Gostaria de agradecer meus colegas de trabalho da MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, pelo apoio e orientação ao longo dos anos. Gostaria também de agradecer a Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson por sua ajuda com o recurso BDC3 no software IDEAS , Ryan P. Jessup por ajudar a editar este manuscrito, Raymond Kong para ajudar no dia do tiro, e um agradecimento especial Para a artista de maquiagem Cynthia Xamonthiene.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

Eu sou empregado por MilliporeSigma, o criador da marca Amnis ImageStream, que foi usado neste estudo.

Ao realizar essa análise, há algumas coisas a considerar. É importante ter amostras de controle apropriadas. Para esta experiência, foram utilizados dois controles diferentes: Controle e Controle + Cloroquina. A amostra de controle foi usada para definir o limite para as regiões. Representa o nível basal de autofagia sem interromper a degradação lisossômica e é o controle da amostra Amimada. No entanto, a amostra de Controle não é um controle apropriado para comparar com os resultados da Amostra de Fome e Chloroquina porque a cloroquina em si influencia a amostra de controle. Portanto, era necessário ter uma amostra de Controle + Cloroquina. Antes de realizar qualquer análise para autofagia, é importante analisar / colocar em células únicas que estão em foco ( ou seja, RMS de gradiente superior a 60), pois os resultados podem ser afetados se houver mais de uma célula ou as imagens forem fora de foco. É crucial que a autofagosomEs e os lisosomas estão em foco para contagem adequada de pontos e análise BDC3. As células apoptóticas devem ser removidas antes da análise de autofagia, uma vez que podem diminuir os resultados e não devem ser incluídas. Deve haver manchas apropriadas para os três marcadores ( ie, LC3, p62 e LAMP1). Por exemplo, os três marcadores são intracelulares e devem ter um sinal pontual; Se o sinal não for pontual, ou se estiver na superfície da célula, a coloração não seria apropriada e a experiência / coloração deve ser refeita. Além disso, para BDC3 ser preciso, é essencial para o portão em células que são brilhantes para os três marcadores fluorescentes de interesse. É necessário ativar eventos positivos para evitar a medição de BDC3 em elementos não vinculativos, artefatos de imagem e / ou ruído. Isso é crucial, pois o BDC3 pode potencialmente amplificar os artefatos que não são sinais verdadeiros. Uma vez que BDC3 só pode ser realizado em eventos positivos brilhantes, muitas células podem não ser incluídas na análise final; Isto é especRealmente é verdade para células de controle que não possuem acumulação de LC3, p62 e / ou LAMP1. Assim, uma limitação deste ensaio é que BDC3 apenas examina as células que são positivas para os três marcadores, o que pode não ser apropriado para todas as experiências de autofagia. Como o BDS, que foi relatado anteriormente 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , o BDC3 sozinho não leva em consideração o número de organelas autofágicas que co-localizam, resultando em grande medida De variabilidade no número de autofagosomas. Portanto, a abordagem bivariada apresentada por Rajan et al. estava empregado. Olhando para as parcelas bivariadas, pode-se perguntar seAs células devem ser positivas para LC3, p62 e LAMP1; Por que existem tantas células que têm 0 pontos? Isso ocorre porque o sinal LC3 pode ser suficientemente brilhante para co-localização, mas pode não atingir o limite definido pela máscara de pico (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessário para que seja considerado um local. O protocolo apresentado aqui usou o MIFC para contar LC3 puncta e a co-localização de três marcadores de autofagia para medir o fluxo autofágico. Em condições basais (amostra de controle), o número de autofagosomas foi baixo e poucas células foram encontradas com &quot;Pontos altos&quot;. Com a adição de cloroquina, que inibe a fusão de autofagosoma / lisossoma, houve um aumento no número de manchas de LC3. Uma vez que o lisossoma é incapaz de quebrar o autofagosoma e o p62, que reside no autofagosoma, isso leva a um aumento na co-localização do acúmulo de autolossomosoma LC3, p62 e LAMP1. Este efeito foi amplificado sob Starvat nutrienteIon, que induz a autofagia. No entanto, sem a adição de cloroquina, não houve um aumento significativo no número de autofagosomas, provavelmente devido ao aumento da taxa de rotação autofágica. Quando as células ficaram famintas na presença de cloroquina, houve aumento na co-localização e no número de autofagosomas, o que suporta a conclusão de que a fome aumenta o fluxo autofágico. EBSS é conhecido por ser um poderoso indutor de autofagia. Portanto, espera-se que o aumento seja grande. Se outro método, como indução de fármaco, for utilizado para induzir autofagia, a diferença entre o controle e as amostras tratadas pode ser mais sutil. Este protocolo particular foi projetado para medir a autofagia em linhas celulares humanas, mas o ensaio poderia ser adaptado a outras espécies ao mudar para anticorpos para essa espécie particular. Além disso, o método de análise pode ser usado para qualquer aplicação intracelular que exija a co-localizaçãoDe três sondas / marcadores.

Macroautophagy, a seguir denominada autofagia, é uma via catabólica em que componentes danificados ou disfuncionais, proteínas de longa vida e organelas são degradados através do lisossoma e são reciclados 1 . Autofagia é um processo dinâmico, de múltiplos passos, que envolve a formação de um autofagaço; A fusão do autofagosoma com o lisossoma, formando o autolisômio; E a degradação dos conteúdos do autolossossoma 2 . O marcador biológico crucial usado para identificar a autofagia em sistemas de mamíferos é a proteína leve 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada aos microtúbulos, que compõe a membrana autofagosomática. Durante a autofagia, o LC3-1 citosólico é conjugado com fosfatidiletanolamina para formar LC3-II; O LC3-II é então incorporado na membrana autofagosomal 3 . Outro marcador amplamente utilizado para o fluxo autofágico é o receptor de autofagia sequestração 1 (SQSTM1, p62) que fisicamente liCarga autofágica nata para a membrana autofágica 4 , 5 . Métodos tradicionalmente utilizados para medir a autofagia são manchas de Western e microscopia de fluorescência 7 . No entanto, nenhum desses métodos é considerado o &quot;padrão-ouro&quot; , 2 , 6 , pois há desafios associados a ambas as técnicas. Western blots apenas dá uma média porque eles usam uma amostra de homogeneizado, de modo que os observadores não podem ver o que está acontecendo em células individuais. Por outro lado, a microscopia de fluorescência dá uma informação de observador no nível de célula única, mas carece de capacidades de produção, dificultando a obtenção de avaliações objetivas e estatisticamente rigorosas. Nos últimos anos, a medição de LC3 e p62 por citometria de fluxo de imagem multiespectral (MIFC, veja a Tabela de Materiais ) vem ganhando popuLaridade devido ao seu poder quantitativo, capacidades de alto rendimento, potencial de multiplexação e capacidade de imagem de cada célula. Um dos métodos mais utilizados para medir autofagia usando MIFC, juntamente com o seu software de análise complementar (ver Tabela de Materiais ), é através da contagem local de LC3 puncta ou autofagosomas 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . No entanto, um aumento nos autofagosomas não significa necessariamente que haja um aumento na autofagia, pois também pode representar um bloqueio no processo 2 . O turnover LC3-II é um parâmetro útil para medir o fluxo autofágico através da análise de células na presença eAusência de um inibidor de degradação lisossômica, como a cloroquina. A cloroquina inibe a fusão do autofagosoma ao lisossoma, permitindo assim a quantificação da formação dos autofagosomas como medida do grau de autofagação ao suspender o fluxo autofágico antes da degradação lisossômica 18 . Além disso, p62 é degradado principalmente por autofagia, e se a degradação lisossômica do autofagosoma e seu conteúdo é bloqueada, espera-se uma acumulação de p62 17 , 19 . Autophagy é um processo de vários passos, e a medida de LC3 ou p62 sozinho não fornece uma imagem completa do que está acontecendo nas células. Publicações recentes enfatizaram a necessidade de examinar a formação simultânea do autolossossoma 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC éApenas capaz de medir a formação do autolossossoma por imagem da co-localização do autofagosoma ao lisossoma 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . Além disso, a co-localização de p62 e LC3 usando MIFC também foi explorada para medir o fluxo autofágico 5 . No software de análise referenciado, o &quot;recurso&quot; que mede a co-localização é chamado de &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) e foi especificamente projetado para comparar os detalhes da imagem pequena e brilhante de duas imagens. BDS é o coeficiente de correlação de Pearson transformado em log de pontos brilhantes localizados com um raio de 3 pixels ou menos; Em outras palavras, o BDS calcula o grau de oVerlapping pixels a partir de dois canais fluorescentes diferentes. Os pontos brilhantes estão correlacionados ( ou seja, a mesma localização espacial) ou não correlacionados ( ou seja, diferentes locais espaciais). Portanto, o coeficiente de correlação varia entre 0 (não correlacionado) e 1 (correlação perfeita). O coeficiente é log-transformado para aumentar o intervalo entre zero e infinito 26 , 27 . BDS sozinho pode não ser suficiente; Rajan et al. Descobriu que usar apenas BDS poderia levar a resultados falsos positivos ou falso-negativo 21 . BDS avalia a co-localização de dois marcadores de autofagia, mas não considera o número de autofagosomas. Para explicar o número de autofagosomas, Rajan et al. Incluiu a contagem local da LC3 puncta 21 . Rajan et al. Proposto usando um gráfico de dispersão bivariada da contagem de pontos LC3 versus BDS. Usando essa trama bivariada, duas populaçõesPrimeiro identificado: um com células com um alto nível de manchas de LC3 e uma com células com baixo nível de manchas de LC3. A população de pontos LC3 foi classificada em duas populações: células com baixa co-localização ( ou seja, acumulação de autofagosomas) e células com alta co-localização ( ou seja, acumulação de autolossossomos). Este gráfico bivariado permite distinguir entre células com muito poucos autofagosomas e células com acumulação de autofagosomas e / ou autolisossomas 21 . Até agora, a co-localização simultânea de LC3, p62 e LAMP1 (marcador lisossômico) não era possível usando um único &quot;Tipo de recurso&quot; no software de análise complementar MIFC (veja a Tabela de Materiais ). No entanto, um novo recurso, recentemente introduzido na versão 6.1, é chamado Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compara as imagens de detalhes brilhantes de cada uma das três imagens (neste caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica a co-localização das três sondas ( ie, LC3, p62 e LAMP1). O recurso BDC3 calcula o coeficiente de correlação de Pearson modificado para se estender a três imagens. Como os pontos brilhantes nas três imagens estão correlacionados ou não correlacionados, o coeficiente de correlação varia entre 0 (não correlacionado) e 1 (correlação perfeita). O coeficiente é log-transformado para aumentar o intervalo dinâmico entre 0 e infinito. Ao mudar o recurso BDS com o recurso BDC3, o método de análise apresentado por Rajan et al. Agora pode incorporar os três marcadores mais utilizados para medir autofagia em um sistema ao mesmo tempo. A capacidade de co-localizar esses três marcadores de autofagia em um único ensaio pode levar a novos insights sobre a indução e regulação da autofagia. O protocolo a seguir descreve os passos para induzir autofagia em células Jurkat; Rotular as células com anticorpos LC3, p62 e LAMP1; Adquirir dados em um multispCitometro de fluxo de imagem ectral; E analise os dados para avaliar o fluxo autofágico.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

A autofagia é uma via catabólica em que os componentes celulares normais ou disfuncionais que se acumulam durante o crescimento e a diferenciação são degradados através do lisossoma e são reciclados. Durante a autofagia, a proteína LC3 citoplasmática é lipidada e recrutada para as membranas autofagosomáticas. O autofagosoma, em seguida, se funde com o lisossoma para formar o autolisômio, onde ocorre a quebra da vesícula autofagosoma e seu conteúdo. A proteína p62 associada à ubiquitina, que se liga ao LC3, também é usada para monitorar o fluxo autofágico. As células submetidas a autofagia devem demonstrar a co-localização de p62, LC3 e marcadores lisossômicos. A microscopia de imunofluorescência tem sido utilizada para identificar visualmente LC3 puncta, p62 e / ou lisossomos por célula. No entanto, uma avaliação objetiva e estatisticamente rigorosa pode ser difícil de obter. Para superar esses problemas, a citometria de fluxo de imagem multiespectral foi utilizada juntamente com uma característica analítica que compara oImagens de cauda de três marcadores de autofagia (LC3, p62 e LAMP1 lisosomal) e quantifica sua co-localização, em combinação com a contagem de pontos LC3 para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Este método de análise utiliza múltiplos recursos para avaliar o fluxo autofágico. A fim de compreender completamente a parcela final bivariada, as características de análise individuais devem primeiro ser investigadas. A contagem de autofagosomas é uma maneira lógica de medir autofagia; No entanto, o tamanho / forma / brilho de LC3 puncta pode variar drasticamente entre as células. A variação pode dificultar a contagem de autofagosomas manualmente ou o uso de um recurso de contagem de pontos no software de análise. Portanto, nenhuma característica de contagem de pontos será perfeita devido a essa grande variabilidade nos autofagosomas. No entanto, um bom recurso de contagem de pontos funcionará na maioria das células 26 . A Figura 3 mostra exemplos de mascaramento em pontos de LC3 puncta em células Jurkat usando diferentes máscaras de pontos. O recurso de contagem de pontos selecionado para este conjunto de dados é Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, o que significa que o recurso de contagem de pontos contou os pontos que o peMáscara ak identificada dentro da máscara do canal 11 padrão (M11) no canal 11 (Ch11-LC3-AF647) com uma relação de fundo de ponto a célula de 4 (Bright, 4). A Figura 4 mostra histogramas de contagem de pontos e imagens representativas para a contagem média de pontos para as células Jurkat de Controle, Controle + Cloroquina, Abandonado e Amido ou Chloroquina, marcadas com anti-LC3-AF647. As contagens de pontos médios controlados e famintos não são significativamente diferentes; Com a adição de cloroquina, há uma grande diferença na média do Controle + Cloroquina em comparação com o Starved + Chloroquine. O próximo recurso a investigar é BDC3. BDC3 é uma medida da co-localização de três marcadores / sondas, neste caso, LC3, p62 e LAMP1. A Figura 5A - 5D mostra os histogramas BDC3 para as células Controk, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat marcadas com anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE e anti-LC3-AF647. Há uma mudança entre a média de Controle para a média de Starved, bem como o significado de Control + Chloroquine para a média de Starved + Chloroquine. No entanto, olhando para as imagens das células dos escores BDC3 médios na Figura 5E - 5H , há uma diferença maior entre as amostras do que os histogramas podem levar a acreditar. Isso ocorre porque o BDC3 não considera o número de organelas autofágicas que co-localizam, resultando em um grande grau de variabilidade no número de autofagosomas para o mesmo escore BDC3. Na maioria dos casos, existe uma sobreposição entre as três sondas porque, mesmo nos níveis basais, p62, LAMP1 e LC3 devem, até certo ponto, co-localizar ou residir em regiões similares nas células. Como contraste, um exemplo de três sondas que não devem co-localizar são anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 e tintura nuclear DAPI para a amostra Starved + Chloroquine, mostrada na Figura 6. &lt;/ P&gt; Quando o recurso de contagem de pontos e o recurso BDC3 são combinados, a presença de diferentes subpopulações que melhoram a capacidade de distinguir entre as várias amostras / condições são evidentes. A Figura 7 mostra o gráfico bivariado de contagem de pontos de LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para as quatro amostras: Controle, Controle + Cloroquina, Abdomina e Morto de Fome + Cloroquina. A amostra de controle foi usada para definir a estratégia de bloqueio para três populações: Pontos baixos, Pontos altos / BDC3 baixo e Pontos altos / Alto BDC3. As amostras de Controle demonstraram que mais de 98% das células tinham 1 ou menos manchas. O limite entre High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3 foi ajustado para um escore BDC3 de 1, porque mais de 91% da amostra Control teve um escore BDC3 inferior a 1. Um resumo dos resultados para as parcelas bivariadas É mostrado na Tabela 1 . Idade = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figura 1: Configuração do instrumento MIFC. Uma captura de tela das configurações do instrumento MIFC usadas para esta experiência, delineada na etapa 8 do protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figura 2: Estratégia de Gating de Software de Análise. Uma captura de tela do esquema de controle de software de análise, delineada no passo 9 do protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Mascaramento de pontos LC3. Imagens e máscaras de células Jurkat usadas para criar o recurso de contagem de pontos. Mostra-se BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) e Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). A máscara que funcionou melhor para todas as células mostradas foi Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figura 4: Histogramas de contagem de pontos LC3. Usando o recurso de contagem local Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 e os histogramas de contagem de pontos LC3-AF647 para Controle ( A , azul claro), Controle + CloroquinoE ( B , azul), faminto ( C , rosa) e Starved + Cloroquina ( D , vermelho). O ponto médio conta para Controle, Controle + Cloroquina, Fome e Fome + Cloroquina são 0,07, 1,13, 0,10 e 2,77, respectivamente. BF, LC3-AF647 (vermelho), tintura nuclear DAPI (azul) e um composto das imagens LC3-AF647 e DAPI de células representativas para a contagem média de pontos são mostrados para Controle ( E , 0 pontos), Controle + Cloroquina ( F , 1 ponto), faminto ( G , 0 pontos) e Starved + Chloroquine ( H , 3 pontos). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figura 5: Histogramas BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. Histogramas BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 paraControle ( A , azul claro), Controle + Cloroquina ( B , azul), Abatido ( C , rosa), e Fome + Cloroquina ( D , vermelho). O escore BDC3 médio para Controle, Controle + Cloroquina, Fome e Fome + Cloroquina é 0,57, 0,82, 0,74 e 0,98, respectivamente. BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (amarelo); LC3-AF647 (vermelho); E um composto das imagens p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 de células representativas para o BDC3 médio são mostrados para Controle ( E ), Controle + Cloroquina ( F ), Starved ( G ) e Starved + Cloroquina ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figura 6: Histogramas BDC3 de p62 / LC3 / DAPI para Amostragem + Chloroquina Amostra. ( A ) O histograma BDC3 p62 / LC3 / DAPI para a amostra Starved + Chloroquine é mostrado. O resultado médio do BDC3 é de 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LC3-AF647 (vermelho); DAPI (azul); E um composto das imagens p62-AF488, LC3-AF647 e DAPI de células representativas para o BDC3 médio é mostrado para a amostra Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figura 7: Gráficos Bivariados de LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parcelas bivariadas da contagem de pontos LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para células ControK, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (amarelo); LC3-AF647 (vermelho); E um composto das imagens p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 de três regiões (por exemplo , Pontos baixos, Pontos altos / BDC3 baixo e Pontos altos / Alto BDC3) são mostrados para a amostra Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Contagem de células </td><td> Colocalização brilhante de detalhes 3 significa </td><td> Contagem de pontos LC3 Mean </td><td> % Low Spot </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Ao controle </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Controle + Cloroquina </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19,5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Morrendo de fome </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0,10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Abatido + Cloroquina </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resumo do Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariada Trama

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K visualizações.  MilliporeSigma.  Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta. 

Vídeo: Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliando a liberação de EV positiva para LC3-II na autofagia com fusão de lisossomo prejudicada

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf cytoplasmic contents, subsequently fusing with lysosomes for degradation. Beyond the canonical role, autophagy-related genes also modulate a secretory pathway involving the release of inflammatory molecules, tissue repair factors, and extracellular vesicles (EVs). Notably, the process of disseminating pathological proteins between cells, particularly in neurodegenerative diseases affecting the brain and spinal cord, underscores the significance of understanding this phenomenon. Recent research suggests that the transactive response DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43), a key player in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration, is released in an autophagy-dependent manner via EVs enriched with the autophagosome marker microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), especially when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.
To elucidate the mechanism underlying the formation and release of LC3-II-positive EVs, it is imperative to establish an accessible and reproducible method for evaluating both intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. This study presents a detailed protocol for assessing LC3-II levels via immunoblotting in cellular and EV fractions obtained through differential centrifugation. Bafilomycin A1 (Baf), an inhibitor of autophagosome-lysosome fusion, serves as a positive control to enhance the levels of intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is used as a marker for multivesicular bodies. Applying this protocol, it is demonstrated that siRNA-mediated knockdown of syntaxin-6 (STX6), a genetic risk factor for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, augments LC3-II levels in the EV fraction of cells treated with Baf while showing no significant effect on TSG101 levels. These findings suggest that STX6 may negatively regulate the extracellular release of LC3-II via EVs, particularly under conditions where autophagosome-lysosome fusion is impaired. Combined with established methods for evaluating autophagy, this protocol provides valuable insights into the role of specific molecules in the formation and release of LC3-II-positive EVs.

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Here, we present the methodology for concisely assessing autophagosome marker LC3-II levels in extracellular vesicles (EVs) by immunoblotting. Analysis for LC3-II levels in EVs, autolysosome formation, and omegasome formation suggests the new role of STX6 in the release of LC3-II-positive EVs when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

Bioquímica

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medicina

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis