We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Colorado Anschutz Medical Campus. Il protocollo standard di seguito è stato ottimizzato utilizzando maschio C57BL / 6J topi di 2-3 mesi di età. 1. Preparare Azioni e accessori per la soluzione in anticipo di esperimenti NOTA: vedi Materiali Tavolo per attrezzature e forniture necessarie. <ol><li> Preparare 1 L ciascuna delle seguenti soluzioni come indicato nella Tabella 1:, basso Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di, Modified Kraft-Brühe (KB) Soluzione e Bovine Serum Albumin (BSA) soluzione completa di Tyrode. Usa ultrapura filtrata acqua deionizzata per tutte le soluzioni. Dividere ogni soluzione in 50 ml aliquote e conservare a 20 ° C per un massimo di sei mesi. Scongelare singole aliquote immediatamente prima degli esperimenti, e conservare per un massimo di una settimana a 46; C. </li><li> Preparare 50 ml di 10 mM NaCl e 1,8 mM CaCl 2 Adattamento soluzione sciogliendo NaCl e CaCl 2 in ultrapura filtrata acqua deionizzata (Tabella 1). Conservare a temperatura ambiente per un massimo di sei mesi. </li><li> Preparare 4,75 unità di attività enzimatica (U) aliquote di elastasi pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a 4 ° C per un massimo di tre mesi. </li><li> Preparare 375 mg aliquote (in ultrapura H 2 O) di collagenasi-proteasi miscela enzimatica pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a -20 ° C per un massimo di tre mesi. </li><li> Preparare due pipette ribruciate Pasteur, uno per il trasferimento di tessuto (~ finale diametro di apertura 1,5 millimetri; Figura 1Aiv e Figura 1C) e uno per la dissociazione (~ 2 mm di diametro; Figura 1Aiii e Figura 1C). <ol><li> Punteggio pipette Pasteur con un cutter vetro e scatto lungo il punteggio di produrre un&#39;apertura leggermente più grande della dimensione desiderata. Fuoco-Polacco la fine del taglio di ogni pipetta per ~ 30-60 sec a fuoco lento su un becco Bunsen per la produzione di una parete spessa e lucida un&#39;apertura del diametro desiderato. Garantire l&#39;apertura del fuoco lucidato è privo di eventuali crepe o asperità. </li></ol></li><li> Preparare due piatti di dissezione con l&#39;aggiunta di ~ 25 ml elastomero di silicone miscelato secondo le istruzioni del produttore per ogni 100 millimetri piastra di Petri (Figura 1AI e Figura 1B). Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 48 ore. </li><li> Solo per la cultura: preparare 25-50 ml ogni placcatura Medium e terreno di coltura come da Tabella 2 Store per un massimo di due settimane a 4 ° C.. </li></ol> 2. Preparare le soluzioni da utilizzare il giorno di isolamento delle cellule NOTA: Le seguenti importi per l&#39;isolamento dei miociti seno-atriale da un mouse. <ol><li> Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode (pH 6.9) a ciascuno dei tre piccoli, tubo a fondo tondo culturaS. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca 2+ / a una grande provetta a fondo tondo di Mg 2+ Tyrode. Per questo tubo, aggiungere 1 aliquota (4,75 U) elastasi ed una aliquota (375 mcg) collagenasi-proteasi enzima miscela. Agitare per mescolare. Collocare il tubo nel 35 ± 1 ° C bagnomaria. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di KB da medio a tre piccoli, tubi di coltura a fondo tondo aggiuntivi e una grande, provetta a fondo tondo aggiuntivo. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C. </li><li> Aggiungere ~ 7 ml di soluzione BSA di un grande tubo cultura Bottomed. Mantenere questo tubo a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare 20-40 ml di soluzione completa di Tyrode in un bicchiere da 50 ml (Figura 1Aii). Aggiungere 10 USP / ml di eparina, turbine a mescolare, e posizionare il bicchiere in bagno d&#39;acqua ° C 35 ± 1. </li></ol> 3. Preparare Altre soluzioni e materiali per colture cellulari (saltare questi passaggi per cellule acutamente isolato) <ol><li>In una cappa coltura di tessuti sterili, posizionare due 12 millimetri vetrini rotondi per il mouse in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. NOTA: La piastra 24 e viene utilizzato perché i pozzi sono una dimensione conveniente, che serve a limitare il volume di infezioni virali successive. </li><li> Dispensare circa 200 ml di 100 ng / ml soluzione di laminina del mouse diluita in fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ogni vetrino. </li><li> Incubare coprioggetto con laminina per la durata dell&#39;isolamento (almeno 1 ora) in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Pre-caldo la placcatura Medium e terreno di coltura (dal punto 1.7 e tabella 3) a 37 ° C. </li></ol> Isolamento 4. senoatriale Nodo <ol><li> In una cappa, posizionare il mouse in una camera di una scatola a due camere e anestetizzare con ~ 200 ml isoflurano liquido introdotto tramite un bastoncino di cotone nell&#39;altra camera. Confermare anestesia (di solito entro 30-60 ~ sec) con un pizzico punta. euthanizemouse dislocazione cervicale. NOTA: 1 ml di dialogo punta della pipetta vuoto può essere usato per formare la scatola a due camere; girare la cremagliera a testa in giù nella casella per creare il vano separato per l&#39;isoflurano per evitare che il mouse di contattare direttamente. </li><li> Rimuovere pelliccia dal petto con le forbici e transetto gabbia toracica per esporre la cavità toracica con pinze esterni dei tessuti (Figura 1Aviii) e forbici dissezione (Figura 1Avix). Bagnare la cavità toracica con ~ 2 ml riscaldati Completa Tyrode di con eparina con una pipetta di trasferimento. NOTA: Continua cavità toracica da bagno quando è necessario, non consentono la preparazione di asciugarsi. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione i polmoni e timo con le forbici interne (Figura 1Avi) e pinze dissezione (Figura 1Avii). </li><li> Tenendo delicatamente l&#39;apice del cuore con le pinze dissezione interni, accuratamente tagliato la vena cava inferiore e l&#39;aorta con le forbici interne per rimuovere il cuore dalla cavità toracica. Trasferire il cuore di uno dei piatti dissezione silicone e fare il bagno con ~ 4 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di usare la pipetta di trasferimento. </li><li> Orientare il cuore in modo tale che i vasi posteriori sono visibili e rivolta verso l&#39;alto, con atrio destro dell&#39;animale sulla destra dello sperimentatore e atrio sinistro sulla sinistra dello sperimentatore. Una volta orientato, immobilizzare il cuore appuntando attraverso l&#39;apice nel piatto dissezione silicone. </li><li> Individuare il solco tra i ventricoli e gli atri (chiaro anello di sopra del ventricoli). </li><li> Utilizzando le forbici dissezione interna, fare un&#39;incisione in corrispondenza della scanalatura, mantenendo più vicino ai ventricoli rispetto atri. Lavare la scanalatura e incisione con ulteriore riscaldato Tyrode Completa eparinizzato di quanto necessario per consentire una visione chiara degli atri e le valvole. Continuare a tagliare lungo la scanalatura per separare gli atri dai ventricoli. </li><li>Trasferire il tessuto atriale per il secondo piatto dissezione silicone e fare il bagno con ~ 3 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di. </li><li> Orient il tessuto in modo che nell&#39;atrio destro dell&#39;animale è ora sulla sinistra dello sperimentatore, e l&#39;atrio sinistro è sulla destra. NOTA: L&#39;atrio destro è più trasparente, mentre l&#39;atrio sinistro ha più di un tono di colore rosso scuro. </li><li> Pin il tessuto attraverso la vena cava inferiore e superiore e il diritto e appendici atriale sinistra, si estende la preparazione delicatamente. Rimuovere qualsiasi tessuto grasso o altro residuo per consentire una visione chiara della preparazione (attenzione a non tagliare nella parete atriale, come il nodo seno-atriale è molto delicata e può essere facilmente danneggiato). </li><li> Aprire la parete anteriore degli atri tagliando attraverso la vena cava. Riposizionare i perni come necessario per visualizzare il setto interatriale. </li><li> Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l&#39;atrio sinistro. Re-pin della preparazione, che si estende dolcemente. </li><li> rimuovere tHa ragione atriale appendice e liberare il nodo seno-atriale tagliando lungo la terminalis creste, che appare come una striscia di colore arancione scuro al confine con l&#39;appendice atriale. </li><li> Re-pin del tessuto nodale e tagliare lateralmente (perpendicolare al terminalis crista) per la produzione di tre strisce di uguali dimensioni. </li></ol> 5. senoatriale Nodo Digestione <ol><li> Utilizzando la stretta incendio lucidato pipetta (Figura 1Aiv), trasferire i tre strisce di tessuto nodo seno-atriale nel primo dei tre piccoli, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode del nel 35 ± 1 ° bagnomaria C. Incubare per 5 min. </li><li> Strisce di tessuto trasferimento al secondo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di in ° C bagnomaria 35 ± 1, utilizzando la stessa pipetta stretta. Lavare le strisce di tessuto delicatamente roteare il tubo o pipettando delicatamente con la pipetta stretto. Non invert tubo. </li><li> Strisce di tessuto trasferimento al terzo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di, e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 5.2. </li><li> Strisce trasferimento nella grande tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode con enzimi (elastasi più miscela collagenasi-proteasi) nel bagno d&#39;acqua a 35 ° C. Assicurarsi che tutte le tre strisce di tessuto sono presenti. Incubare per 10-15 minuti a 35 ± 1 ° C. Mescolare ogni 5 minuti agitando delicatamente il tubo. Non invertire il tubo. </li></ol> 6. senoatriale Nodo miociti Dissociazione <ol><li> Dopo la digestione enzimatica, utilizzare la stretta pipetta incendio lucidato per trasferire delicatamente le strisce di tessuto al primo, il tubo a fondo tondo piccolo contenente 2,5 ml di soluzione KB a 35 ± 1 ° C. Lavare il tessuto agitando delicatamente il tubo. Nota: le strisce di tessuto saranno apparire un po &#39;trasparente e possono raggrupparsi a Thè il punto. Maneggiare molto delicatamente dopo la digestione enzimatica per evitare di perdere le cellule. </li><li> Trasferire il tessuto al secondo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare. </li><li> Trasferire il tessuto al terzo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare. </li><li> Trasferire il tessuto alla grande, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. </li><li> Utilizzando la grande pipetta incendio lucidato (Figura 1Aiii e Figura 1C), dissociare le cellule nel grande tubo a fondo tondo da costante triturazione a circa 0,5-1 Hz per 5-10 minuti, avendo cura di mantenere il tubo di dissociazione sommerso nel 35 ± 1 ° C bagnomaria e per evitare di introdurre bolle nella soluzione. Nota: tempo di triturazione varia con diametro della pipetta di dissociazione e la forza di pipettaggio. Il tempo dovrebbe essere regolata in modo che i pezzi di tessuto rimanendo a tegli fine della dissociazione appare sottile, trasparente e ciuffi. Se il tessuto mantiene qualsiasi colore, la dissociazione è probabilmente incompleta. Frequenza (0,5-1 Hz) è determinato a mano. </li><li> Rimuovere il tubo a fondo rotondo contenente dissociata SAM dal bagnomaria ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol> 7. senoatriale Nodo calcio riadattamento (Eseguita a temperatura ambiente) NOTA: Per SAM destinato per esperimenti di coltura, le procedure descritte nella sezione seguente devono essere eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti. Se SAM devono essere usati per esperimenti acuti, non vi è alcuna necessità di eseguire queste operazioni in un ambiente sterile. <ol><li> Aggiungere 75 ml di NaCl / CaCl 2 soluzione adattamento (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min. </li><li> Aggiungere 160 ml di NaCl / CaCl soluzione 2 di adattamento. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min. </li><li> Aggiungere 390 ml di BSA solution (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min. </li><li> Aggiungere 4,37 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min. Nota: La concentrazione finale di calcio sarà 1,8 mM. </li><li> A seguito di calcio riadattamento, raccogliere SAM consentendo di risolvere per gravità per ~ 10 minuti o per centrifugazione a ~ 2.000 xg per 3 min. <ol><li> Per le cellule acutamente isolate, rimuovere delicatamente e scartare circa 5 ml del surnatante con una pipetta Pasteur di vetro, lasciando le cellule in un volume di 2 ml ~. Conservare queste cellule a temperatura ambiente per un massimo di ~ 8 ore per le registrazioni di patch clamp. </li><li> Per le cellule in coltura, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile utilizzando una pipetta di vetro sterile Pasteur. Pellet Risospendere cellule in 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) Placcatura Medium (Tabella 2). </li></ol></li></ol> 8. placcatura e la cultura di senoatriale Myociti (Skip per cellule acutamente isolato) <ol><li> Rimuovere la soluzione laminina da lamelle dal punto 3.3 con una pipetta Pasteur. seminare Immediatamente 500 microlitri (~ 50-100 cellule) su ogni vetrino laminina rivestite (dal punto 3). NOTA: L&#39;inibitore contrattile 2,3-butanedione monoxime (BDM) è incluso nei media placcatura e cultura per prevenire la contrazione, che provoca logoramento delle cellule 9. </li><li> Riportare la piastra 24 pozzetti contenente SAM appena seminato al incubatore e mantenere a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO 2. Consentono alle cellule di aderire a lamelle per 4-6 ore nei media placcatura (Tabella 2). </li><li> Rimuovere delicatamente placcatura Media utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Sostituire con 500 ml per pozzetto di pre-riscaldato (37 ° C) Culture Media (Tabella 2). </li></ol> 9. trasduzione adenovirale di adulti Culture senoatriali miociti (Vai a cellule acutamente isolato) <ol><li> Stimare il numero di cells per coprioggetto immediatamente prima dell&#39;applicazione adenovirus contando le cellule in un campo visivo al microscopio, regolando per l&#39;ingrandimento. Contare tutte le cellule, non solo SAM. </li><li> Diluire adenovirus in Medium 199 e regolare la diluizione per il titolo virale in modo che l&#39;applicazione di 1-10 microlitri è necessaria per ottenere una molteplicità finale di infezione (MOI) di 100 unità virali per cellula. Aggiungere la soluzione adenovirale in modo gocce direttamente sulla placcato SAM. </li><li> Incubare le cellule con il pernottamento medio virus contenente (~ 12-14 ore). Poi scambiare con terreno di coltura fresco. Mantenere le cellule in incubatrice, cambiando la cultura media ogni 48 ore, fino ad ottenere l&#39;espressione della proteina desiderata. </li></ol> 10. La valutazione funzionale del Acutamente isolato o coltivate SAM NOTA: Il seguente protocollo è un esempio di valutazioni funzionali di SAM isolato utilizzando l&#39;amfotericina tecnica perforato-patch per registrare sia i punti di accesso spontanee e I <sub&gt; f dalla stessa cellula (vedi riferimento 9). <ol><li> Preparare soluzioni di registrazione come descritto nella tabella 3. </li><li> Preparare una soluzione stock di 20 mg / ml di amfotericina B-in DMSO fresco il giorno della registrazione. Mantenere magazzino a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Diluire amfotericina B-magazzino in soluzione intracellulare ad una concentrazione finale di 200 ug / ml al momento dell&#39;uso. Mantenere la soluzione pipetta finale sul ghiaccio e al riparo dalla luce. NOTA: La soluzione pipetta amfotericina contenente per esperimenti deve essere preparato fresco oraria diluendo una aliquota della soluzione madre nella soluzione intracellulare e vortex per almeno 1 min. </li><li> Trasferire una aliquota della acutamente dissociate sospensione cellulare SAM o un frammento di vetro vetrino cuscinetto colta SAM ad una camera di registrazione contenente la soluzione di Tyrode a 35 ± 1 ° C. Profumato cellule con la soluzione di Tyrode per almeno 2 minuti prima recordin elettrofisiologicags per eliminare ogni residuo di BDM rimanente dal terreno di coltura. NOTA: contrazioni spontanee dovrebbe essere evidente subito dopo il trasferimento alla soluzione del Tyrode. SAM per la registrazione può essere identificato da una combinazione di funzioni, tra cui attività contrattile spontanea, morfologia caratteristica (ad es., Figura 2), la mancanza di striature, espressione della proteina HCN4, presenza di corrente I f, capacità di membrana &lt;50 pF, e spontanei AP con forme d&#39;onda che includono una fase di depolarizzazione diastolica e una salita lenta. </li><li> Usando pipette di vetro borosilicato con resistenze di 1,5-3,0 MW, riempire la punta con la soluzione intracellulare carente amfotericina per immersione per 10-30 sec. Poi di nuovo riempire la pipetta con la soluzione di amfotericina contenente. Una guarnizione cell-attached GΩ dovrebbe essere ottenuto più rapidamente possibile. Se la formazione di tenuta è difficile, aumentare il tempo di punta-fill. NOTA: La resistenza accesso dovrebbe essere continuamentemonitorati dopo la formazione del sigillo cellule iscritti, e le registrazioni devono essere avviate solo dopo aver ottenuto una resistenza accesso stabile di &lt;10 MW. </li><li> Per registrare i punti di accesso spontanee, commutare l&#39;amplificatore in modalità di corrente-clamp veloce senza iniezione di corrente. NOTA: 1 nM isoproterenolo è incluso nella soluzione extracellulare Tyrode durante la registrazione di punti di accesso per stabilizzare il tasso di fuoco, come riportato in precedenza 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Irisawa, H., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+currents+in+mammalian+nodal+cells.">Pacemaker currents in mammalian nodal cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).</li><li>DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+mechanisms+in+cardiac+tissue.">Pacemaker mechanisms in cardiac tissue.</a> Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity.">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).</li><li>Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+keeps+us+ticking:+a+funny+current,+a+calcium+clock,+or+both.">What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).</li><li>Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+modulation+of+hyperpolarization-activated+HCN4+channels+by+protein+kinase+A+in+the+mouse+sinoatrial+node.">Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node.</a> J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).</li><li>Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myristoylated+peptides+potentiate+the+funny+current+(I(f))+in+sinoatrial+myocytes.">Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes.</a> Channels. 5 (2), 115-119 (2011).</li><li>Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+pacemaker+activity+of+sinoatrial+node+myocytes+contributes+to+the+age-dependent+decline+in+maximum+heart+rate.">Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate.</a> Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA-independent+activation+of+I(f)+by+cAMP+in+mouse+sinoatrial+myocytes.">PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes.</a> Channels. 7 (4), 318-321 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+sinoatrial+node+myocytes+from+adult+mice.">Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).</li><li>Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+delayed+rectifier+K++current+regulates+pacemaker+activity+in+adult+mouse+sinoatrial+node+cells.">A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+hyperpolarization-activated+current+(I(f))+in+isolated+mouse+sino-atrial+cells.">Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).</li><li>Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+properties+of+spontaneously+beating+pacemaker+cells+isolated+from+mouse+sinoatrial+node.">The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).</li><li>Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+C-type+natriuretic+peptide+on+ionic+currents+in+mouse+sinoatrial+node:+a+role+for+the+NPR-C+receptor.">Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).</li><li>Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Heart+Rate+and+Sinoatrial+Node+Function+in+Mice+Lacking+the+cAMP+Regulator+Phosphoinositide+3-Kinase-\gamma\.">Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\.</a> Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).</li><li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium.">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).</li><li>Groenke, S., Larson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+atrial-specific+knockout+of+sodium-calcium+exchange+eliminates+sinoatrial+node+pacemaker+activity.">Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity.</a> PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).</li><li>Torrente, A. G., Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Denyer, J. C., Brown, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+sino-atrial+node+cells:+isolation+and+electrophysiological+properties.">Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties.</a> J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).</li><li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Borlak, J., Zwadlo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+ATPase+inhibitor+2,3-butanedione+monoxime+dictates+transcriptional+activation+of+ion+channels+and+Ca(2+)-handling+proteins.">The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins.</a> Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).</li></ol>

Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per l&#39;isolamento e la coltura di completamente differenziate miociti nodo seno-atriale da topi adulti. Il protocollo di isolamento produce in modo affidabile SAM spontaneamente attivi del mouse adatti sia per l&#39;analisi elettrofisiologica immediata o successiva cultura. Protocolli simili sono stati riportati da molti altri gruppi (per esempio, vedere riferimenti 11,12,10,13-17). Tuttavia, il protocollo per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro...

miociti pacemaker nel nodo seno-atriale del cuore (miociti seno-atriale, &quot;SAM&quot;) generano, potenziali spontanei ritmiche d&#39;azione (AP) che si propagano attraverso il miocardio di avviare ogni battito cardiaco. Gli esperimenti che utilizzano SAM acutamente isolati da molte specie sono stati fondamentali per la spiegazione dei meccanismi che contribuiscono alla generazione di attività pacemaker. SAM sono cardiomiociti altamente specializzati che differiscono sostanzialmente dalle loro controparti nel miocardio atriale e ventricolare in termini di morfologia, funzione e l&#39;espressione della proteina. Il segno distintivo di AP spontanee SAM è una depolarizzazione spontanea durante la diastole che spinge il potenziale di membrana di soglia per far scattare la prossima AP 1,2. Questa &quot;potenziale pacemaker&quot; dipende dall&#39;attività coordinata di molte diverse correnti di membrana compreso il &quot;divertente di&quot; (I f), correnti di calcio T e L-type, e la sodico-calcico scambiatore current (I NCX), che è guidato da Ca 2+ rilascio dal reticolo sarcoplasmatico 3,4. Mentre acutamente isolato mouse SAM è una preparazione sperimentale essenziale per lo studio della pacemaking, l&#39;isolamento di SAM da topi può essere un metodo difficile adottare perché l&#39;anatomia indistinto e piccole dimensioni del mouse SAN richiede una microdissezione sfumata e la enzimatica combinata e meccanica dissociazione delle cellule richiede l&#39;ottimizzazione attenta. Forniamo qui un video dimostrativo dettagliata di un protocollo che è stato usato con successo per isolare SAM da topi adulti per le registrazioni di patch clamp 5-8. A nostra conoscenza, non esiste una dimostrazione visiva disponibile da qualsiasi altra fonte. Inoltre, un nuovo metodo è dimostrato nella quale isolato SAM da topi adulti può essere mantenuto in vitro per diversi giorni, permettendo così l&#39;introduzione di proteine, geneticamente codificatomolecole giornalista o RNAi tramite infezione da adenovirus 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="649">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sylgruard/Elastomer Kit</td>
			<td style="width:167px;">Dow Corning</td>
			<td colspan="2" style="width:237px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Borosilicate 9&#34; pasteur pipettes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Small, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Large, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Elastase</td>
			<td style="width:167px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:175px;">LS002279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Liberase TM</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:175px;">5401119001</td>
			<td>&#160;Tissue dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heparin</td>
			<td style="width:167px;">SAGENT Pharmaceuticals&#160;</td>
			<td style="width:175px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">CB-354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">12 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:175px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">24-well culture plate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-mCherry</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-eGFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Plastic, disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Micro scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-8164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">WPI, Inc.</td>
			<td style="width:175px;">501264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Pins</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:175px;">26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-aspartate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Amphotericin-B</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Isoproterenol</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:175px;">420355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Media199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,3-butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">A5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice

miociti nodo seno-atriale (SAM) agiscono come i pacemaker naturale del cuore, avviando ogni cuore battere generando potenziali d&#39;azione spontanei (AP). Questi punti di accesso pacemaker riflettono l&#39;attività coordinata di numerose correnti di membrana e il ciclismo calcio intracellulare. Tuttavia i meccanismi precisi che guidano l&#39;attività di pacemaker spontanea in SAM rimangono sfuggente. Acutamente SAM isolati sono una preparazione fondamentale per gli esperimenti di sezionare le basi molecolari della pacemaking cardiaco. Tuttavia, l&#39;anatomia indistinto, microdissezione complessa, e le condizioni di digestione enzimatica meticolosi hanno impedito l&#39;uso diffuso di acutamente isolato SAM. Inoltre, i metodi non erano disponibili fino a poco tempo per consentire la cultura a lungo termine di SAM per gli studi di espressione proteica. Qui forniamo un protocollo e video dimostrativo step-by-step per l&#39;isolamento di SAM da topi adulti. Un metodo è dimostrato anche per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro e per espressivosu di proteine ​​esogene tramite infezione da adenovirus. Acutamente isolate e coltivate SAM preparati tramite questi metodi sono adatti per una varietà di studi elettrofisiologici e di imaging.

I protocolli descritti qui sono stati precedentemente utilizzati per isolare spontaneamente attivi SAM da topi adulti che sono adatti per una varietà di differenti di patch clamp studi 5-8. Inoltre, i protocolli consentono SAM isolati che possono essere mantenute in coltura per fino ad una settimana. Il trasferimento genico nelle cellule in coltura può essere realizzato tramite infezione da adenovirus 9. I risultati presentati in questa sezione derivano dal nostro...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice at JoVE.com

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

I metodi sono dimostrati per l&#39;isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l&#39;espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

Metodi per l&#39;isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati. 

Video: Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Metodi per l'isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video