Nosso protocolo permite a medição da taxa de autofagia e atividade proteasômica nos tecidos do camundongo e é sensível o suficiente para detectar variações circadianas dentro dessas atividades. Esta técnica pode ser usada in vivo para avaliar o catabolismo proteico em células e tecidos e os materiais necessários são relativamente de baixa tecnologia e acessíveis a qualquer laboratório de biologia molecular. Demonstrando o procedimento será Mikhail Ryzhikov, um pós-doutor do meu laboratório.
Durante quinze minutos antes de cada ponto de tempo, aqueça as soluções de estoque de leupeptina e bortezomib à temperatura ambiente e dilua o bortezomib descongelado em PBS estéril para produzir uma solução de trabalho de 50 miligramas por mililitro. Para administração inibidora de protease, injete intraperitoneally 40 miligramas por quilograma de leupeptina ou 1,6 microgramas por quilograma de bortezomib em cada animal experimental. Para um controle negativo, injete camundongos com 0,5 mililitros de PBS.
Devolva cada rato às gaiolas agrupadas pelo tipo de tratamento recebido à medida que são injetados e regise o tempo em que os ratos são tratados ou manipulados em uma tabela padronizada. Duas horas após a injeção, submergir o lobo hepático esquerdo colhido de cada animal experimental sacrificado em sete mililitros de tampão de homogeneização fria em tubos cônicos apropriadamente rotulados 15 mililitros no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido adquiridas, transfira a primeira amostra e todo o volume de tampão de homogeneização para um homogeneizador do Dounce de capacidade de 15 mililitros e homogeneize a amostra com 10 traços do pistão solto e 15 traços do pistão apertado.
Retorne o homogeneado bruto resultante ao seu tubo original e homogeneize a próxima amostra como apenas demonstrado. Quando todas as amostras foram homogeneizadas, sedimente os núcleos homogeneizados e detritos por centrifugação e transfira os quatro mililitros de cada supernante pós-nuclear em novos tubos de 15 mililitros. Determine a concentração proteica desta primeira fração sobrenana de acordo com os protocolos padrão e equalize as concentrações de todas as amostras a 2,1 miligramas por mililitro com tampão de homogeneização fresco conforme necessário.
Para análise a jusante e melhoria da qualidade, alíquota de 500 microlitadores das frações de proteína total normalizadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Transfira 1,5 mililitros de cada uma das frações de proteína totais restantes em tubos individuais de microcentrifuuuga e pelota as amostras de proteína por centrifugação. Transfira um mililitro da segunda fração resultante para novos tubos de microcentrifuuagem no gelo e aspire os supernantes restantes.
Lave as pelotas 3K duas vezes em 1,5 mililitros de tampão de homogeneização a frio fresco por lavagem, depois resuspenque a pelota 3K em 200 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE e ferva as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Gire a segunda fração de supernantes por 20 minutos a 20.000 x g e quatro graus Celsius e transfira os supernantes de fração citoplasmática resultantes para um novo tubo de microcentrifuuagem. Para análise SDS-PAGE, combine 150 microliters da fração citoplasmática com 50 microliters de tampão de amostra 4x SDS-PAGE e ferva as amostras de fração citoplasmática a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Aspire o restante do supernascedor das pelotas de 20K e lave as amostras duas vezes com 1,5 mililitros de tampão de homogeneização a frio fresco por lavagem. Em seguida, resuspenque a pelota de 20K em 100 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE para ferver a 95 graus Celsius por cinco minutos. Para análise de manchas ocidentais, diluem em série proteínas de curva padrão de um a três em 1x tampão de amostra para um total de seis diluições e carregue 10 microliters de cada amostra de curva padrão em um poço de um gel midi de 26 poços de 4 a 12% SDS-PAGE, em seguida, carregue um padrão de peso molecular comercial prestained.
Para medir o fluxo autofágico, carregue 12 microlitadores de cada amostra de pelotas 3K nos poços apropriados. Para medir o fluxo proteassômico, carregue 12 microlitres de cada fração citoplasmática nos poços apropriados. Quando todas as amostras de controle e experimentais tiverem sido carregadas, separe as amostras de proteínas por SDS-PAGE antes de transferir as proteínas para membranas de flúor de polivinida de acordo com os protocolos padrão.
Para analisar o fluxo macroautofágico, as membranas manchadas contendo as amostras de pelotas 3K com anticorpo anti-p62 ou anti-LcB durante a noite a quatro graus Celsius. Para analisar o fluxo proteassômico, as membranas manchadas contendo as amostras de fração citoplasmática com anticorpo anti-ubiquitina 48-Específico da poli ubiquitina durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, imagem as manchas ocidentais usando anticorpos secundários padrão e dispositivos de imagem.
Para realizar medições densitométricas em bandas de interesse tanto para a curva padrão quanto para amostras experimentais, abra um programa de software de análise de imagem apropriado e desenhe um longo retângulo que abrange o monômero proteico de interesse na parte inferior da imagem da mancha que se estende até o topo da membrana. Copie e cole para mover o retângulo para as amostras restantes, mantendo o retângulo consistente entre as amostras. Salve a quantificação em uma planilha e gere uma curva padrão densitométrica dentro da planilha usando a amostra padrão diluída serialmente em regressão linear ou polinomial para obter uma equação de curva padrão mais adequada.
Usando esta equação, extrapolie a quantidade dos monômeros de interesse dentro das amostras experimentais. Para obter medições de fluxo, subtraia a quantidade de proteína extrapolada de cada amostra tratada inibidora a partir do valor médio das amostras de PBS a partir do mesmo ponto de tempo. Em seguida, avalie a significância estatística da variação temporal no volume de negócios proteicos utilizando ANOVA unidirecional.
A leitura primária para o fluxo autofágico a qualquer ponto de tempo é a diferença na quantidade de marcadores específicos da macroautofagia entre a leupeptina tratada versus as amostras falsas na fração de pelota 3K enriquecida com lisósomo dividida por dois. Normalmente, os resultados são normalizados para a média que simplifica a comparação entre experimentos independentes. Nosso procedimento para medir o fluxo proteolítico depende da capacidade da leupeptina ou bortezomib de causar o acúmulo de substratos de autofagia e proteasome, que é um processo dependente do tempo.
Esta técnica permitiu a exploração de como ritmos biológicos programam catabolismo de proteína hepática. Esperamos que abra caminho para investigar os efeitos da doença nas funções de limpeza celular.
