Name: a robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. pneumoniae, h. influenzae, k. pneumoniae, p. aeruginosa or a. baumannii
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or

JH deseja reconhecer e agradecer mentor, amigo e ex-gerente Valerie Berry para o primeiro nos ensinando este modelo; e Gary Woodnutt, que nos ensinou os fundamentos do e inspirou o nosso compromisso com o campo de PK / PD antibacteriano. Todos os autores gostariam de agradecer David Payne por seu apoio e valorização de nossa ciência. Gostaríamos de reconhecer a nossa ex-nos colegas vivo microbiologia que contribuíram para o corpo de dados gerados através destes métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página e Nerissa Simon. Finalmente, os nossos agradecimentos vão para os nossos in vitro colegas de microbiologia para a sua assistência, especialmente para fornecer todos os MICs nós pedido (Lynn McCloskey, Josh Oeste e Sharon Min); e para a nossa equipe de microbiologia clínica que oferece consultoria especializada e suporte (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omã e Deborah Butler).

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Os autores são todos funcionários da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals e acções próprias de estoque pagos dentro da empresa.

Para o sucesso ideal em reproduzir este modelo de infecção, as seguintes sugestões adicionais devem ser considerados. Virulência de novos isolados pode ser melhorada por passagem de 2 - 3 vezes in vivo antes da utilização num estudo. Stocks bacterianas congeladas devem sempre ser preparado a partir de uma primária in vivo fonte -derived com o menor número de passagens quanto possível do original, e recongelar ou reutilização de estoque descongelado é desencorajado. Usando isolados clínicos recentes recuperadas a partir de pacientes com pneumonia e / ou preparação de culturas em fase log de crescimento também pode ajudar a melhorar o estabelecimento da infecção. Uma diluição de cinco vezes no agar (por exemplo, 2 ml de suspensão salina adicionado a 8 ml de agar) pode ser usado em vez de dez vezes para aumentar o inoculo bacteriano, e o volume de inoculo pode ser ajustada com base no tamanho do animal (por exemplo, 200 uL / ​​animal é geralmente inoculado em ratos 250 g). Antes da adição da suspensão bacteriana em soro fisiológico aágar (isto é, no Passo 2.3), a densidade bacteriana pode ser prevista ou estimada por inspecção visual, padrões MacFarland ou medições de densidade óptica. É útil para se familiarizar com as características de crescimento in vitro para cada isolado antes da realização de experimentos in vivo. Consistência no crescimento e manuseamento permite a estimativa mais precisa da densidade bacteriana para qualquer dado isolado. métodos microbiológicos padrão que diferem daqueles descritos, tais como meios de comunicação e homogeneizadores de tecido alternativa, podem ser utilizados como apropriados para a preparação de inóculos e enumeração de bactérias a partir de tecidos infectados. É altamente recomendável para preparar ou derreter o agar do dia antes da experiência, e armazená-la durante a noite num banho de água separada definida para 50 ° C. Isto vai simplificar o processo e ajudar a proteger contra o agar ser demasiado quente no momento da infecção. A temperatura de 41-42 ° C constitui um bom equilíbrio entre a manutenning o agar em estado líquido, sem ser demasiado quente para a sobrevivência bacteriana de curto prazo. Como uma alternativa possível à de agar nutriente, ágar nobre tem sido utilizada com sucesso em algumas experiências. Um tubo de inoculo de ágar é geralmente suficiente para um experimento inteiro (e é recomendado), mas vários tubos podem ser preparados para infectar um grande número de animais (por exemplo, mais de 60) ou quando o processo de infectar demora mais do que 30 - 45 min Se múltiplos tubos de inóculo são necessários, adicionar a suspensão bacteriana solução salina a cada tubo de agar tal como é necessário. Isto reduz o risco de que a sobrevivência e / ou a forma física bacteriana irá ser afectada pela exposição prolongada a uma temperatura elevada antes da inoculação. Deve notar-se que o uso de vários tubos de inoculo pode também requerer procedimentos de randomização animais adicionais. Sempre que possível, infectar todos os animais a partir da mesma preparação de inoculo. Recomenda-se a adaptar o tamanho de experimentos para o nível atual de proficiência com o technique. Um cientista especialista pode intubação e inocular um animal em menos de 30 s, e inocular até 5 - 6 animais por lote (isto é, com uma seringa cheia de inoculo de ágar). Para aqueles que aprender a técnica, a velocidade é importante como o agar vai começar a solidificar; No entanto, a colocação precisa do inoculo é mais importante. Comece com 1 ou 2 animais por lote, e aumentar à medida que a técnica torna-se mais familiar. Os animais continuam a respirar durante a intubação; Assim, a janela de tempo para a inoculação depende da rapidez com que o animal recupera de isoflurano, o que deve ser de aproximadamente 2-3 min. Os animais que despertam durante o processo pode ser re-anestesiados e tentado uma segunda vez, mas isto não é recomendado para o fazer repetidamente. inoculação bem sucedida na primeira tentativa, é esperado em quase 100% dos animais uma vez proficiência é alcançada. Note-se que é mais fácil de aprender a técnica utilizando ratos em primeiro lugar; ratinhos são mais delicados e muito menorls são mais propensas ao bloqueio com agar solidificado se não for manipulado rapidamente. seringas pré-aquecimento, tubos e salinas, bem como manter o dispositivo de intubação em uma superfície quente (não quente), como uma almofada de aquecimento em baixa definição, podem ajudar a prevenir a solidificação do agar. Quando a aprendizagem da técnica, também é útil para a prática de colocação adequada do inoculo utilizando um corante de cor escura (tais como azul de metileno concentrado) em vez da suspensão bacteriana em ágar. Realizar o processo tal como descrito, mas sacrificar o animal imediatamente após a inoculação do corante (não permitindo que o animal recuperar da anestesia e eutanásia). Dissecar a determinar onde o corante foi colocado, e ajustar em conformidade técnica. O endpoint primário neste modelo é CFU dos pulmões infectados. A sobrevivência não é um bom indicador da carga bacteriana e não é um desfecho recomendado. Para os estudos de eficácia, o N sugerida é de 5 - 6 animais por grupo como este é predicted para detectar diferenças de log ≥1 10 CFU entre grupos com pelo menos 90% de energia. Os animais podem ser infectados em grupos de tal forma que permanecem em conjunto companheiros de gaiola, ou um verdadeiro processo de randomização pode ser seguido. Note que se os grupos são designados por gaiola, os grupos deve ser infectado numa sequência aleatória com os controlos de crescimento de fim de estudo última infectadas (para confirmar que a sobrevivência bacteriana / aptidão não foi afectada pelo comprimento de tempo de exposição a uma temperatura elevada no banho de água). Nenhum método de censura dados deve ser necessário, e nenhum é recomendada, com excepção da remoção imediata de qualquer animal que tenha sido obviamente mis-inoculados no início do estudo (antes do início de quaisquer tratamentos). Os animais que são sacrificados antes do final do estudo deve ser amostrada e resultados incluídos no conjunto de dados, a menos que uma razão válida para exclusão prospectivamente foi identificado (isto é, um evento não relacionado com o tratamento ou infecção). carryover droga pode affect algumas amostras e é uma consideração importante em todos os modelos de infecção in vivo. Se um composto é dada frequência, perto da hora da eutanásia ou tem uma semi-vida longa, pode estar presente no homogenato de tecido a uma concentração suficientemente elevada para continuar a matar bactérias ex vivo durante o processo de enumeração de bactérias (diluição e plaqueamento de as amostras ou sobre as placas de agar durante a incubação durante a noite). Para evitar isso, carvão activado e / ou um aditivo que degrada a molécula activa, sem prejudicar as células bacterianas podem ser adicionados à amostra antes da homogeneização. Outros métodos incluem a centrifugação das amostras para remover a maioria do composto activo (o qual deve permanecer no sobrenadante) e empregando diluição diferente e plaqueamento regimes suficientemente para diluir o composto activo a uma concentração não inibidora. Como evidenciado pelos exemplos mostrados na Figura 2, este modelo com sucesso induces infecções pulmonares em roedores com uma ampla gama de organismos incluindo aqueles que não crescem bem em outros modelos (por exemplo, H. influenzae). Estas infecções são consistente e reprodutível, reduzindo a probabilidade de que as experiências terá de ser repetido devido à falha de modelo e / ou pobre desempenho com um dado isolado. Embora os animais são imunocompetentes, eles são incapazes de resolver rapidamente a infecção, se em tudo. Isto permite uma maior flexibilidade na duração do estudo, tal como muitos isolados manter uma infecção viáveis ​​através de pelo menos 96 horas sem a necessidade de injecções repetidas para manter a neutropenia. A vantagem potencial de estudar a eficácia antibacteriana em animais imunocompetentes foi observado anteriormente 20, 21, e há evidências de que, para alguns compostos (por exemplo, oxazolidinonas), os dados a partir de roedores não neutropénicos pode prever com maior precisão alvos de exposição humanos em comparação com aqueles neutropénicos rendeu 5. O utilitário multi-propósito de tEle modelo é demonstrado nas Figuras 3 e 4 e as Tabelas 1 e 2. Estes estudos são parte de uma grande coleção de dados publicados e não publicados que foi gerado com este modelo para apoiar os esforços de otimização de chumbo 16, 17, 22-24, para comparação e confirmação da dosagem humana propostos esquemas 19, 25-29 e para a caracterização de PK / PD 18, 30-32 .enquanto este modelo é inicialmente mais complexo de realizar em comparação com o método de inalação intranasal, existem muitas vantagens descritas acima. Com prática e uso rotineiro, as técnicas devem tornar-se simples de executar. Pode notar-se, em alguns estudos que a carga bacteriana na linha de base era menor do que a normalmente orientada em outros modelos de infecção pulmonar. Isto é devido em grande parte à diluição necessária em agar e o volume desafio pequeno, particularmente em ratos. No entanto, também deve ser notadoque o crescimento bacteriano foi observado em todos os casos, mesmo quando a carga inicial era relativamente baixa. A carga bacteriana de base alvo é 6 a 6,5 log 10 CFU / pulmões (6,8 a 7,3 log 10 UFC / g de tecido em ratinhos baseados em pesos médios do pulmão) que corresponde a densidades estimadas em pacientes humanos com pneumonia grave 33. Uma carga de linha de base superior pode ser alcançado por concentração adicional do inoculo bacteriano ou atrasar o início da administração do composto para permitir o crescimento bacteriano adicional; No entanto, o aumento da carga de desafio em excesso pode levar a doença grave e anormalmente aguda (ou seja, morte em menos de 24 h), que é refractário a todos os tratamentos antibacterianos independentemente de susceptibilidade. Embora o inoculo é inicialmente colocado preferencialmente no pulmão esquerdo do animal, geralmente a infecção se espalha por ambos os pulmões. doença progressiva do pulmão, a disseminação das bactérias a outros órgãos, e eventual morbilidade é muitas vezes observed com S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. De interesse, infecções com H. influenzae e A. baumannii são geralmente mais contido e raramente levar à morte no inóculos bacterianos prescrito. Os resultados de eficácia obtidos com este modelo tem demonstrado boa correlação com in vitro perfis de susceptibilidade, bem como metas PK / PD definidos. Reduções na carga bacteriana são rotineiramente observada para isolados consideradas susceptíveis ao agente a ser testado, enquanto que as consideradas resistentes exibem nenhuma mudança ou crescimento bacteriano acima da linha de base 16, 17, 19, 24-29. Estudos em ratos avaliando dois quinolonas e um macrólido de utilizar este modelo de 32 mostraram que o alvo de PK / PD necessário para um 1-log 10 redução em S. pneumoniae em comparação com os valores basais correlacionada com o alvo determinada em ratinhos neutropénicos e, mais importante ainda, com alvos clínicos para pneum bacteriana adquirida na comunidadeonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, um mecanismo novo antibiótico, foi testada contra vários S. pneumoniae e necessário um alvo PK / PD semelhante para um 1-log 10 redução neste modelo de infecção pulmonar 31 que o exigido para um 1-log 10 redução no modelo da coxa neutropénicos 36 quando a penetração de pulmão foi tida em conta (dados em arquivo). Do mesmo modo, os objectivos de PK / PD para determinados em ratinhos GSK2251052 contra P. aeruginosa foram consistentes para estase, 1- e 2-log em CFU 10 reduções entre este modelo de pulmão 30 e o modelo de infecção coxa neutropénicos quando a penetração pulmonar foi considerada 37, 38 . Correlação com um modelo de infecção pulmonar neutropênica usando inoculação intranasal era pobre; no entanto, GSK2251052 não produzir mais do que uma resposta estática nesse estudo 38. Isto pode ser atribuível ao inoculo bacteriano superior, que foi de 8 log 10 UFC / murganho, em comparação com 6 log <sub&gt; 10 UFC / rato na coxa neutropenia 37 e intratraqueal intubação 30 modelos. Recolha de dados como este é fundamental para a avaliação comparativa, já que permite a comparação directa com os modelos e correlação com dados clínicos existentes para avaliar a capacidade preditiva de translação. utilização mais generalizada do modelo de infecção pulmonar de intubação orotraqueal irá fornecer dados adicionais para estes tipos de análises. Existem várias limitações deste modelo de pneumonia imunocompetentes. Em primeiro lugar, não é bem adequado para avaliar o surgimento de resistência espontânea porque o inoculo bacteriano alta geralmente exigido para tais estudos resulta em uma infecção muito grave. Na sequência de tentativas para conseguir cargas bacterianas de 7 ou 8 log 10 CFU no início do estudo, a morbidade rápida tem sido observado (ou seja, animais tornando-se moribunda em menos de 24 h), apesar de lavagem completa dos inóculos para remover toxinas pré-existentes (dados em arquivo). istopode ser possível superar esse problema usando roedores maiores. Ratos, ratazanas especialmente mais pesados ​​(&gt; 250 g), parecem tolerar melhor inóculos maiores, em comparação com os ratos e pode ser adequado para estes tipos de estudos. Uma segunda limitação é que a utilização de uma infecção de agar como potenciador pode excluir a utilização do modelo para a avaliação de certos hospedeiro: agente patogénico. Acredita-se que o agar fornece um ponto focal protegida até que a infecção está totalmente estabelecida no interior do pulmão. É possível entregar o inóculo em solução salina em vez de agar para ajudar a superar este problema; No entanto, deve notar-se que isto apenas irá produzir infecção com alguns isolados. Em terceiro lugar, há uma curva de aprendizagem necessária para se tornar proficientes na técnica. O procedimento pode ser delicada, especialmente em ratinhos. É fácil colocar erroneamente a cânula de metal para o esôfago e força excessiva poderá causar perfuração, quer do esófago ou da traqueia. colocação cuidadosa do inoculo é igualmenterequerido ou animais podem ou não se recuperar ou não ser adequadamente infectadas. No entanto, com paciência e perseverança, pode tornar-se altamente proficiente e executar a técnica rápida, suave e precisa. Ao eliminar a necessidade de neutropenia, aumentando a robustez e reprodutibilidade, permitindo que os investigadores a estudar mais patógenos e isolados, melhorando a flexibilidade do design experimental e proporcionando uma infecção difícil de caracterizar farmacodinâmica para pneumonia, este modelo infecção pulmonar imunocompetentes agrega valor substancial para a descoberta de antibióticos comunidade. O aumento da utilização deste modelo por investigadores adicionais ajudará a fornecer a avaliação comparativa necessária para que adquiram uma aceitação mais ampla e continuar a fornecer informações de suporte para a interpretação apropriada.

Avaliação da eficácia de potenciais candidatos de drogas em modelos animais de infecção é um componente crítico do processo de descoberta de drogas anti-bacteriano. In vivo os estudos de eficácia fornecer dados importantes para toda a extensão dos esforços de descoberta, de elucidar relações estrutura-actividade (SAR) e otimizar série química chumbo através da determinação farmacocinética-farmacodinâmica (PK / PD) características dos compostos e apoiar a selecção da dose para a tomada de decisão desenvolvimento clínico e aprovação regulamentar. Numerosos modelos de infecção de animais estão descritos na literatura para estes fins. Um dos modelos mais comuns e amplamente utilizados é a infecção do mouse coxa neutropenia, que foi lançada pela Águia 1, 2 e mais tarde expandiu-se Vogelman e Craig 3, 4. Este modelo tem sido inestimável para apoiar a determinação dos limites de susceptibilidade bacteriana e para fornecer metas de PK / PD para orientar a dosagem humana. Existem muitos examepios em que a capacidade preditiva do modelo foi provado 4-7. No entanto, um dos inconvenientes do modelo de infecção coxa é a falta de relevância directa para infecções pulmonares. Existe agora um maior ênfase na correspondência do local da infecção em modelos animais para o local da infecção em seres humanos; e, assim, estudar a compostos para o tratamento de pneumonia, que é ideal para utilizar um modelo de infecção pulmonar em animais. Vários métodos para a indução de infecções pulmonares em animais de laboratório foram descritos e utilizados para estudos de eficácia antibacterianos incluindo a inalação intranasal, a aspiração através da via orofaríngea, exposição ao aerossol, e cirúrgica inoculação intratraqueal 8. Em muitos casos, os animais (ratos) em particular deve primeiro ser tornado neutropenia, a fim de alcançar uma infecção pulmonar robusta. Apesar deste estado gravemente imunocomprometidos, o número de agentes patogénicos bacterianos e as estirpes que produzem infecções viáveis ​​é em roedoreslimitado. Por exemplo, pode ser difícil estabelecer com sucesso Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii em modelos pneumonia 9, 10, e patógenos ainda mais virulentos, tais como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, podem representar desafios 11-13. Em 1991, Smith descreveu um modelo de infecção pulmonar em ratos recém-desmamados imunocompetentes em que a infecção foi estabelecida por incutir bactérias directamente para os pulmões por meio de um método não cirúrgico simples intubação intratraqueal 14. Berry et al. posteriormente modificado o método para infectar ratos 15. Usando um inoculo de ágar-base, esta técnica de inoculação induz infecções pulmonares robustas tanto em ratos imunocompetentes e ratinhos com S. pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. É favorável para uma grande variedade de isolados, incluindo aqueles abrigando vários resistirdeterminantes Ance e aquelas que não produzem uma infecção viável por outras vias de inoculação. Ele também permite que a eficácia deve ser determinada em animais imunocompetentes, uma condição que é mais relevante do que o modelo do rato neutropênica tradicional para populações de pacientes que não estão gravemente imunocomprometidos. A consistência e confiabilidade deste modelo em vários patógenos e isolados torna adequado para estudos de eficácia antibacterianos.

<table><tbody><tr><td>TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate II Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Broth Modified</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>storage media for frozen stock</td></tr><tr><td>Inoculating loop</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>30 mL free standing centrifuge tube with cap</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm</td><td>Falcon, a Corning Brand</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm</td><td>Falcon, a Corning Brand</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Guide Tool</td><td>Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>custom-made metal cannula for rats</td></tr><tr><td>90&#039; Portex tubing</td><td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>plastic cannula for rats</td></tr><tr><td>1 mL TB syringe slip tip</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Animal feeding needle - straight 20 x 3&quot; 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>used to create metal cannula for mice</td></tr><tr><td>Intramedic polyethylene tubing</td><td>Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>plastic cannula for mouse&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 &amp;micro;L syringe 26s/2&quot;/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>HPLC glass injection syringe</td></tr><tr><td>Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>to autoclave/store metal cannulae</td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol</td><td>Vi-Jon (Swan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&amp;nbsp;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Assay plate, 96 well, round bottom</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>optional, for serial diluting</td></tr><tr><td>Blood Omni Plates</td><td>Hardy</td><td>#A127</td><td>optional, rectangular blood plates</td></tr></tbody></table>

a robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. pneumoniae, h. influenzae, k. pneumoniae, p. aeruginosa or a. baumannii

A eficácia dos tratamentos antibacterianos candidatos deve ser demonstrada em modelos animais de infecção, como parte do processo de descoberta e desenvolvimento, de um modo preferido em modelos que mimetizam a indicação clínica pretendido. Um método para induzir infecções pulmonares robustos em ratos e ratinhos imunocompetentes é descrito que permite a avaliação dos tratamentos em um modelo de pneumonia grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ou A. baumannii. Os animais são anestesiados, e um inoculo de ágar-base é depositado profundamente no pulmão através de intubação intratraqueal não cirúrgico. A infecção resultante é constante e reprodutível, e estável durante pelo menos 48 h e até 96 h para a maioria dos isolados. Estudos com antibacterianos comercializados têm demonstrado boa correlação entre a eficácia in vivo e in vitro susceptibilidade, e concordância entre farmacocinética / farmacodinâmica alvos determinadosneste modelo e alvos clinicamente aceites tem sido observado. Embora não haja um investimento de tempo inicial quando a aprendizagem da técnica, pode ser realizada rápida e eficiente uma vez que a proficiência é alcançada. Benefícios do modelo incluem a eliminação da exigência de neutropenia, o aumento da robustez e reprodutibilidade, capacidade de estudar mais patógenos e isola, maior flexibilidade no desenho do estudo e estabelecimento de uma infecção desafiador em um hospedeiro imunocompetente.

As ferramentas necessárias, a orientação do animal, e a profundidade da intubação são mostrados na Figura 1. Também é mostrado um exemplo representativo de colónias que crescem em uma placa de agar após a diluição em série e placas em triplicado de uma amostra de homogenato de pulmão. Um aumento da carga bacteriana de várias log 10 CFU acima dos controlos de linha de base é normalmente observada em pulmões infectados por isolados mais bacterianas, mesmo a 96 h após a infecção, e a variabilidade entre os animais é baixo (Figura 2). Para alguns H. influenzae, pode haver pouco crescimento; No entanto, a infecção não deve começar a auto-resolver dentro de um período de tempo de 48 ou 96 h (Figura 2B). Este modelo de infecção pulmonar pode ser utilizado durante a optimização da série química chumbo para suportar SAR, como mostrado na Figura 3 para os compostos representativos de duas séries diferentes 16, 17. Ele fornece uma consistente, reproduzível conheceuHod para avaliar PK / PD em animais imunocompetentes e foi utilizado para determinar que a área de fármaco livre sob a curva concentração-tempo, em relação à concentração inibidora mínima (fAUC / MIC) correlacionada com a eficácia de um novo polipéptido deformilase (PDF) inibidor contra S. pneumoniae e H. influenzae (Figura 4). Além disso, os alvos / MIC fAUC para estase, a 1 log 10 redução de CFU dos controles de linha de base foram determinados através de 11 S. pneumoniae e 5 isolados de H. influenzae (Tabela 1) 18. Acoplamento deste modelo de infecção com um sistema de entrega de droga para recriar perfis farmacocinéticos humanos em ratos cria uma ferramenta poderosa para avaliar os regimes de dosagem humanos antes de estudos clínicos. Um exemplo disto é resumido na Tabela 2, o que demonstra que uma formulação de libertação prolongada de amoxicilina-clavulanato foi mais eficaz do que os regimes de dosagem para os organismos existentes com Elevated MIC valores 19. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Figura 1: Nonsurgical intratraqueal intubação. As ferramentas são mostrados para a entubação de rato (A) e o rato (B). Uma vez anestesiados, o animal deve ser posicionado como mostrado na C, com a cabeça para a direita e da cauda à esquerda se o indivíduo que executa a técnica é destro. Coloque o dedo indicador esquerdo gentilmente na garganta para ajudar a apalpar os anéis traqueais para a confirmação da colocação de uma cânula correta. O inoculo deve ser colocado profundamente no pulmão esquerdo, como mostrado na vista ventral de um pulmão de rato (D). As colónias que crescem em agar após diluição em série e plaqueamento de uma amostra deve ser semelhante ao mostrado na E. Figura 1D, Direitos de Autor © Gill Smith [Animais de Laboratório, Volume 25 (1991), G. Smith, Amétodo não-cirúrgico simples da instilação intrabronquial para o estabelecimento de infecções respiratórias em ratos, páginas 46 - 49] 14. Reproduzido com permissão. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplos representativos de crescimento bacteriano nos pulmões de animais infectados. Média ± desvio CFU dados padrão a partir de n = 5 animais / grupo é mostrado para vários isolados de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) e A. baumannii (E). O primeiro bar de cada par (cinza claro) é a linha de base bactericidafardo rial em 1 ou 2 h após a infecção, enquanto o segundo bar é o controle do crescimento de fim de estudo às 48 h após a infecção (cinza escuro) ou 96 h após a infecção (preto). Nenhum método de censura dados foram aplicadas; Assim, estes resultados incluem os dados de todos os 5 animais por grupo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Figura 3: Avaliar a eficácia de várias séries químicas durante a Otimização do Chumbo. modelos de infecção pulmonar, utilizando as técnicas descritas foram utilizadas para explorar relações estrutura-actividade, como parte do programa de tipo não-bacteriana topoisomerase II. Compostos promissores 7 e 1 foram avaliadas contra quinolonas-suscetível (A) 16 ou resistentes à quinolona(B) 17 isolados de S. pneumoniae, respectivamente. Cada símbolo representa CFU determinada a partir dos pulmões de um rato, com linhas que representam o grupo de média e desvio padrão. Limite inferior de quantificação (LIQ) foi de 1,7 log 10 UFC / pulmões. Os compostos foram pesados ​​(56 ou 112 mg de molécula progenitora livre pura), dissolvido em 9 mL de água estéril, diluiu-se 3 mL em 3 mL de água (1: 1) e administrado por gavagem oral de 1 ml / 125 g de rato duas vezes por dia ( 6 - 7 horas de intervalo), durante 2 dias, a partir de 1 h após a infecção. controlos não tratados (NTC) foram amostrados a 1 h após a infecção para a linha de base ou tratados com solução salina e amostrado no final do estudo (48 h) para os controlos de crescimento. Figura 3A reproduzido a partir Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, ciclo-amidas romance como antibacterianos potentes tipo de segmentação bacteriana IIA topoisomerases, Páginas 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, com a permissão de Elsevier.Figura 3B reproduzido a partir Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, tricíclicos novel (por exemplo GSK945237) como inibidores potentes do tipo bacteriana IIA topoisomerases, Páginas 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, com a permissão de Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Figura 4: PK / PD Caracterização de um inibidor de PDF Novel. Modelos Emax foram criadas usando doses variando dados de eficácia em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae (A) ou H. influenzae (B) para determinar PK alvos / PD para um novo inibidor PDF 18. círculosrepresentam a carga bacteriana média 4-5 ratinhos / grupo tratados com diferentes doses de composto. As análises foram realizadas para correlacionar com eficácia sem droga 24 h AUC (círculos abertos) ou AUC / MIC (círculos a cheio). Reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, o volume 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> estase </td><td colspan="2"> 1-log 10 redução </td><td></td></tr><tr><td> Organismo </td><td> microfone (ug / ml) </td><td> R 2 para linha fiT (%) </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> Max assassinato (log 10 redução) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0,25 </td><td> 99,9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14,4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0,25 </td><td> 96,1 </td><td> 6.5 </td><td> 26,0 </td><td> 15.1 </td><td> 60,3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0,5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16,9 </td><td> 22.2 </td><td> 44,5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95,8 </td><td> 16,1 </td><td> 16,1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 19.8 </td><td> 19.8 </td><td> 24,8 </td><td> 24,8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15,8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298443 </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 26,5 </td><td> 13.2 </td><td> 31,0 </td><td> 15,5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19,0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338860 </td><td> 2 </td><td> 99,5 </td><td> 2.9 </td><td> 1,5 </td><td> 6,7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94,6 </td><td> 8 </td><td> 4.0 </td><td> 14,9 </td><td> 7,4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3,5 </td><td> 9 </td><td> 4,5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Média ± SD </td><td> NA uma </td><td> N / D </td><td> 11,0 ± 7,5 </td><td> 11,0 ± 7,9 </td><td> 17,0 ± 8,2 </td><td> 19,5 ± 17,8 </td><td> 2,3 ± 0,5 </td></tr><tr><td> Mediana </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19,0 </td><td> 14,4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99,7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13,4 </td><td> 13,4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13,9 </td><td> 13,9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 14,5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96,6 </td><td> 15,3 </td><td> 7.6 </td><td> 26,0 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91,9 </td><td> 14,8 </td><td> 3.7 </td><td> 37,3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Média ± SD </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 11,8 ± 4,2 </td><td> 6,6 ± 1,6 </td><td> 21,5 ± 10,2 </td><td> 11,6 ± 2,6 </td><td> 2,8 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Mediana </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 14,5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> a NA, não aplicável. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: PK / PD Metas para um inibidor PDF Novel contra S. pneumoniae e H. influenzae isolados. AUC livre de drogas e de AUC / metas MIC para estase e uma 1-log 10 redução no UFC da linha de base foram determinados para 11 S. pneumoniae e 5 H. influenzae em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão e tratados com o composto 18. o datum foi utilizado para ajudar a doses humanas selecionadas para desenvolvimento clínico. Este quadro foi adaptado e reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, o volume 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Grupo Tratamento A </td><td colspan="8"> A média de log 10 S. pneumoniae (CFU / pulmão) b ± SD para a estirpe (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 ug / ml) </td><td> 16001S c (4 ug / ml) </td><td> 16001S (4 ug / ml) </td><td> 30005S (4 ug / ml) </td><td> 20009S (4 ug / ml) </td><td> 05003S (8 ug / ml) </td><td> 404053 (8 ug / ml) </td><td> 47003S (8 ug / ml) </td></tr><tr><td> Ao controle </strong&gt; </td><td> 7,3 ± 0,4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5,7 ± 1,2 </td><td> 7,1 ± 0,7 </td><td> 7,1 ± 0,4 </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 6,8 ± 0,4 </td><td> 6,0 ± 0,3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.000 / 125 mg bid (proporção 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2,8 ± 1,2 ** </td><td> 2,2 ± 0,8 ** </td><td> 2,3 ± 0,9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2,0 ± 0,9 ** </td><td> 3,8 ± 1,4 ** </td><td> 1,8 ± 0,2 ** </td></tr><tr><td> 1000/125 mg três vezes por dia (proporção 8: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 2,8 ± 0,5 ** </td><td> 2,7 ± 1,3 ** </td><td> 3,3 ± 0,9 ** </td><td> 4,9 ± 0,5 ** </td><td> 6,6 ± 1,3 </td><td> 4,7 ± 0,7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg, td (proporção 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 3,0 ± 1,3 * </td><td> 2,1 ± 0,7 ** </td><td> 3,2 ± 0,4 ** </td><td> 5,2 ± 0,9 * </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 4,9 ± 0,4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (proporção 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,5 ± 1,2 * </td><td> 5,6 ± 1,3 * </td><td> 5,2 ± 0,7 ** </td><td> 6,3 ± 0,7 </td><td> 6,4 ± 0,7 </td><td> 5,5 ± 0,4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg, td (proporção 4: 1) </td><td> 3,1 ± 1,3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 5,8 ± 2,0 </td><td> 7,1 ± 0,9 </td><td> 3,1 ± 1,0 ** </td><td> 6,6 ± 0,4 </td><td> 67; 0,6 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,2 ± 0,8 * </td><td> 5,7 ± 0,8 * </td><td> 4,9 ± 0,8 ** </td><td> 3,0 ± 1,3 ** </td><td> 3,5 ± 0,2 ** </td><td> 3,9 ± 0,8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Grupo de Tratamento d </td><td colspan="8"> A média de log 10 H. influenzae (CFU / pulmão) ± SD para a estirpe: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-lactamase positiva) </td><td colspan="4"> divã (β-lactamase negativa, resistente à ampicilina) </td></tr><tr><td> Ao controle </td><td colspan="4"> 6,4 ± 0,6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.000 / 125 mg bid (proporção 16: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,7 ** </td><td colspan="4"> 3,1 ± 0,9 ** </td></tr><tr><td> 1000/125 mg três vezes por dia (proporção 8: 1) </td><td colspan="4"> 2,1 ± 1,0 ** </td><td colspan="4"> 3,6 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg, td (proporção 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,8 ± 1,3 ** </td><td colspan="4"> 3,8 ± 1,3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (proporção 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,8 ** </td><td colspan="4"> 5,1 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td colspan="4"> 3,2 ± 1,7 * </td><td colspan="4"> 5,8 ± 1,1 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> AMX / CA, amoxicilina-clavulanato; oferta, duas vezes por dia; tid., três vezes ao dia; OD, uma vez por dia. </td></tr><tr><td colspan="9"> b O limite de detecção foi de &lt;1,7; *, Significativamente diferente do controlo (P ≤ 0,05); **, Significativamente diferente do controlo (P ≤ 0,01); NT, Não testado. </td></tr><tr><td colspan="9"> c Strain 16001S foi testado em duas experiências separadas. </td></tr><tr><td colspan="9"> d-amoxicilina clavulanato de 500/125 mg (4: 1), três vezes por dia não foi testado contra as estirpes de H. influenzae. </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Eficácia de perfis de exposição Recreated plasma humano para diferentes Amoxicilina / Clavulanato regimes de dosagem. Os dados gerados em ratos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae ou H. influenzae usando este modelo demonstrou que uma formulação melhorada de amoxicilina-clavulanato (2, 000/125 mg duas vezes por dia) foi mais eficaz do que os regimes de dosagem padrão contra isolados com elevada sensibilidade in vitro 19. Este quadro foi adaptado e reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, Volume 49, 2005, páginas 908 - 915] 19.

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A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

14.6K visualizações.  GlaxoSmithKline. A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Imunologia e Infecção

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, murine models of co-infection have been the primary tool developed to explore the pathologies of both the primary and secondary infections. Despite the prevalence of this model, considerable discrepancies regarding instillation procedures, dose volumes, and efficacies are prevalent among studies. Furthermore, these efforts have been largely incomplete in addressing how the pathogen may be directly influencing disease progression post-infection. Herein we provide a precise method of pathogen delivery, recovery, and analysis to be used in murine models of secondary bacterial pneumonia. We demonstrate that intratracheal instillation enables an efficient and accurate delivery of controlled volumes directly and evenly into the lower respiratory tract. Lungs can be excised to recover and quantify the pathogen burden. Following excision of the infected lungs, we describe a method to extract high quality pathogen RNA for subsequent transcriptional analysis. This procedure benefits from being a non-surgical method of delivery without the use of specialized laboratory equipment and provides a reproducible strategy to investigate pathogen contributions to secondary bacterial pneumonia.

Here, we present methods to improve secondary bacterial pneumonia studies by providing a non-invasive route of instillation into the lower respiratory tract followed by pathogen recovery and transcript analysis. These procedures are reproducible and can be performed without specialized equipment such as cannulas, guide wires, or fiber optic cables.

Um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative pathogens. Infectious pneumonia is among the most common infections presented by patients in the clinic and thus warrants an appropriate in vivo model. Typical pneumonia models use intranasal inoculation, which deposits excessive organisms outside the lung, causing off-target complications and symptoms, such as sinusitis, gastritis, enteritis, physical trauma, or microparticle misting to mimic aerosol spread more typical of viral, tuberculous, or fungal pneumonia. These models do not accurately reflect the pathogenesis of typical community- or healthcare-acquired bacterial pneumonia. In contrast, this murine model of oropharyngeal aspiration pneumonia mimics the droplet route in healthcare-acquired pneumonia. Inoculating 50 &#181;L of the bacteria suspension into the oropharynx of anesthetized mice causes reflexive aspiration, which results in pneumonia. With this model, one can examine the pathogenesis of pneumonia-causing pathogens and new treatments to combat these diseases.

Infectious pneumonia is among the most common infections in human. An appropriate in vivo model is critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics. With this murine oropharyngeal aspiration pneumonia model, one can examine the pathogenesis and new treatments against these deadly infections.

Modelo murino aspiração orofaríngea da Pneumonia bacteriana associada e hospitalares

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

Medicina

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic pathogen upon influenza A virus (IAV) infection. Advanced age enhances host susceptibility to secondary pneumococcal pneumonia and is associated with worsened disease outcomes. The host factors driving those processes are not well defined, in part due to a lack of animal models that reproduce the transition from asymptomatic colonization to severe clinical disease. 
This paper describes a novel mouse model that recreates the transition of pneumococci from asymptomatic carriage to disease upon viral infection. In this model, mice are first intranasally inoculated with biofilm-grown pneumococci to establish asymptomatic carriage, followed by IAV infection of both the nasopharynx and lungs. This results in bacterial dissemination to the lungs, pulmonary inflammation, and obvious signs of illness that can progress to lethality. The degree of disease is dependent on the bacterial strain and host factors. 
Importantly, this model reproduces the susceptibility of aging, because compared to young mice, old mice display more severe clinical illness and succumb to disease more frequently. By separating carriage and disease into distinct steps and providing the opportunity to analyze the genetic variants of both the pathogen and the host, this S. pneumoniae/IAV co-infection model permits the detailed examination of the interactions of an important pathobiont with the host at different phases of disease progression. This model can also serve as an important tool for identifying potential therapeutic targets against secondary pneumococcal pneumonia in susceptible hosts.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

This paper describes a novel mouse model for the transition of pneumococcus from an asymptomatic colonizer to a disease-causing pathogen during viral infection. This model can be readily adapted to study polymicrobial and host-pathogen interactions during the different phases of disease progression and across various hosts.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

Modelo experimental para avaliar a resolução da pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Preparation of Agar Bead Embedded Mycobacterium abscessus to Inoculate Immunocompetent Mice Intratracheally

Robust mouse models of chronic infection with Mycobacterium abscessus, an environmental pathogen that preferably infects the lungs, are badly needed. Year-long multidrug therapies deliver unacceptably poor cure rates in patients, around 50%, hence the need for predictive preclinical tools to develop better antibiotics. However, immunocompetent mice are generally resistant to pulmonary infection by M. abscessus. Numerous attempts to establish a sustained infection with M. abscessus in immunocompetent mice have been reported in the literature. Among these, methods relying on agar bead-embedded bacteria inoculated into C57BL/6 mice via the intratracheal route have proven most promising. The major limitation of this approach is the technical challenge associated with the preparation of agar beads of reproducible size and bacterial numbers, followed by intratracheal inoculation. Here, we first provide a detailed description of an optimized protocol that delivers M. abscessus-loaded agar beads of optimal diameter and reproducible bacterial burden. Next, we provide a detailed protocol of intratracheal inoculation, optimized to avoid losses of beads and bacteria due to adherence to surfaces of the inoculation devices and to achieve reproducible pulmonary deposition of agar-embedded M. abscessus. The objective is to ensure ease of implementation and excellent lab-to-lab reproducibility.

Mice are generally resistant to infections by Mycobacterium abscessus, which complicates the discovery and development of much-needed antibiotics against pulmonary infections. Here, we describe a method of inoculum preparation and intratracheal infection that was shown to deliver sustained infection in immunocompetent mice.

Preparação de Mycobacterium abscessus embebido em grânulo de ágar para inocular camundongos imunocompetentes por via intratraqueal

Robust mouse models of chronic infection with Mycobacterium abscessus, an environmental pathogen that preferably infects the lungs, are badly needed. ...

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra

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