Recentemente, os queratinócitos orais têm chamado a atenção por causa de sua propriedade única. Fornecemos um protocolo para cultivo de queratinócitos orais de camundongos em um estado semelhante a células-tronco adequado para aplicações a jusante. A cultura do queratinócito oral do rato e característica diferente da queratinócito da pele.
Neste protocolo, isolamos com sucesso o queratinócito oral do camundongo primário e desenvolvemos uma técnica de cultura de longo prazo. Este sistema de cultura pode ser empregado em ensaios moleculares e bioquímicos para entender melhor a característica da célula-tronco manjericão oral e suas doenças relacionadas. Depois de sacrificar um rato C57BLK6J adulto, remova o cabelo ao redor da boca com uma máquina de barbear e usando uma tesoura, corte das bochechas em direção à mandíbula em ambos os lados.
Em seguida, use fórceps para abrir a boca e absorver qualquer sangue usando um cotonete de algodão, em seguida, desinfetar a paleta limpando o interior da boca com um cotonete contendo iodo 10% povidone. Para colher a paleta do rato, primeiro usando uma lâmina de bisturi cirúrgica, faça uma incisão marginal de espessura total ao longo do lado da paleta dos dentes maxilais. Em seguida, usando um raspatório, disseque cuidadosamente toda a paleta.
Transfira rapidamente o tecido da paleta para um tubo de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio completo suplementado com antibióticos e antimíclicos. Mantenha os tecidos no gelo até ficar pronto para a incubação. Em uma capa de fluxo laminar, transfira os tecidos para um prato de 60 milímetros contendo quatro mililitros de meio completo com antibióticos e antimícticos.
Em seguida, usando asseps curtos e uma lâmina de bisturi, remova suavemente qualquer sangue dos tecidos e lave os tecidos 10 vezes com o meio completo. Após a última lavagem, transfira os tecidos para um prato de 35 milímetros contendo quatro mililitros de 0,025% de trippsina complementada com antibióticos e antimípticos. Coloque os tecidos com a superfície epitelial voltada para baixo e incuba-os por 16 horas à temperatura ambiente na capa da cultura.
Após a digestão da trippsina durante a noite, use um par de fórceps contundentes para remover o tecido da solução de trippsina e transfira-o para um prato de 60 milímetros contendo uma solução inibidora de trippsina com a superfície epitelial voltada para cima. Em seguida, segurando a borda da paleta com fórceps, use a lâmina do bisturi para raspar suavemente a camada epitelial da ármina propria subjacente. Para coletar a quantidade máxima de células epiteliais dos tecidos, transfira o tecido para outra antena de 60 milímetros com quatro mililitros de médio completo e repita raspar como demonstrado anteriormente.
Em seguida, coloque um coador de células de 100 mícrons estéreis em cima de um tubo cônico de 50 mililitros. E usando uma pipeta estéril, transfira dois mililitros de solução de trippsina para o coador para molhar sua superfície. Em seguida, usando uma pipeta, misture a suspensão celular na antena de 60 milímetros algumas vezes e filtre as células através do coador de células de 100 mícrons.
Para contar o número de células, adicione 15 microlitadores da suspensão celular a 50 microliters de solução azul trypan, em seguida, transfira 10 microliters da célula trypan blue mix para um hemócitometro e conte o número de células. Em seguida, centrifugar a suspensão celular, remover o supernasce e adicionar dois mililitros de meio completo contendo Chelex FBS ao tubo. Resuspend a pelota celular titulando várias vezes usando uma pipeta de cinco mililitros.
Em seguida, a placa duas a cinco vezes 10 para as quintas células de um rato em um poço de placa de 24 poços pré-revestido com colágeno tipo um e incubar as células a 37 graus Celsius por dois dias sem alterar o meio. Os queratinócitos orais primários cresceram como monocamadas e apresentaram uma morfologia de paralelepípedos. Pequenas colônias de queratinócitos foram visíveis após três e cinco dias.
Após uma semana de incubação, essas colônias cresceram e formaram colônias apertadas. A primeira passagem foi realizada a duas semanas do revestimento inicial e, em passagens posteriores, os queratinócitos apresentaram crescimento estável com um período de cultura mais curto. Os queratinócitos pararam de crescer se ocorresse uma contaminação significativa do fibroblasto durante o processo de isolamento.
Após a colheita, os queratinócitos expressaram queratina 14 e alfa6-integrin. Células de passagem precoce e tardia mostraram expressão uniforme de P63 confirmando sua haste. No entanto, os queratinócitos tratados com alto cálcio apresentaram diminuição da expressão P63 indicando que o tratamento de alto cálcio suprime genes relacionados com células-tronco.
O marcador de diferenciação queratina 13 mostrou expressão rara ou não em passagens precoces e tardias, mas expressão significativa no tratamento de alto cálcio. O marcador de fibroblasto PDGFR alfa não foi expresso na cultura queratinócito indicando que este protocolo poderia isolar com sucesso os queratinócitos basais e manter essas células no estado indiferenciado. A captura deve começar a partir do lado peridural e 10 minutos por amostra de tecido.
Também geralmente, a pipetação de células é importante para uma melhor viabilidade celular. Após duas ou três passagens, a queratinócito oral torna-se estável para outros experimentos funcionais. É importante ressaltar que este protocolo pode ser combinado com a vida do rato transgênico para ensaios celulares e moleculares in vitro.
Estudos recentes relataram a dinâmica e heterogeneidade da célula-tronco de basilar oral. Esse método facilitará o estudo da biologia das células-tronco orais e levará a uma melhor compreensão das doenças bucais.
