Este protocolo permite a produção de nanoliposomos seguros e eficientes que podem ser usados como veículos de transfecção para RNA mensageiro terapêutico. Esses nanoliposomos facilitam a absorção de mRNA nas células, resultando em aumento dos níveis de expressão proteica sem afetar a viabilidade celular. A principal vantagem desta técnica é a geração rápida e fácil de nanoliposomos estáveis com tamanho definido e distribuição homogênea.
Além disso, protegem o mRNA encapsulado da degradação e levam a uma tradução prolongada. Demonstrando o procedimento estará Antonia Link, uma estudante de doutorado do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare soluções de estoque para os lipídios, DC-colesterol e DOPE, dissolvendo cada um em clorofórmio para uma concentração final de 25 miligramas por mililitro.
Misture 40 microliters do DC-colesterol dissolvido com 80 microliters da DROGA dissolvida em um frasco de vidro. Vaporize o clorofórmio sob um fluxo de gás argônio por 15 minutos. Em seguida, encha um desiccator com gel de sílica.
Coloque o frasco de vidro aberto dentro e aplique um vácuo durante a noite para garantir que o clorofórmio restante seja evaporado. O filme lipíduo resultante se formará dentro do frasco de vidro. No dia seguinte, adicione um mililitro de água livre nuclease para reidratar o filme lipíduo.
E vórtice da suspensão por 15 minutos. Coloque a suspensão em um banho de sônica por uma hora. Depois disso, monte a mini extrusora de acordo com as instruções do fabricante.
Encha uma seringa com a suspensão líquida e coloque-a de um lado da extrusora. Coloque uma seringa vazia do outro lado. Pressione a suspensão lipídica através da membrana de uma seringa para a outra, aproximadamente 20-25 vezes para extrusir a suspensão.
Em seguida, armazene os nanoliposomos em um frasco de vidro a quatro graus Celsius até estar pronto para usar. Primeiro, descongele o mRNA sintético no gelo. Vórtice o mRNA congelado e, em seguida, centrifuá-lo pouco antes de abrir o tubo.
Em seguida, misture um micrograma do mRNA sintético com várias quantidades de suspensão nanoliposome. Centrifugar brevemente e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos para formação de nanolipoplex. Em seguida, adicione mililitro de meio celular regular ao nanolipoplex e misture por pipetação para cima e para baixo.
Prepare as células um dia antes da transfecção. Portanto, placa 150.000 células A549 em cada poço de uma placa de 12 poços um dia antes da transfecção. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e meio celular regular durante 24 horas.
Então no dia seguinte, lave cada poço de células preparadas uma vez com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de uma mistura de nanolipoplex preparado a um dos poços que contêm as células A549. Incubar em condições regulares por 24 horas para analisar a eficiência da transfecção, ou por 24-72 horas para analisar a viabilidade celular após a transfecção.
Remova o supernatante e lave cada poço com um mililitro de PBS para remover os nanoliposomos restantes. Para preparar as células para a citometria, primeiro adicione 500 microliters de trippsina EDTA a cada poço e incubar a 37 graus Celsius por três minutos para tentarpsinizar as células. Em seguida, adicione 500 microliters de meio regular contendo FBS para interromper o processo e inativar a trippsina.
Centrifugar as células a 400 vezes G por cinco minutos. E remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota celular. Lave as células com um mililitro de PBS.
Em seguida, suspenda novamente as células em 300 microliters da solução de fixação celular e transfira-as para tubos de citometria de fluxo. Use um citómetro de fluxo para analisar as células a 488 nanômetros. Para preparar as células para microscopia de fluorescência, adicione um mililitro de metanol resfriado a cada poço para corrigir as células.
Adicione 500 microliters de uma solução de 300 nanomolar de DAPI dissolvida em PBS a cada poço. Incubar no escuro por cinco minutos. Depois disso, remova a solução DAPI e lave as células novamente com 100% de metanol que foi armazenado anteriormente a menos 20 graus Celsius.
Use um microscópio de fluorescência para analisar as células usando os comprimentos de onda de excitação e emissão mostrados aqui. Neste estudo, nanoliposomos são gerados com alta eficácia de encapsulamento para mRNA sintéticamente modificado. Utilizando o kit de quantificação de RNA, a eficácia de encapsulamento dos nanoliposomos pode ser analisada após o encapsulamento de um micrograma de mRNA de codificação eGFP, analisando a quantidade livre de mRNA que não é encapsulada.
Após o encapsulamento do EGFP mRNA em diferentes quantidades de nanoliposomos, os nanolipoplexos formados podem ser incubados com células in vitro e a porcentagem de células expressas por eGFP pode ser analisada usando citometria de fluxo 24 horas após a transfecção. Como visto aqui, mesmo apenas um microliter da solução de nanoliposomos é suficiente para alcançar uma alta transfecção das células invitro. Quando as células são transfeinadas com nanoliposomos contendo cy3 rotulados eGFP mRNA, a presença do eGFP mRNA no citoplasma, bem como a proteína eGFP já produzida, pode ser visualizada.
Uma vez que a transfecção de células usando nanolipoplexos pode ter efeitos adversos nas células, a viabilidade das células foi testada após 24 horas e 72 horas após a transfecção. Nenhum efeito na viabilidade celular pôde ser detectado quando as células foram tratadas com 2,5 ou cinco microlitros de nanolipoplexos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de etanol o tempo todo, pois isso pode prejudicar a estabilidade nanoliposome.
Enquanto prepara e mistura o DC-colesterol com DOPE, você deve usar uma pipeta de vidro para evitar a contaminação dos lipídios dissolvidos com componentes solúveis de pontas de pipeta plástica. Seguindo este protocolo, os nanoliposomos gerados podem ser facilmente manipulados durante ou após a preparação. Por exemplo, a incorporação de moléculas de PEG ou anticorpos específicos levaria a um aumento da estabilidade ou iniciaria a segmentação ativa do tecido.
Os nanoliposomos gerados preenchem os aspectos de segurança necessários e facilitam a absorção de mRNA para as células-alvo. Nanoliposomos complexos com um nRNA terapêutico específico podem contribuir essencialmente para o desenvolvimento de novas terapêuticas baseadas em mRNA no campo da engenharia de tecidos ou terapia de substituição, por exemplo.
