero de silicone misturados de acordo com as instruções do fabricante para cada placa de Petri de 100 milímetros (Figura 1ai e Figura 1B). Deixa-se curar à temperatura ambiente durante 48 h. </li><li> Para a cultura única: prepare 25-50 ml cada chapeamento Médio e Meio de Cultura de acordo com a Tabela 2 loja por até duas semanas a 4 ° C.. </li></ol> 2. Preparar soluções para ser usado em dia de isolamento celular NOTA: Os seguintes valores são para isolamento de miócitos sinoatrial de um mouse. <ol><li> Adicionar 2,5 ml de Baixa Ca2 + / Mg2 + de Tyrode (pH 6,9) a cada um de três tubos de cultura pequeno, de fundo redondos. Colocar os tubos no banho de água de 35 ± 1 ° C. </li><li> Adicionar 2,5 ml de baixa Ca 2+ / para um grande tubo de cultura de fundo redondo de Mg 2+ Tyrode. A este tubo, adicionar uma alíquota (4,75 L) a elastase e uma alíquota (375 ug) de colagenase-protease de mistura de enzimas. Agite para misturar. Coloque o tubo em 35 ± 1 ° C banho de água. </li><li> Adicionar 2,5 ml de KB médio para três tubos de cultura, adicionais pequenos de fundo redondo e um, tubo de cultura de fundo redondo de grande adicional. Colocar os tubos no banho de água de 35 ± 1 ° C. </li><li> Adicionar ~ 7 ml de solução de BSA a um grande tubo de cultura assentada. Manter este tubo à temperatura ambiente. </li><li> Coloque 20-40 ml de solução de Tyrode completa em um copo de 50 ml (Figura 1Aii). Adicionar 10 USP / ml de heparina, agite para misturar e colocar o copo no banho de água ° C 35 ± 1. </li></ol> 3. Preparar soluções e materiais adicionais para células cultivadas (ignorar essas etapas para Acutely isolaram células) <ol><li>Num capuz de cultura de tecido estéril, colocar dois 12 milímetros lamelas de vidro redondas por rato em poços individuais de uma placa de 24 poços. NOTA: A placa 24 também é utilizado porque os poços são de um tamanho conveniente, que serve para limitar o volume de infecções virais posteriores. </li><li> Pipetar cerca de 200 ul de uma solução a 100 ng / ml de laminina de rato diluído em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) em cada lamela. </li><li> Incubar lamelas com laminina para a duração do isolamento (pelo menos, 1 h) em uma incubadora a 37 ° C. </li><li> Pré-aquecer o chapeamento de médio e Meio de Cultura (do Passo 1.7 e Tabela 3) a 37 ° C. </li></ol> Isolamento 4. Sinoatrial Node <ol><li> Em uma Cobertura de vapores químicos, coloque um rato em uma câmara de uma caixa de duas câmaras e anestesiar com ~ 200 mL de isoflurano líquido introduzido através de um cotonete de algodão para a outra câmara. Confirmar anestesia (geralmente dentro de ~ 30-60 seg) com uma pitada dedo do pé. Eutanásiado mouse por deslocamento cervical. NOTA: Uma 1 ml caixa de ponteira vazio pode ser usado para formar a caixa de duas câmaras; transformar o rack de cabeça para baixo na caixa para criar o compartimento separado para o isoflurano para prevenir o mouse entrar em contato com ele diretamente. </li><li> Retire a pele do peito com uma tesoura e costela transecto gaiola para expor a cavidade torácica usando uma pinça externas de tecido (Figura 1Aviii) e tesouras de dissecação (Figura 1Avix). Banhar a cavidade torácica com ~ 2 ml aquecido completa Tyrode Com heparina utilizando uma pipeta de transferência. NOTA: Continue cavidade torácica tomar banho, quando necessário, não permita que a preparação para secar. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente os pulmões e do timo com uma tesoura internos (Figura 1Avi) e uma pinça de dissecção (Figura 1Avii). </li><li> Enquanto gentilmente segurando o ápice do coração com a pinça de dissecação internos, corte cuidadosamente a veia cava inferior ea umorta com a tesoura internos para remover o coração da cavidade torácica. Transferir o coração a um dos pratos de dissecação de silicone e banhar-se com ~ 4 ml aquecido heparinizado completo Tyrode do usando a pipeta de transferência. </li><li> Oriente o coração de tal modo que os vasos posteriores são visíveis e voltado para cima, com o átrio direito do animal no lado direito do experimentador eo átrio esquerdo à esquerda do experimentador. Uma vez orientado, imobilizar o coração fixando através do ápice para o prato de silicone dissecção. </li><li> Localize o sulco entre os ventrículos e as aurículas (anel clara acima do ventrículos). </li><li> Usando as tesouras de dissecação internos, fazer uma incisão na ranhura, mantendo-se mais estreita para os ventrículos do que os átrios. Lave o groove e incisão com Tyrode completo heparinizado aquecido adicional da conforme necessário para permitir uma visão clara dos átrios e das válvulas. Continuar a cortar ao longo da ranhura para separar os átrios dos ventrículos. </li><li>Transferir o tecido atrial para o segundo prato de silicone dissecção e tomar banho com ~ 3 ml aquecido heparinizado completo Tyrode do. </li><li> Orient o tecido de modo que átrio direito do animal está agora no lado esquerdo do experimentador, eo átrio esquerdo é à direita. NOTA: O átrio direito é mais transparente, enquanto o átrio esquerdo tem mais de um tom vermelho escuro. </li><li> Pin o tecido através da veia cava inferior e superior e à direita e apêndices atriais à esquerda, estendendo-se a preparação suavemente. Remover qualquer tecido adiposo ou outro restante para permitir uma visão clara da preparação (cuidado para não cortar na parede atrial, como o nó sinusal é bastante delicada e pode ser facilmente danificada). </li><li> Abrir a parede anterior dos átrios cortando através das veias cavas. Re-posicionar os pinos, conforme necessário para visualizar o septo interatrial. </li><li> O corte ao longo do septo interatrial para remover o átrio esquerdo. Re-pin a preparação, que se estende suavemente. </li><li> Retirar tele direita aurícula e libertar o nó sinusal cortando ao longo da terminalis cristas, que aparece como uma faixa laranja escuro na fronteira com o apêndice atrial. </li><li> Re-pin o tecido nodal e cortá-la lateralmente (perpendicular à crista terminal) para produzir três faixas de igual tamanho. </li></ol> 5. Sinoatrial Nó Digestão <ol><li> Utilizando a pipeta polida ao fogo estreita (Figura 1Aiv), transferir as três tiras de tecido do nódulo sino-auricular para o primeiro de três pequeno tubo, de fundo redondo contendo 2,5 ml de baixo Ca2 + / Mg2 + de Tyrode no 35 ° ± 1 banho de água C. Incubar durante 5 min. </li><li> Tiras de tecido transferência para o segundo tubo pequeno, de fundo redondo contendo 2,5 ml de baixa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode está no banho de água ° C 35 ± 1, utilizando a mesma pipeta estreita. Lave as tiras de tecido por gentil rodando o tubo ou pipetando suavemente com a pipeta estreita. Não invert do tubo. </li><li> Tiras de tecido de transferência para o tubo terceira pequeno, de fundo redondo contendo 2,5 ml de baixa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode de, e repita o passo de lavagem descrito no passo 5.2. </li><li> Tiras de transferência para o tubo de fundo redondo de grande contendo 2,5 ml de baixo Ca2 + / Mg2 + de Tyrode com enzimas (elastase de mais mistura de colagenase-protease), em banho de água a 35 ° C. Certifique-se de que todas as três tiras de tecido estão presentes. Incubar durante 10-15 minutos a 35 ± 1 ° C. Misture a cada 5 min de agitação suave do tubo. Não inverter o tubo. </li></ol> 6. Sinoatrial Nó miócitos dissociação <ol><li> Após a digestão enzima, utilizar a pipeta estreita-fogo polido para transferir suavemente as tiras de tecido para o primeiro tubo pequeno, de fundo redondo contendo 2,5 ml de solução de KB a 35 ± 1 ° C. Lave o tecido suavemente agitando o tubo. Nota: tiras de tecido vai aparecer um pouco translúcida e pode se aglutinarem em thé o ponto. Lidar com muito cuidado após a digestão enzimática para evitar células perder. </li><li> Transferir o tecido para o segundo tubo de fundo redondo de pequeno contendo 2,5 ml de KB a 35 ± 1 ° C. Homogeneizar suavemente para lavar. </li><li> Transferir o tecido para o terceiro tubo de fundo redondo de pequeno contendo 2,5 ml de KB a 35 ± 1 ° C. Homogeneizar suavemente para lavar. </li><li> Transferir o tecido para o tubo de grandes dimensões, de fundo redondo contendo 2,5 ml de KB a 35 ± 1 ° C. </li><li> Utilizando a pipeta polida ao fogo maior (Figura 1Aiii e Figura 1C), dissociar as células do grande tubo de fundo redondo de trituração constante em aproximadamente 0,5-1 Hz durante 5-10 min, tendo o cuidado de manter o tubo submerso no dissociação 35 ± 1 ° C e banho de água para evitar a introdução de bolhas na solução. Nota: O tempo trituração varia de acordo com o diâmetro da pipeta dissociação e força de pipetagem. O tempo deve ser ajustada de modo que os pedaços de tecido restante em tele final da dissociação parecem fina, transparente e rala. Se o tecido retém toda a cor, a dissociação é provável que seja incompleta. Frequência (0,5-1 Hz) é determinada pela mão. </li><li> Retirar o tubo de fundo redondo contendo SAM dissociada do banho de água e equilibrar à temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol> 7. Sinoatrial cálcio Nó Re-adaptação (realizada na Sala de Temperatura) NOTA: Para SAMs destinados a experiências de cultura, os procedimentos na seção seguinte deve ser realizada em uma capa de cultura de tecidos estéreis. Se SAM são para ser utilizados em experiências agudas, não há necessidade de efectuar estes passos, em um ambiente estéril. <ol><li> Adicionar 75 ul de NaCl / CaCl solução adaptação 2 (Tabela 2). Agitar suavemente o frasco para misturar e incubar durante 5 min. </li><li> Adicionar 160 ul de NaCl / CaCl 2 solução de adaptação. Agitar suavemente o frasco para misturar e incubar durante 5 min. </li><li> Adicionar 390 ul de BSA Solbuição (Tabela 2). Agitar suavemente o frasco para misturar e incubar durante 4 min. </li><li> Adicionar 1,25 ml de solução de BSA. Agitar suavemente o frasco para misturar e incubar durante 4 min. </li><li> Adicionar 4,37 ml de solução de BSA. Agitar suavemente o frasco para misturar e incubar durante 4 min. Nota: A concentração final de cálcio será 1,8 mm. </li><li> Na sequência de cálcio re-adaptação, recolher SAMs, permitindo a resolver pela força da gravidade para ~ 10 min ou por centrifugação a ~ 2.000 xg por 3 min. <ol><li> Para as células agudamente isolados, suavemente remover e descartar cerca de 5 ml do sobrenadante, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, deixando as células num volume de ~ 2 ml. Armazenar estas células à temperatura ambiente durante até ~ 8 h para gravações de patch clamp. </li><li> Para células de cultura, remover tanto do sobrenadante quanto possível, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro estéril. Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) chapeamento médio (Tabela 2). </li></ol></li></ol> 8. Galvanização e Cultura da Sinoatrial Myocitos (Ir para Cells Acutely isolado) <ol><li> Remoção da solução de laminina de lamelas do Passo 3.3 com uma pipeta Pasteur. Imediatamente semear 500 ul (~ 50-100 células) em cada lamela revestida-laminina (do passo 3). NOTA: O inibidor contráctil 2,3-butanodiona monoxima (BDM) está incluído nos meios de cultura e de revestimento para impedir a contracção, o que faz com que o atrito de células 9. </li><li> Retorno da placa de 24 poços contendo SAM recentemente semeadas para a incubadora e manter a 37 ° C numa atmosfera de 95% ar / 5% de CO 2. Permitir que as células a aderir a lamelas de 4-6 h em media chapeamento (Tabela 2). </li><li> Remova cuidadosamente Galvanização Médio com uma pipeta de Pasteur estéril. Substituir com 500 ul por poço de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura (Tabela 2). </li></ol> 9. Transdução adenoviral de adultos culturas miócitos Sinoatrial (Ir para Acutely isolaram células) <ol><li> Estimar o número de cells por lamela imediatamente antes de aplicar adenovírus através da contagem de células em um campo de vista sob um microscópio, ajustando para a ampliação. Contagem de todas as células, não apenas SAMs. </li><li> Diluir adenovírus em Meio 199 e ajustar a diluição para o título virai de modo que a aplicação de 1-10 ul é necessária para alcançar uma multiplicidade final da infecção (MOI) de 100 unidades virais por célula. Adicionar solução adenoviral de uma forma gota a gota, directamente para SAM plaqueadas. </li><li> Incubar as células durante a noite com o meio contendo vírus (~ 12-14 h). Em seguida, trocar com meio de cultura fresco. Manter as células na incubadora, mudando o meio de cultura a cada 48 horas, até se obter a expressão da proteína desejada. </li></ol> 10. Avaliação Funcional de Acutely isolada ou cultivadas SAMs NOTA: O protocolo a seguir é um exemplo de avaliações funcionais de isolado SAMs usando a anfotericina técnica-patch perfurada para gravar ambos os APs espontâneos e I <sub&gt; f a partir da mesma célula (ver referência 9). <ol><li> Preparar soluções de gravação como descrito na Tabela 3. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 20 mg / mL de anfotericina-B em DMSO fresco no dia da gravação. Manter o estoque em temperatura ambiente e proteger da luz. Diluir da anfotericina-B em solução intracelular até uma concentração final de 200 ug / ml, imediatamente antes da utilização. Manter a solução da pipeta final sobre gelo e proteger da luz. NOTA: A solução da pipeta contendo anfotericina para experiências deve ser preparado fresco por hora por diluição de uma aliquota da solução de reserva para dentro da solução intracelular e vórtex durante pelo menos 1 min. </li><li> Transferir uma alíquota da suspensão de células dissociadas de forma aguda SAM ou um fragmento de lamela de vidro tendo SAM cultivadas para uma câmara de registo contendo solução de Tyrode a 35 ± 1 ° C. Perfundir as células com solução de Tyrode durante pelo menos dois minutos antes da recordin electrofisiológicogs para remover qualquer remanescente de BDM residual meio de cultura. NOTA: contrações espontâneas deve ser evidente imediatamente após a transferência para a solução de Tyrode. SAM para a gravação pode ser identificado por uma combinação de características, incluindo a actividade contráctil espontânea, a morfologia característica (por ex., Figura 2), a falta de estrias, a expressão da proteína HCN4, presença da corrente If, a capacitância de membrana &lt;50 pF, e espontâneas APs com formas de onda que incluem uma fase de despolarização diastólica e um movimento ascendente lento. </li><li> Usando pipetas de vidro de borosilicato com resistências de 1,5-3,0 mohms, preencha a ponta com a solução intracelular falta em anfotericina por imersão para 10-30 seg. Em seguida, volta a encher a pipeta com a solução contendo anfotericina. Uma vedação ligado à célula GÊ deve ser obtido tão rapidamente quanto possível. Se a formação de vedação é difícil, aumentar o tempo de ponta de enchimento. NOTA: A resistência do acesso deve ser continuamentemonitorizados após a formação do selo ligado à célula, e as gravações só deve ser iniciado após a obtenção de uma resistência acesso estável &lt;10 mohms. </li><li> Para gravar APs espontâneos, desligue o amplificador para o modo corrente de engate rápido sem injecção de corrente. NOTA: 1 nM isoproterenol está incluído na solução de Tyrode a extracelular durante a gravação de APs para estabilizar a taxa de disparo, tal como previamente relatado 10. </li></ol>

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Este artigo apresenta protocolos detalhados para o isolamento e cultura de totalmente diferenciadas miócitos nó sinusal de ratos adultos. O protocolo de isolamento produz de forma confiável SAMs rato espontaneamente activos adequados para qualquer análise eletrofisiológica imediato ou cultura subsequente. Protocolos semelhantes foram relatados por muitos outros grupos (por exemplo, ver referências 11,12,10,13-17). No entanto, o nosso protocolo para a manutenção do rato adulto in vitro SAM pre...

miócitos marcapasso no nó sinusal do coração (miócitos sinoatrial, &quot;SAMs&quot;) geram, potenciais espontâneos rítmicas ação (APs) que se propagam através do miocárdio para iniciar a cada batimento cardíaco. Experiências utilizando SAM agudamente isolados a partir de muitas espécies têm sido essenciais para a elucidação dos mecanismos que contribuem para a geração da actividade de pacemaker. SAMs são cardiomiócitos altamente especializados que diferem substancialmente dos seus homólogos na atrial e ventricular miocárdio em termos de morfologia, função e expressão da proteína. A marca da APs espontâneos em SAMs é uma despolarização espontânea durante a diástole que impulsiona o potencial de membrana até o limiar para acionar o próximo AP 1,2. Este &quot;potencial pacemaker&quot; depende da actividade coordenada de muitas correntes diferentes de membrana, incluindo o &quot;engraçado corrente&quot; (I), F e G-T- tipo correntes de cálcio, e o permutador de sódio-cálcio CurrEnt (I NCX), que é accionado por libertação de Ca2 + a partir do retículo sarcoplasmático 3,4. Enquanto intensamente isolado rato SAMs são uma preparação experimental essencial para o estudo da pacemaking, o isolamento de SAMs de camundongos pode ser um método desafiador para adotar, porque a anatomia indistinta e pequeno tamanho do SAN do mouse requer um microdissection diferenciada ea enzimática combinados e mecânica dissociação das células requer optimização cuidada. Apresentamos aqui uma demonstração de vídeo detalhada de um protocolo que foi usado com sucesso para isolar SAM a partir de murganhos adultos por gravações patch clamp 5-8. Para nosso conhecimento, não existe tal demonstração visual disponível a partir de qualquer outra fonte. Além disso, um novo método é demonstrado em que SAM isolado a partir de ratinhos adultos podem ser mantidas in vitro durante vários dias, permitindo assim a introdução de proteínas, codificado geneticamentemoléculas repórter ou ARNi via infecção adenoviral 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="649">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sylgruard/Elastomer Kit</td>
			<td style="width:167px;">Dow Corning</td>
			<td colspan="2" style="width:237px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Borosilicate 9&#34; pasteur pipettes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Small, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Large, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Elastase</td>
			<td style="width:167px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:175px;">LS002279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Liberase TM</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:175px;">5401119001</td>
			<td>&#160;Tissue dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heparin</td>
			<td style="width:167px;">SAGENT Pharmaceuticals&#160;</td>
			<td style="width:175px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">CB-354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">12 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:175px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">24-well culture plate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-mCherry</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-eGFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Plastic, disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Micro scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-8164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">WPI, Inc.</td>
			<td style="width:175px;">501264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Pins</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:175px;">26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-aspartate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Amphotericin-B</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Isoproterenol</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:175px;">420355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Media199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,3-butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">A5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice

miócitos nó sinusal (SAMs) atuam como os pacemakers naturais do coração, iniciando cada coração bater através da geração de potenciais de ação espontâneos (APs). Estes APs marcapasso refletem a atividade coordenada de numerosas correntes de membrana e ciclismo de cálcio intracelular. No entanto, os mecanismos precisos que impulsionam a atividade pacemaker espontânea em SAMs ainda imperceptíveis. Agudamente SAMs isolados são uma preparação essencial para experimentos para dissecar a base molecular da pacemaking cardíaca. No entanto, a anatomia indistinta, microdissection complexa, e as condições de digestão enzimática mimado ter evitado o uso difundido de forma aguda isolada SAMs. Além disso, os métodos não estavam disponíveis até recentemente para permitir a cultura de longo prazo de SAM para estudos de expressão proteica. Aqui nós fornecemos um passo-a-passo do protocolo e demonstração de vídeo para o isolamento de SAM a partir de ratinhos adultos. Um método também é demonstrada pela manutenção do rato adulto SAM in vitro e para Expressino de proteínas exógenas via infecção por adenovírus. Agudamente isolados e cultivados SAM preparados através destes métodos são adequados para uma variedade de estudos electrofisiológicos e de imagem.

Os protocolos descritos aqui foram anteriormente empregues para isolar SAM espontaneamente activa a partir de ratinhos adultos que são adequadas para uma variedade de diferentes estudos de patch braçadeira 5-8. Além disso, os protocolos para permitir SAM isoladas que podem ser mantidas em cultura durante até uma semana. A transferência de genes para as células em cultura pode ser realizada através de infecção adenoviral 9. Os resultados apresentados nesta s...

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Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K visualizações.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados. 

Vídeo: Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biologia

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...