Vorremmo ringraziare Samuel Zirbel per assistenza nell'ottimizzazione delle condizioni di coltura e monitoraggio crescita della sferoide. Siamo grati a Agilent technologies per fornire l'analizzatoree96 SeaHorse XF, reagenti e approfondimenti tecnici. Ringraziamo anche Dr. Hemant Kocher Barts Cancer Institute nel Regno Unito per fornire le cellule PS1. Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Fondazione Seena Magowitz per la ricerca sul cancro del pancreas e un Stand fino al cancro-cancro ricerca UK-Lustgarten Foundation pancreatico cancro Dream Team Research Grant (Grant numero: SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up To Cancer è un programma della Fondazione di industria di intrattenimento. Borse di ricerca sono amministrati dall'associazione americana per ricerca sul cancro, il partner scientifico di SU2C.

1. cultura del cancro del pancreas sferoidi 3D utilizzando multimateriali magnetico <ol><li>Using standard asettica tessuto cultura tecnica, cultura cellule di interesse in una boccetta di T75 ad una confluenza di 70-80% in media di crescita appropriata. 
	Nota: In genere, 5-7 × 10 6 cellule da una boccetta T75 confluente di 70-80% sono state raccolte. Due tipi differenti delle cellule sono stati utilizzati in questo studio - Patu8902 (le cellule del tumore del pancreas) e PS1 cellule (cellule stellari pancreatiche attivate 21). Entrambe le linee cellulari sono state coltivate in Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) completati con 10% (v/v) fetale bovino serum(FBS), 1 × penicillina-streptomicina (p/s).</li>
	<li>Lavare le cellule una volta con 5 mL di Dulbecco &#39; tampone fosfato s saline(DPBS).</li>
	<li>Cellule di scollegamento da plastica di superficie da trypsinizing con 2 mL di 0.05% tripsina-EDTA per 5-10 min a 37 ° C. Check per distacco cellulare sotto un microscopio.</li>
	<li>Disattiva tripsina da aggiunta di media di crescita di 8 mL per indipendente celle. Evitare sopra trypsinization, in quanto questo può influenzare negativamente la salute/vitalità delle cellule.</li>
	<li>Cellule pipet su e giù per generare una sospensione unicellulare e conteggio delle cellule densità utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.</li>
	<li>Nel frattempo, portate un flaconcino di NS a temperatura ambiente.</li>
	<li>Calcolare la quantità di cellule necessarie per la semina il numero desiderato di sferoidi (pozzi) e aliquota ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Ad esempio, al seme di un intero 96 ben piatto con 5.000 cellule/pozzetto, cellule 5 aliquota almeno 5.5 × 10.</li>
	<li>Raccogliere cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min attentamente aspirare o decantare il supernatante e risospendere le cellule ad una concentrazione di 1,0 x 10 6 cellule/mL in media di crescita. Pipettare delicatamente utilizzando un puntale ampia annoiato per evitare di tosatura. Ad esempio, risospendere 5.5 x 10 5 celle in 550 µ l di crescita media.</li>
	<li>Magnetizzare la quantità desiderata di celle utilizzando il NS equilibrato (punto 1.6).
	<ol><li>Direttamente aggiungere NS alla sospensione di cellule in coltura e agitare delicatamente. Per le etichette magnetiche efficiente di celle, utilizzare 10 µ l NS per 100 µ l cellule (risospese a 1 x 10 6 cellule/mL). 
		Nota: Per un tipico esperimento, etichetta 5.5 × 10 5 Patu8902 cells in 550 µ l con 55 µ l NS e 1.1 × 10 6 PS1 in 1100 µ l, (separatamente) con 110 µ l NS.</li>
		<li>Delicatamente Inverti tubo un paio di volte per garantire la sospensione cellulare. Provvedere al trasferimento temporaneo, il mix di cella-NS in un unico pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Farlo separatamente per ogni tipo di cellula di essere magnetizzato. Piastra di copertura e incubare le cellule a temperatura ambiente per 2 h con agitazione delicata per consentire l'associazione di NS alla superficie delle cellule. 
		Nota: Cultura e dosaggio di sferoidi a partire sia da Patu8902 o PS1 celle da solo, oltre a sferoidi di co-coltura a partire con entrambi tipi premiscelati prima stampa su dischi magnetici con successo è stato ottenuto utilizzando questo metodo in indipendente delle cellule esperimenti. Un metodo per la generazione di sferoidi di co-coltura dalle cellule Patu8902 e PS2 è descritto di seguito nei passaggi successivi.</li>
	</ol></li> <li>Pipet su e giù per le cellule magnetizzate delicatamente per mescolare in modo uniforme e preparare un mix master contenente il numero di cella desiderata. Per il seeding sferoidi, utilizzare un totale di 15.000 celle (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e regolare per un volume totale di 150 µ l per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. 
	Nota: Il volume finale erogato in ogni pozzetto deve essere lo stesso indipendentemente dal numero di celle utilizzate.</li>
	<li>Mettere una piastra a 96 pozzetti cella repellente in cima l'unità sferoide magnetico 96 pozzetti e dispensare 150 µ l di mix di celle in ogni pozzetto. Osservare le cellule lentamente raccogliere al centro del pozzo sopra il magnete. Coprire e incubare la piastra durante la notte in un incubatore a CO 2 5% impostato a 37 ° C con il disco magnetico sferoide ancora collegato. Rimuovere il disco magnetico e incubare per un'ulteriore crescita fino a 7 giorni. 
	Nota: È fondamentale usare cartilagini di accrescimento delle cellule repellente per la stampa di sferoide utilizzando unità magnetica sferoide. Assicurarsi che venga utilizzato l'unità sferoide con magneti più piccoli più sottile, non l'unità di detenzione.</li>
	<li>Monitorare la crescita di sferoidi ogni giorno. Ricostituire con media crescita fresco ogni tre giorni inserendo la piastra di crescita montata sul magnetico che tiene in auto ad un angolo e utilizzando una pipetta multicanale per disegnare fuori esaurito media. 
	Nota: Patu8902 e PS1 cellule co-seminate ad 15.000 cellule/pozzetto cresceranno in 3D sferoidi con un diametro di 400-600 µm entro 5-7 giorni. A questo punto sono pronti per caratterizzazione metabolica, valutazione di droga e altre applicazioni a valle sferoidi.</li>
</ol> 2. Analisi metabolica di sferoidi di tumore pancreatico 3D per le vie di bioenergetica utilizzando l'analizzatore Flux extracellulare Nota: In questa sezione, l'analisi delle funzioni metaboliche di sferoidi utilizzando un flusso extracellulare analizzatore con dosaggio micropiastre specificamente progettate per 3D sferoidi è descritta.
<ol><li>Lavaggio e trasferimento di sferoidi da placche di crescita a sferoide dosaggio micropiastre. 
	Nota: Sferoidi possono essere utilizzati per analisi metaboliche quando raggiungono un diametro di ~ 500 µm.
	<ol><li>Il giorno prima dell'esecuzione del saggio, idratare la cartuccia sensore o sonda con dosaggio calibratore (200 µ l/pozzetto) nella piastra di utilità fornito e incubare pernottamento (4-18 h) in un incubatore (non-CO 2) fissato a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare medium di analisi appropriato per il dosaggio desiderato metabolico integrando il supporto di base (vedere la tabella materiali) o dosaggio di 2 mM L-Glutammina per test di stress di glicolisi (GST) o con piruvato di 1 mM, 2 mM L-Glutammina e 10 mM glucosio per un l'analisi mitocondriale stress test (MST). 
		Nota: L'analizzatore di flusso extracellulare misura sia la respirazione mitocondriale (OCR) e glicolisi (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 96 pozzetti. Questi tassi di fornire una panoramica della funzione metabolica cellulare nei campioni in esame. Consultare il manuale nei corredi di analisi per istruzioni dettagliate.</li>
		<li>Dopo l'aggiunta di dosaggio integratori specifici (si veda il punto 2.1.1), scaldare il medium di analisi completati in bagnomaria a 37 ° C e regolare il pH a 7,4 ± 0,1 con 0.1N NaOH. Mantenere il mezzo caldo fino all'uso.</li>
		<li>Ricostituire dosaggio reagenti del kit a medio dosaggio calibrato e consigliate concentrazioni stock. 
		Nota: Questi sono fatti a 10 × la concentrazione finale desiderata nei pozzetti. Le concentrazioni d'archivio per glucosio, oligomycin e 2-deossi-glucosio (2DG) sono 100, 100 µM e 500 mM, rispettivamente.</li>
		<li>Osservare sferoidi nella piastra di crescita sotto una luce microscopio per controllare per morfologia sferoide e uniformità generale; in termini di forma e strutturae di sferoidi.</li>
		<li>Trasferire la piastra di crescita su un disco magnetico della holding e aspirare accuratamente supporti di crescita di ~ 120 µ l. Delicatamente lavare sferoidi con ~ 120 µ l di media analisi riscaldato e pre-calibrato, aspirare e ripetere il lavaggio due volte. Ispezionare le sferoidi sotto il microscopio nuovamente per garantire che non sono mondati sferoidi.</li>
		<li>Preparare la micropiastra dosaggio sferoide aggiungendo media di dosaggio caldo 180 µ l a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Impostare una micropipetta P20 a 10 µ l e forma una punta larga annoiata ad esso. Se largo annoiati suggerimenti non sono disponibili, tagliare le punte dei puntali regolari con un pulito forbici o bisturi per allargare il foro. 
		Nota: Questo dovrebbe ridurre tosatura e preservare la morfologia complessiva di sferoidi durante il trasferimento per dosaggio piastre.</li>
		<li>Utilizzare una superficie calda (37 ° C) di effettuare trasferimento di sferoidi. Utilizzare una superficie di Visualizzatore pellicola di raggi x scaldata con una lampada a luce bianca per migliorare il contrasto e visualizzazione di sferoidi durante il processo di trasferimento di aiuti.</li>
		<li>Attentamente aspirato un singolo pre-lavato sferoide dalla piastra di crescita cellulare repellente utilizzando una micropipetta P20 dotato di un ampio foro punta e delicatamente sferoide di trasferimento direttamente nel centro di ciascun pozzetto di una piastra di dosaggio sferoide per svolgere il metabolico test. Consentire ogni sferoide dolcemente cadere in micro-camera centrale di ciascun pozzetto per gravità pura per popolare la piastra dosaggio. 
		Nota: Richiede solitamente 5-8 s per ogni sferoide a cadere verso il centro del pozzo di gravità. Non estrarre la pipetta fino a quando le sferoidi si sono stabiliti nella micro-camera. Fare non il deposito sferoidi nei pozzetti della piastra assay (A1, A12, H1, H12) poiché questi 4 angolo verrà utilizzato come pozzi sfondo.</li>
		<li>Monitorare la morfologia e la posizione di ogni sferoide per garantire che ogni sferoide è al centro di ciascun pozzetto. Se necessario, riposiziona al centro del pozzo aspirando fuori sferoide utilizzando un ampio foro puntale e successiva deposizione dalla forza di gravità.</li>
		<li>Una volta che sono stati trasferiti tutti gli sferoidi, posizionare la piastra di dosaggio in un incubatore a 37 ° C aria umidificata (non-CO 2) per prima un'ora del test.</li>
	</ol></li> <li>Cartuccia sensore con composti e dell'eseguimento del test di carico <ol><li>preparare 10 × concentrato specifici reagenti nei media specifico dosaggio descritto al punto 2.1.2. Ad esempio, per eseguire GST, ricostituire il glucosio, oligomycin e 2-DG in volumi consigliati cui il manuale di analisi. Analisi GST e di MST sono state effettuate utilizzando Patu8902-PS1 sferoidi.</li>
		<li>Correttamente orientare la cartuccia sensore con righe etichettate A-H sul lato sinistro e posizionare una guida di caricamento sopra la cartuccia sensore. Garantire il corretto caricamento della porta desiderata orientando la Guida di carico affinché la lettera corrispondente alla porta per essere caricato è all'angolo superiore sinistro.</li>
		<li>Usando una pipetta multicanale, dispensare i reagenti direttamente nei porti di iniezione. Tenere carico guide in posizione utilizzando la punta delle dita durante l'intera procedura. 
		Nota: Ciascun reagente verrà iniettato in una porta consigliata di cui il manuale di analisi. Evitare la creazione di bolle d'aria, ma non toccare qualsiasi parte della cartuccia per rimuovere le bolle d'aria.</li>
		<li>Rimuovere caricamento Guida e posizione al livello degli occhi con cartuccia per ispezionare visivamente porte di iniezione per il caricamento anche.</li>
		<li>Creare il protocollo di design/strumento di analisi sperimentale utilizzando il controller di strumento software Wave (d'ora in poi, software di analisi), come descritto nella sezione 2.3.</li>
	</ol></li> <li>Analisi progettazione e l'esecuzione utilizzando il software di analisi <ol><li>Crea un modello di analisi per l'esperimento <ol><li>aprire il software di analisi e fare clic su &#34; modelli &#34; o scegliere da un test esistente modello. Fare doppio clic su &#34; modello vuoto &#34;.</li>
			<li>Definire gruppi sperimentali e condizioni.
			<ol><li>Strategie di iniezione di definire per le porte A, B e C. lasciare vuoto di porta D. 
				Nota: Per l'analisi di GST, solo queste porte verranno caricate con glucosio, Oligomycin e 2-DG. In caso di analisi di MST, verrà caricati oligomycin, FCCP e rotenone.</li>
				<li>Pre-trattamenti definire se sferoidi sono stati trattati con uno o più composti di prova e il gruppo di controllo. Definire il supporto di analisi per includere la sorgente, supplementi e altre informazioni.</li>
				<li>Definire uno o più celle tipo (ad es. Patu8902, PS1) vedendo le informazioni sul numeri di densità e passaggio.</li>
			</ol></li> <li>Clic &#34; generare gruppi di &#34;.</li>
			<li>Clic &#34; piastra mappa &#34; scheda e assegnare gruppi alla piastra dosaggio corrispondente al disegno sperimentale.</li>
			<li>Selezionare i pozzi di quattro angoli come pozzi di sfondo. Assicurarsi che non siano nessun sferoidi in questi pozzetti.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Eseguire analisi sull'analizzatore <ol><li>scegliere la scheda protocollo strumento mantenere l'impostazione predefinita i comandi del protocollo controllando &#34; Calibra &#34;, &#34; equilibrato &#34; e &#34; ciclo di misurazione Baseline &#34;.</li>
		<li>Clic &#34; iniezioni &#34; e definire composto per ogni porta. Modificare i cicli di misura a 6 cicli dal valore predefinito 3 cicli per sferoidi. Mantenere l'impostazione predefinita 3 min mix, 0 min attesa e volte misura 3 min. 
		Nota: Orario di mix-attesa-misura predefinito è 0 min, 3 min, 3 min, rispettivamente. Tre tasso basale misurazioni vengono effettuate in genere prima dell'iniezione del primo dosaggio di composto. Queste misurazioni possono essere calibrate e riadattate come per il disegno sperimentale.</li>
		<li>Revisione protocollo e gruppo sintesi.</li>
		<li>Salva modello struttura test.</li>
		<li>Procedere alla calibrazione del pre-dosaggio una volta porti di iniezione sono state caricate con substrati di dosaggio. Trasferire la cartuccia con la piastra di utilità per l'analizzatore di flusso extracellulare. 
		Nota: Questo di solito viene completata entro 15-20 min e calibra i sensori per eseguire misurazioni di OCR ed ECAR.</li>
		<li>Dopo la taratura della cartuccia, riposizionare la piastra di utilità con la piastra di test pre-riscaldato contenente 3D sferoidi e avviare il test. Dopo aver completate le misurazioni, è possibile esportare i dati in fogli di calcolo o software grafico e statistico per analizzare i dati.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori George W. Rogers e Andrew Neilson sono dipendenti/azionisti di Agilent Technologies che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Utilizzo di cancro del pancreas, la 3rd principale causa di cancro decessi negli Stati Uniti24, come esempio e modello, un metodo rapido e coerenza è stato sviluppato per crescere e analisi 3D sferoidi utilizzando il co-coltura delle cellule di cancro del pancreas e attivato fibroblasti del pancreas. Utilizzando magnetico multimateriali, sferoidi che variano nel formato da 400-600 µm di diametro sono stati ottenuti. Questi sono stati sottoposti a test metabolici per verificare correttamente la funzionalità di sferoidi 3D coltivate. Questo metodo è semplice, coerente e può essere facilmente adattato ad altri tipi di cella.
Mentre questa metodologia accelererà e aggiungere il valore traslazionale delle analisi eseguite con sferoidi 3D, può essere migliorata attraverso lo sviluppo di tecniche che consentono il multiplexing di manipolazione della sferoide e movimentazione. Questo dovrebbe ridurre ulteriormente la complessiva tempo, costo e la manodopera necessaria per svolgere il test. Inoltre, volumi sferoide possono essere utilizzati per normalizzare i segnali di OCR come riportato da altri6. Volume della sferoide normalizzati dal volume medio di una cella potrebbe essere utilizzato per determinare OCR per la cellula, ma dal momento che la crescita di sferoidi non saranno identico, calcolando un assoluto OCR per cella potrebbe essere difficile. Attualmente, questa metodologia è limitata dalla mancanza di uno strumento efficace per multiplex sferoide movimentazione e trasferimento da placche di crescita ambiente di test.
Il metodo descritto è modificato e adattato dalla tecnologia magnetica multimateriali e ulteriormente convalidato per mostrare la rilevanza funzionale applicando le sferoidi coltivate a un'analisi metabolica a valle. Il metodo fornisce un importante strumento per generare sferoidi robusti, praticabile e funzionale che contengono i due tipi principali delle cellule trovati nella maggior parte dei tessuti del tumore, le cellule tumorali e fibroblasti di cancro associato, che possono essere impiegati per altri saggi in fase di sperimentazione, ad esempio gli schermi della droga. La relativa facilità e l'efficienza della metodologia NS è un miglioramento importante sopra altri metodi25, come l'impiccagione drop metodo2,26 di generazione sferoide.
Sferoidi robusti generati come tali forniscono un in vitro del tumore modello che include cellule stromali, che spesso mancano da molti studi di cultura 3D. Le possibilità di applicazione dei modelli 3D sferoide creati come tali sono molto vaste. Ad esempio, tali modelli possono essere impiegati per studiare le interazioni cellula-cellula, turni di bioenergetica e di testare la suscettibilità genetica e dipendenza dei vari regimi terapeutici. Sferoidi 3D che ricapitolano il microambiente tumorale in vivo servono come strumento altamente pertinente e utili per gli studi e quelli indagando i meccanismi di azione di terapeutica corrente e romanzo di screening di stupefacenti. Analisi metaboliche sondaggio vie energetiche utilizzando sferoidi culture con cellule mutanti possono contribuire a gettare nuova luce sul ruolo di questi geni e vie relative nel pathobiology in un modello 3D rilevante di cancro, come sferoidi descritti in questo studio.
La riuscita applicazione di questo metodo si basa innanzitutto sulla salute delle cellule necessarie per la stampa magnetica, motivo per cui cella crescendo in fase logaritmica dovrebbe essere raccolte e magnetizzato. È fondamentale utilizzare l'unità magnetica sferoide per stampare celle magnetizzate e non l'unità di holding, che dovrebbe essere utilizzato solo durante il lavaggio della sferoide e media replenishing passaggi del metodo descritto. L'altro aspetto più critico per il successo della lettura di saggi metabolici è mantenere la morfologia di sferoidi durante il processo di trasferimento dalla piastra di crescita per la piastra di dosaggio.
Nel complesso, questo protocollo è stato stabilito per la generazione di sferoidi 3D che contengono sia cancro e cellule stromali, dopo successivi test metabolici di sferoidi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Le caratteristiche principali di questo metodo sono che è rapido, facilmente adattabile e coerenti, pertinenti e imita il microambiente tumorale in vivo , è relativamente poco costoso e può servire come un nuovo strumento per studiare la biologia del tumore e lo sviluppo di anticancro agenti.

Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati numerosi modelli 3D in vitro per ricapitolare e per studiare in vivo del tumore biologia, microambiente e crescita condizioni di cancro cellule1,2. Coltura sistemi con un'esposizione uniforme agli fattori biochimici e composti in fase di sperimentazione non riescono a replicare le interazioni tumore-stroma 3D native esposte a una sfumatura di composti attraverso l'extracellulare di cellule dello strato monomolecolare di bidimensionale (2D) matrice proteine (ECM)3,4. Così, rispetto ai modelli 2D coltura tissutale, cancro 3D modelli sono emerso per mostrare meglio il potenziale a simulare il microambiente tumorale e servito come strumenti importanti per meglio comprendere in vivo le caratteristiche del tumore, quali ipossia, il desmoplasia, dormienza, penetranza di droga, tossicità e resistenza terapeutica5,6. A tal fine, modelli 3D hanno il potenziale di colmare il divario tra coltura cellulare 2D e modelli animale intero imitando in vivo caratteristiche del tumore, pur essendo relativamente poco costoso e ottimizzato per la generazione rapida e coerenza. Questi vantaggi vengono sfruttati per accelerare la ricerca traslazionale in molti settori tra cui biologia del cancro, morfogenesi e7,8di ingegneria tissutale.
In un impeto di evoluzione di metodi di coltura del tessuto 3D, tecniche di levitazione magnetica hanno recentemente sviluppati e descritti per la crescita, analizzante e imaging di sferoidi derivati da varie cellule tipi9,10, 11 , 12. magnetico 3D multimateriali sfrutta l'uso di forze magnetiche di ingegnere tessuti da cellule con nanoparticelle biocompatibile di magnetizzazione e stamparle in formati multi-pozzetto. Questo consente la rapida produzione di coerente, vicino identici sferoidi 3D, che possono essere sfruttate e utilizzate per una pletora di applicazioni a valle per indagini biochimiche e biofisiche10. Qui abbiamo adattato la tecnica multimateriali magnetica utilizzando un materiale biocompatibile chiamato Nanoshuttle (NS) è composta da ossido di ferro, poli L-lisina e oro nano particelle per etichettare i fibroblasti e le cellule di cancro del pancreas. NS attribuisce elettrostaticamente alla membrana del plasma, non è noto da associare a qualsiasi specifici recettori, e uscite fuori la cella in superficie entro una settimana. Richiede forze magnetiche molto basse (30pN), abbastanza per aggregato, ma non danno delle cellule e non influisce l'attuabilità delle cellule, il metabolismo o proliferazione per renderlo estremamente biocompatibile per culture 3D10,13,14 ,15.
In questo studio, utilizzando il cancro del pancreas come esempio e modello, descriviamo la generazione e l'analisi metabolica di sferoidi cellulare-fibroblasto cancro 3D. A partire da cellule coltivate in vasi 2D, illustriamo le condizioni di cultura e di crescita di sferoidi di co-coltura di tumore pancreatico-fibroblasto utilizzando multimateriali magnetico. Sferoidi coltivate sono stati poi utilizzati in analisi metaboliche funzionali utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, una tecnologia dimostrato misurare simultaneamente i due percorsi di produzione energetici principali, la glicolisi e la respirazione mitocondriale, in una varietà di live cellule e tessuti16,17,18,19,20. La glicolisi è stata misurata come una variazione nel tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), mentre la respirazione mitocondriale o fosforilazione ossidativa è stata misurata come tasso di consumo di ossigeno (OCR). Proponiamo che questo metodo sviluppato per sferoidi di tumore pancreatico può servire come una dorsale per ottimizzazione e traduzione 3D tumore sferoide generazione e analisi di altri tipi di tessuto e delle cellule.

<table style="border-collapse:collapse;width:646pt" width="861">
	<colgroup>
		<col style="width:186pt" width="248" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:230pt" width="307" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td class="xl22" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl34" style="width:89pt" width="119">25300-054</td>
			<td class="xl35" style="width:230pt" width="307"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:186pt;height:31.5pt" width="248">96 well cell repellant plate</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">USA Scientific/ Griener Bio-One</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655970</td>
			<td class="xl21">spheroid growth plate</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Cellometry Cell counting slides</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nexcelom&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">CHT4-SD100-002</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl19" height="20" style="width:186pt;height:15.0pt" width="248">D-Glucose</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">D9434</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl19" height="20" style="width:186pt;height:15.0pt" width="248">DPBS</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Gibco</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">14190-144</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">103020-100</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">L-Glutamine</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">59202C</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">103015-100</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">n3D Magnetic Spheroid drive</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:186pt;height:31.5pt" width="248">n3D Magnetic Spheroid holding drive</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">n3D NanoShuttle-PL&#160;</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit:&#160; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Patu8902 cells</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Laboratory Stock</td>
			<td class="xl19" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">pancreatic ductal adenocarcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">PS1 cells</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Laboratory Stock</td>
			<td class="xl19" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">activated pancreatic stellate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">RPMI1640</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Gibco</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">11875-093</td>
			<td class="xl21">growth media for cells, spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="45" style="height:33.75pt">
			<td class="xl19" height="45" style="width:186pt;height:33.75pt" width="248">SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">extracellular flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Sodium Pyruvate</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">S8636</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td class="xl19" height="24" style="width:186pt;height:18.0pt" width="248">XF Base media</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">102365-100</td>
			<td class="xl21">base media for metabolic assays on XFe96</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts

Molti tipi di cancro, tra cui il cancro del pancreas, hanno uno stroma fibrotico denso che svolge un ruolo importante nella progressione del tumore e l'invasione. Fibroblasti attivati cancro associato sono una componente fondamentale dello stroma del tumore che interagiscono con le cellule tumorali e sostenere la loro crescita e sopravvivenza. Modelli che ricapitolano l'interazione delle cellule tumorali e attivato fibroblasti sono strumenti importanti per studiare la biologia stromal e per lo sviluppo di agenti antitumorali. Qui, un metodo è descritto per la generazione rapida di co-coltura robusto sferoide 3-dimensionale (3D) delle cellule del tumore pancreatico e fibroblasti attivati del pancreas che possono essere utilizzati per successivi studi biologici. Inoltre, descritto è l'uso di sferoidi 3D nello svolgimento delle analisi funzionali metaboliche per sondare le vie di bioenergetica cellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare accoppiato con una micropiastra sferoide. Le cellule di cancro del pancreas (Patu8902) e le cellule del fibroblasto pancreatici attivati (PS1) sono state co-coltivate e magnetizzato utilizzando un assembly di nanoparticella biocompatibile. Magnetizzato cellule erano rapidamente bioprinted utilizzando unità magnetiche in un formato ben 96, in crescita media per generare sferoidi con un diametro che varia tra i 400-600 µm entro 5-7 giorni di cultura. Analisi metaboliche funzionali utilizzando Patu8902-PS1 sferoidi poi venivano realizzate utilizzando la tecnologia di flusso extracellulare per sonda vie energetiche cellulari. Il metodo qui è semplice, permette la generazione costante di cancro cellula-fibroblasto sferoide co-colture e può essere potenzialmente adattato per altri tipi di cellule di cancro all'ottimizzazione della metodologia descritta corrente.

Il flusso di lavoro generale per l'analisi di flusso extracellulare di sferoidi 3D e multimateriali magnetico 
Figura 1 illustra una panoramica dell'intero processo descritto in questo protocollo. Le cellule di cancro del pancreas (Patu8902) e le cellule stellate attivate (PS1) sono state coltivate in coltura tissutale recipienti contenenti la media di crescita appropriata a una confluenza di 70-80%. Le cellule sono state distaccate dalla nave di cultura 2D e lavato, densità delle cellule è stata determinata e cellule infine risospese nel media di crescita presso 1 × 106 cellule/mL. NS, un assembly di nanoparticella costituito da oro, ossido di ferro e poli-L-lisina è stato utilizzato per magnetizzare le cellule. Cellule Patu8902 e PS1 individualmente magnetizzate erano poi mescolate e stampate sulla crescita cellulare repellente 96 pozzetti piastre montate su un disco magnetico sferoide. Abbiamo ottimizzato i 15.000 per essere il numero totale di cellule per il seeding di un singolo pozzo (5.000 Patu8902 cellule miscelati con 10.000 PS1 cellule per generare un singolo sferoide). Dopo incubazione in condizioni di coltura del tessuto appropriato per 5-7 giorni, 3-dimensionale sferoidi sono stati ottenuti, durante i quali la crescita di questi sferoidi era monitorata e registrata. Dopo il lavaggio con media di dosaggio, sferoidi erano fisicamente trasferiti su una micropiastra sferoide di svolgere analisi metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare per la misura simultanea di glicolisi e respirazione mitocondriale.
Cultura e crescita di sferoidi di tumore pancreatico-fibroblasto Per ottenere sferoidi funzionale e robusti, la cellula tumorale epiteliale linea Patu8902 e attivato le cellule stellate PS1 sono state coltivate in RPMI-1640 completati con siero fetale bovino. Pat8902 e cellule di PS1 magnetizzate con NS erano poi mescolate in un rapporto di 1:2, in modo da un totale di 15.000 cellule per pozzetto di una piastra di crescita del seme. All'interno di 24 h di stampa le celle sui dischi magnetici, cellule focalizzato al centro del pozzo esattamente sulla cima di ogni perno magnetico sotto ciascun pozzetto. Crescita di sferoidi Patu8902-PS1 è stata monitorata da formazione immagine nei giorni 2, 4, 7 e 9 dopo la semina di cellule. La figura 2 Mostra la quantificazione del diametro medio di sferoidi rappresentativi a vari intervalli di tempo sopra. Il diametro di sferoidi aumenta da 414 µm giorno 2 a 596 µm il giorno 7 post stampa. Non c'era differenza significativa tra la crescita nei giorni 7 e 9, e così tutti gli altri la sperimentazione era limitata a 7 giorni di crescita della sferoide. Abbiamo notato che le sferoidi acquisiscono una morfologia più nitida soprattutto intorno ai bordi esterni e il NS è progressivamente più uniformemente diffusa in tutto il volume della sferoide con più giorni nella cultura. Inoltre abbiamo stimato la sfericità della 10 sferoidi in base alla lunghezza del loro assi maggiore e minore. La sfericità medio è 0.92 ± 0,04 per Patu8902 da solo (tumore), 0.95 ± 0,04 per PS1 (stromali) da solo e 0.94 ± 0.02 per sferoidi di co-coltura.
Analisi funzionale metabolica del pancreas sferoidi 3D utilizzando il analizzatore di flusso extracellulare Per verificare la funzionalità di sferoidi, abbiamo impiegato metabolica e analisi bioenergetica per sondare le vie energetiche in sferoidi. Abbiamo effettuato un test di stress di glicolisi su sferoidi coltivate come descritto sopra. A tal fine, sferoidi generati dalle cellule Patu8902 o PS1 oltre a quelli derivanti da una co-coltura delle due tipi cellulari sono stati sottoposti a test. Interessante, tutti i tre tipi di sferoidi, se che proviene dalle cellule distinte o miste, hanno esibito una risposta biologicamente funzionale per il dosaggio di GST. Al momento di iniettare una saturante concentrazione di glucosio, i tipi di sferoidi testati Visualizza aumenti nella via glicolitica, come evidenziato da un aumento in ECAR (Figura 3). Quando, produzione mitocondriale di ATP è stata inibita utilizzando oligomycin, produzione di energia si sposta verso la glicolisi e spinto le cellule alla massima capacità glicolitica, vista come ulteriore aumento ECAR. Inibizione della glicolisi utilizzando 2-DG, un glucosio analogico che lega competitivamente glucosio esochinasi, ha provocato una diminuzione in ECAR, confermando che il precedente aumento ECAR è stato a causa di attività glicolitica. Abbiamo notato che le sferoidi testati in questo studio ha risposto in questo modo, anche se la PS1 solo sferoidi (diametro medio 250 µm) avevano un segnale relativamente inferiore, probabilmente a causa della loro dimensione più piccola e bassa capacità glicolitica rispetto al cancro Patu8902 cellule (diametro medio 600 µm). In generale, una maggiore ECAR segnale dalla cellula del tumore derivata sferoidi rispetto a quelli da relativamente più piccolo del fibroblasto PS1 derivato sferoidi, potrebbe probabilmente essere attribuita a inclinazione di metabolica intrinseca delle cellule tumorali verso glicolisi22, 23. Tutti i tre tipi di sferoidi sono stati derivati dalla semina lo stesso numero di cellule, anche se abbiamo notato che la variazione della dimensione della sferoide fra ogni tipo, con PS1 solo sferoidi essendo il più piccolo, seguita da sferoidi di co-coltura, e Patu8902 da sola sferoidi essendo il più grande.
Per verificare la funzione mitocondriale in sferoidi 3D, abbiamo sottoposto sferoidi di co-coltura ad un dosaggio di MST. Il MST misura parametri chiave della funzione mitocondriale misurando direttamente OCR delle cellule (Figura 4A e 4B). Un'iniezione seriale con composti (oligomycin, FCCP e un mix di rotenone e antimycin A) serviva a misurare parametri chiave mitocondriali quali, produzione ATP, massima respirazione e la respirazione non mitocondriale. Questi parametri e tassi di respirazione basale sono stati ulteriormente utilizzati per calcolare la perdita di protone e ricambio capacità respiratoria (Figura 4). Una diminuzione in OCR in risposta a oligomycin, un inibitore del trifosfato di adenosina synthase (complesso V) è correlato alla respirazione mitocondriale associata con produzione di ATP cellulare. Sferoidi sono state incubate con oligomycin per una durata più lunga consentire la massima penetrazione e tempo di risposta efficiente. Una seconda iniezione con il disaccoppiante FCCP stimola il massimo consumo di ossigeno e un corrispondente incremento di OCR. L'OCR FCCP-stimolato è stato utilizzato per calcolare ricambio capacità respiratoria, una misura della capacità della cellula di rispondere alla domanda di maggiore energia. La terza iniezione; un mix di rotenone, (un complesso ho inibitore) e antimycin A (un inibitore del complesso III) blocca la respirazione mitocondriale, vista come una forte diminuzione in OCR (Figura 4BONG &gt;).
Nel complesso, le nostre osservazioni confermano la funzionalità di sferoidi coltivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare come una misura della loro impronta/attività metabolica sia in termini di potenziale glicolitico e mitocondriale come descritto sopra.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
Figura 1 . Rappresentazione schematica della metodologia per la cultura e il dosaggio di sferoidi di cancro pancreatico cellule/del fibroblasto. Patu8902 e PS1cells sono state coltivate, tripsinizzate, lavate e contati. Per la semina ogni sferoide, Patu8902 (5.000 cellule/pozzetto) e fibroblasti PS1 (10.000 cellule/pozzetto) erano magnetizzati utilizzando NS e stampato su una piastra di crescita cellulare repellente il giorno 1. Dopo la semina, la piastra di crescita era montata su un disco magnetico sferoide (con un magnete sotto ciascun pozzetto della piastra di crescita 96 ben formato) e permise alla cultura per 2-7 giorni ottenere 3D sferoidi. Sferoidi risultante sono stati lavati e trasferiti al sferoide dosaggio micropiastre per svolgere le analisi metaboliche sullo strumento flusso extracellulare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
Figura 2 . Crescita di sferoidi di tumore pancreatico-fibroblasto. (A) un'immagine rappresentativa della sferoide di co-coltura Patu8902-PS1 corrispondente al giorno nella cultura è mostrata in alto a sinistra e le dimensioni di diametro di sferoide (µm) sono quantificata di sotto. Progressivo aumento nel formato della sferoide e diffusione di particelle di NS (puntini scuri) in tutto il suo volume è evidente tra 2 e 7 giorni. Sferoidi erano tenute in coltura per altri 2 giorni dopo questo, che non ha provocato un aumento significativo di diametro sferoide. (B) rappresentante immagini di sferoidi derivati dalle cellule del tumore (Patu8902), le cellule dello stroma (PS1) e cellule co-coltivate (Patu8902 + PS1) è mostrato. Dati (C) sfericità sono raffigurati da 10 sferoidi individuali da ogni gruppo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
Figura 3 . Glicolisi Stress Test (GST) con pancreatici sferoidi. (A) schematica rappresentazione di un'analisi della funzione tipica glicolitico con vari parametri di dosaggio raffigurato. (B) un esempio di un test di GST eseguita su sferoidi pancreatiche coltivate utilizzando la metodologia descritta. Rampa di iniezione di glucosio su glicolisi visto come un aumento di ECAR, con ulteriore aumento su aggiunta di oligomycin per spegnere la respirazione mitocondriale. ECAR cade in risposta a 2-DG, un analogo competitivo di glucosio, bloccando la glicolisi. Tutti gli sferoidi sono notati per esibire una risposta funzionale per il dosaggio di GST. (C) un'uscita del dosaggio GST utilizzando il generatore di report del produttore raffigurante i tre parametri principali del dosaggio GST. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
Nella figura 4. Mitocondriale Stress Test (MST) con Patu8902-PS1 sferoidi. (A) schematica rappresentazione di un'analisi della funzione mitocondriale tipica con vari parametri di dosaggio è raffigurato. (B) un esempio di una MST su sferoidi tumore pancreatico-fibroblasto è mostrato. Sferoidi 3D (C) co-coltura esibiscono una risposta funzionale per il dosaggio di MST. Come previsto, la funzione mitocondriale misurata come un declino in OCR è stata notata quando sferoidi sono stati sfidati con oligomycin, un inibitore di ATP sintasi. Usando FCCP per accelerare il flusso di elettroni provocato maximal OCR, che immediatamente crollato all'inibizione della respirazione mitocondriale usando un - cocktail di inibitori del complesso mitocondriali. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.1K Views.  Translational Genomics Research Institute. Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Video: Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant behavior and high resistance to therapeutic treatments. Indeed, despite many efforts, both standard chemotherapy and innovative target therapies have substantially failed when moved from preclinical evaluation to the clinical setting. In this scenario, the development of preclinical mouse models better mimicking in vivo characteristics of PCa is urgently needed to test newly developed drugs. The present protocol describes a method to generate a mouse model of PCa, represented by an orthotopic xenograft obtained by ultrasound-guided injection of human pancreatic tumor cells. Using such a reliable and minimally invasive protocol, we also provide evidence of in vivo engraftment and development of tumor masses, which can be monitored by ultrasound (US) imaging. A noteworthy aspect of the PCa model described here is the slow development of the tumor masses over time, which allows precise identification of the starting point for pharmacological treatments and better monitoring of the effects of therapeutic interventions. Moreover, the technique described here is an example of implementation of the 3Rs principles since it minimizes pain and suffering and directly improves the welfare of animals in research.

We present a protocol to generate a minimally invasive orthotopic pancreatic cancer model by ultrasound-guided injection of human pancreatic cancer cells and the subsequent monitoring of tumor growth in vivo by ultrasound imaging.

Generazione di uno xenotrapianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche mediante iniezione guidata da ultrasuoni

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...