우리는 문화 조건 최적화 및 회전 타원 체 성장 모니터링에 사무엘 Zirbel에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리는 해 마 XFe96 분석기, 분석 시 약 및 기술 통찰력을 제공 하기 위한 Agilent 기술에 감사입니다. 우리 또한 감사 박사 Hemant Kocher 바트 암 연구소 영국에서 제공 하는 PS1 셀. 이 작품 지원 부분에서 Seena Magowitz 재단에 의해 췌 장 암 연구와 서 최대 암-암 연구 영국 루스 재단 췌 장 암 드림 팀 연구 부여 (부여 번호: SU2C-AACR-DT-20-16). 암 최대 스탠드 엔터테인먼트 산업 재단의 프로그램입니다. 연구 보조금은 암 연구, SU2C의 과학적인 파트너를 위한 미국 협회에 의해 관리 됩니다.

1. 췌장암의 문화 3D Spheroids 자석 Bioprinting를 사용 하 여 <ol><li>사용 표준 무 균 조직 배양 기술, 적절 한 성장 매체에 70-80%의 confluency T75 플라스 크에 대 한 관심의 문화 셀. 
	참고: 일반적으로 5-7 × 10 6 세포는 70-80% confluent T75 플라스 크에서 했다 수확. 두 개의 서로 다른 세포 유형이이 연구-Patu8902에서에서 사용 되었다 (췌 장 종양 세포)와 PS1 셀 (활성화 된 췌 장 방사상 세포 21). 두 셀 라인 로스웰 파크 기념 연구소 미디어 1640 (RPMI-1640) 10% (v/v) 태아 소 serum(FBS), 1 × 페니실린-스 (p/s)와 보완에 교양 있었다.</li>
	<li>한 번 Dulbecco의 5 mL로 세포 세척 &#39; s 인산 염 버퍼 saline(DPBS).</li>
	<li>플라스틱에서 분리 세포 표면 0.05%의 2 mL와 trypsinizing에 의해 트립 신-EDTA 37에서 5-10 분에 대 한 현미경으로 세포 분리에 대 한 ° C. 확인.</li>
	<li>비활성화 trypsin 8 mL 성장 매체의 추가 의해 세포를 분리. 이 부정적인 건강/세포의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다 trypsinization, 피하기.</li>
	<li>피펫으로 세포 아래로 단일 셀 펜션과 카운트를 생성 하는 자동화 된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 밀도 셀.</li>
	<li>한편, 주위 온도에 NS의 유리병 equilibrate.</li>
	<li>원하는 수 spheroids (우물)와 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 약 수를 뿌리기에 필요한 셀의 양을 계산 합니다. 예를 들어 전체 96 잘 접시 5000 셀/음, 약 수 적어도 5.5 × 10 5 셀 씨.</li>
	<li>수집 셀 신중 하 게 3 분에 대 한 500 x g에서 centrifuging 발음 또는 가만히 따르다는 상쾌한 고 성장 매체에서 10 6 셀/mL x 1.0의 농도에서 세포를 resuspend. 부드럽게 넓은 지 루 피펫으로 팁을 사용 하 여 기울이기 피하기 위해 플라스틱. 예를 들어 성장 매체의 550 µ l resuspend 5.5 x 10 5 셀.</li>
	<li>Equilibrated NS (1.6 단계)를 사용 하 여 셀의 원하는 금액을 끌다.
	<ol>직접 <li>성장 매체에 세포 현 탁 액에 NS를 추가 하 고 부드럽게 선동. 라벨에 대 한 효율적인 자기 세포의, (1 x 10 6 셀/mL에서 resuspended) 100 µ L 셀 당 10 µ L NS 사용. 
		참고: 일반 실험에 대 한 레이블 5.5 × 10 5 Patu8902 세포 550 µ L 55 µ L NS와 1.1 × 10에에서 6 PS1 셀 1100 µ L, (별도) 110 µ L NS와.</li>
		<li>부드럽게 반전 튜브 몇 번 세포 현 탁 액을 위해. 일시적으로, 24-잘 접시의 단일 잘으로 셀-NS 믹스를 전송 합니다. 각 셀 형식을 자성에 대해 별도로 이렇게 합니다. 커버 플레이트 및 셀 표면에 NS 바인딩 수 있도록 부드러운 떨고와 2 시간에 대 한 실 온에서 세포를 품 어. 
		참고: 문화 및 공동 문화 spheroids 둘 다 시작 뿐만 아니라 Patu8902 또는 PS1 혼자 셀에서 시작 하는 spheroids의 분석 결과 셀 인쇄 마그네틱 드라이브에 성공적으로 독립에이 메서드를 사용 하 여 달성 하기 전에 혼합 유형 실험입니다. Patu8902 및 p s 2 세포에서 공동 문화 spheroids를 생성 하는 방법 후속 단계에 아래 설명.</li>
	</ol></li> <li>피펫으로 자성된 셀 아래로 부드럽게 균일 하 게 혼합 하 고 원하는 셀 번호를 포함 하는 마스터 믹스를 준비 하. Spheroids 시드 (5000 Patu8902 + 10000 PS1) 15, 000 셀의 총을 사용 하 고 96 잘 접시의 당 150 µ L의 총 볼륨 조정. 
	참고: 각 음에 적절 하 게 최종 볼륨 사용 하는 셀의 수에 관계 없이 동일 이어야 합니다.</li>
	<li>96 잘 자기 회전 타원 체 드라이브 꼭대기 셀 구 충 제 96 잘 접시 놓고 각 우물에 셀 혼합의 150 µ L를 분배 합니다. 세포 관찰 천천히 자석 위에 우물의 센터에 수집 합니다. 커버 하 고 37 ° C에 아직도 연결 된 자석 회전 타원 체 드라이브 설정 5% CO 2 인큐베이터에서 하룻밤 접시를 품 어. 마그네틱 드라이브를 제거 하 고 추가 성장 최대 7 일 동안 품 어. 
	참고: 회전 타원 체 인쇄 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 셀 구 충 제 성장 격판덮개를 사용 하 여 중요 한 이다. 얇은 작은 자석 회전 타원 체 드라이브 사용 되도록 하지 지주 드라이브.</li>
	<li>성장의 spheroids 매일 모니터링합니다. 자기 각도에서 드라이브를 들고와 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 보낸된 미디어 끌어낼 것에 성장 격판덮개를 배치 하 여 3 일 마다 신선한 성장 미디어와 보충. 
	참고: Patu8902와 PS1 셀 공동에 15, 000 셀/잘 시드 5-7 일 이내 400-600 µ m의 직경을 가진 3D spheroids로 성장할 것입니다. Spheroids 신진 대사 특성, 약 평가 및 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비가 시점에서.</li>
</ol> 2. 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 생체 경로 대 한 3D 췌 장 종양 Spheroids의 대사 분석 결과 참고:이 섹션에서는, extracellular 플럭스를 사용 하 여 spheroids의 신진 대사 기능 분석 3D spheroids을 위해 설계 된 분석 결과 microplates로 분석기 설명.
<ol><li>세척 및 이전 spheroids의 성장 격판덮개에서 회전 타원 체 시험의 microplates. 
	참고: Spheroids ~ 500 µ m의 직경을 도달할 때 대사 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>수행 분석 결과, 전날 제공된 유틸리티 접시에 분석 결과 calibrant (200 µ L/잘)와 프로브 또는 센서 카트리지를 수 화와 품 어 37에서 설정 습도 인큐베이터 (비 CO 2)에서 하룻밤 (4 월 18 일 h) ° c.</li>
		<li>준비 적절 한 분석 결과 중간 원하는 대사 분석 결과 대 한 기본 미디어 (재료의 표 참조)을 보완 하 여 중 2 m m L-글루타민 분해 스트레스 테스트 (GST)에 대 한 분석 결과 또는 1 mM pyruvate, 2 m L-글루타민 m와 10mm 대 한 포도 당을 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 (MST) 분석 결과. 
		참고: 세포 외 유출 분석기 미토 콘 드리 아 호흡 (OCR) 및 96 잘 접시 형태로 라이브 셀의 분해 (ECAR)를 측정합니다. 이러한 요금 조사 샘플에 세포 신진 대사 기능에 대 한 개요를 제공합니다. 자세한 내용은 분석 결과 키트 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>추가 시험의 특정 보충제 (2.1.1 단계 참조), 후 37 ° C 물 욕조에 보충된 분석 결과 매체 따뜻하고 pH 7.4 ± 0.1 0.1N 조정 NaOH. 매체 사용까지 따뜻하게.</li>
		<li>Reconstitute 시험 권장 재고 농도 보정된 분석 결과 중간 시 약 키트. 
		참고:이 만들어집니다 10 ×에서 우물에 원하는 최종 농도. 포도 당, oligomycin 2 의하여 포도 당 (2-DG) 재고 농도 100 mM, 100 µ M, 500 m m, 각각.</li>
		<li>성장 플레이트는 조명 아래에서 관찰 spheroids 현미경; 모양 및 structur 회전 타원 체 형태 및 전반적인 균일성에 대 한 확인spheroids의 e.</li>
		<li>성장 플레이트 마그네틱 지주 드라이브에 전송 하 고 신중 하 게 ~ 120 µ L 성장 매체를 발음. 부드럽게 따뜻하게 하 고 사전 보정 분석 결과 미디어의 ~ 120 µ L 함께 spheroids를 세척 하 고 발음 하 고, 두 번 세척을 반복. Spheroids spheroids는 멀리 세척 되지 보장 하기 위해 다시 현미경 검사.</li>
		<li>각 잘을 180 µ L 따뜻한 분석 결과 미디어를 추가 하 여 회전 타원 체 분석 결과 미 판 준비.</li>
		<li>10 µ L를 P20 micropipette를 설정 하 고 그것을 넓은 지 루 팁에 맞는. 넓은 지 루 팁, 사용할 수 없는 경우 차단 일반 피 펫 팁의 팁 깨끗 한가 위 또는 구멍을 넓혀 메스. 
		참고:이 한다 전단 줄이고 플레이트 분석 결과를 전송 하는 동안에 spheroids의 전반적인 형태를 보존.</li>
		<li>는 따뜻한 (37 ℃) 표면을 사용 하 여 spheroids의 전송 수행. 화이트 라이트 램프로 따뜻하게 x 선 필름 뷰어 표면 대비 향상 하 고 원조 전송 과정에서 spheroids의 시각화를 사용 하 여.</li>
		<li>신중 하 게 aspirate P20 micropipette를 사용 하 여 셀 구 충 제 성장 플레이트에서 단일 미리 씻어 회전 타원 체 넓은 장착 구멍 팁과 부드럽게 전송 회전 타원 체는 대사 수행에 대 한 회전 타원 체 분석 결과 플레이트의 각 우물의 센터에 직접 분석 결과입니다. 부드럽게 분석 결과 접시를 채우기 위해 순수한 중력에 의해 각의 중앙 마이크로 챔버로가에 각 회전 타원 체 허용. 
		참고: 그것은 일반적으로 각 회전 타원 체 중력 우물의 중심으로가을 대 한 5-8 s를 걸립니다. spheroids 마이크로-챔버에 정착 할 때까지 피펫으로 밖으로 당겨 하지 마십시오. 배경 웰 스도 사용 될이 이후 분석 결과 플레이트 (A1, A12, H1, H12)의 4 코너 우물에서 예금 spheroids 하지 않습니다.</li>
		<li>형태와 각 회전 타원 체의 각 센터에는 되도록 각 회전 타원 체의 위치를 모니터링 합니다. 회전 타원 체의 넓은 사용 하 여 밖으로 발음에 의해 잘의 중심에 위치 변경 보어 중력에 의해 피펫으로 후속 증 착 및 필요한 경우.</li>
		<li>모든 spheroids 전송 되었습니다, 일단 1 시간 이전 시험에 대 한 분석 결과 접시는 37 ° C 습도 공기 인큐베이터 (비 CO 2)에 배치.</li>
	</ol></li> <li>화합물 및 수행 분석 결과 센서 카트리지 로드 <ol><li>준비 10 × 집중 분석 결과 특정 시 약 단계 2.1.2에서에서 설명한 분석 결과 특정 미디어에. 예를 들어 GST 수행, 포도 당, oligomycin, 및 2-DG 권장된 볼륨에 다시 구성할 언급 분석 결과 설명서에. GST 및 MST 분석 Patu8902 PS1 spheroids를 사용 하 여 실시 했다.</li>
		<li>제대로 센서 카트리지 행 왼쪽에 A H 표시 방향을 지정 하 고 센서 카트리지 위에 로드 가이드를 배치 합니다. 원하는 포트의 정확한 로드 로드 가이드는 해당 포트를 로드 하는 문자는 왼쪽 상단 모서리에 동쪽으로 향하게 하 여 보장.</li>
		<li>주입 포트에 직접 약을 분배 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 절차에 걸쳐 손끝을 사용 하 여 위치에서 로드 가이드를 잡아. 
		참고: 각 시 약 분석 결과 설명서에서 권장된 포트에 주입 될 것입니다. 공기 거품을 만들지 않도록 하지만 어떤 부분의 기포를 제거 하는 카트리지를 누릅니다 하지 않습니다.</li>
		<li>로드 가이드 및 카트리지 눈높이 위치 시각적으로 로드 주입 포트 검사 제거.</li>
		<li>실험 분석 결과 디자인/악기 프로토콜 섹션 2.3에에서 설명 된 대로 악기 컨트롤러 웨이브 소프트웨어 (금 후, 분석 소프트웨어)를 사용 하 여 만듭니다.</li>
	</ol></li> <li>시험 설계 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 실행 <ol><li>실험에 대 한 분석 결과 템플릿 만들기 <ol><li>분석 소프트웨어를 열고 클릭 &#34; 서식 파일 &#34;는 기존 분석 결과에서 선택 하거나 템플릿입니다. 더블 클릭 &#34; 빈 서식 파일 &#34;.</li>
			<li>정의 실험적인 그룹 및 조건입니다.
			<ol><li>포트 A, B 및 C. 떠나 정의 주입 전략 포트 D 빈. 
				참고: GST 분석 결과 대 한 이러한 포트에만 로드 됩니다 포도 당, Oligomycin와 2-DG. MST 분석 결과, 경우 oligomycin FCCP,로 테 논 로드 됩니다.</li>
				<li>정의 사전 치료 경우 spheroids 컨트롤 그룹과 하나 이상의 테스트 화합물으로 치료 했다. 분석 결과 미디어 소스, 보충, 및 기타 정보를 포함 하도록 정의.</li>
				<li>하나 이상의 셀 유형 (예: Patu8902, PS1) 밀도 및 통로 번호 정보를 보고 정의.</li>
			</ol></li> <li>클릭 &#34; 그룹 생성 &#34;.</li>
			<li>클릭 &#34; 플레이트 지도 &#34; 탭 및 그룹을 해당 실험 디자인 하 시험 접시 할당.</li>
			<li>배경 우물으로 4 개의 코너 웰 스를 선택합니다. 이 우물에서 아무 spheroids는 확인 하십시오.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>분석기에서 분석 결과 실행 <ol><li>악기 프로토콜 탭에서 클릭 선택 하 여 기본 프로토콜 명령을 유지 &#34; 보정 &#34;, &#34; 평형 &#34;와 &#34; 기준 측정 주기 &#34;.</li>
		<li>클릭 &#34; 주사 &#34; 화합물 각 포트에 대 한 정의. 편집 측정 주기 6 사이클에는 기본에서 spheroids에 대 한 3 주기. 기본 3 분 믹스, 0 분 대기, 3 분 측정 시간을 유지. 
		참고: 기본 믹스-대기-측정 시간은 3 분, 0 분, 3 분, 각각. 3 기저 속도 측정 일반적으로 첫 번째 시험 화합물의 주사 전에 간다. 이러한 측정을 보정 하 고 실험적인 디자인에 의하여 재조정 수.</li>
		<li>프로토콜 및 그룹 요약 검토.</li>
		<li>분석 결과 디자인 서식 파일 저장.</li>
		<li>주입 포트 분석 결과 기판으로 로드 되 면 사전 분석 결과 보정을 진행 합니다. 세포 외 유출 분석기 유틸리티 플레이트 카트리지 전송. 
		참고:이 일반적으로 15-20 분 이내 완료 및 OCR 및 ECAR 측정 센서 보정.</li>
		<li>카트리지의 교정, 후 3D spheroids를 포함 하는 미리 데워 분석 결과 플레이트 유틸리티 접시를 대체 하 고 분석 결과 시작할. 측정 완료 후 스프레드시트 또는 그래프와 통계 소프트웨어 데이터를 분석 하는 데이터를 내보낼.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자 조지 W. 로저스와 앤드류 닐슨 직원/주주 Agilent 기술 시 약 및이 문서에서 사용 되는 악기를 생산 하는. 다른 모든 저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

췌장암, 3층 을 사용 하 여 주요 원인이 암 관련 사망자24, 예제와 모델, 신속 하 고 일관 된 방법으로 개발 되었다 성장 하 고 췌장암 세포의 공동 문화를 사용 하 여 3D spheroids 분석 결과 미국에서와 췌 장 섬유 아 세포 활성화. 마그네틱 bioprinting를 사용 하 여, 직경에 있는 400-600 µ m에서 크기에서 배열 하는 spheroids 획득 했다. 이러한 대사 분석 교양된 3D spheroids의 기능을 성공적으로 테스트를 받게 했다. 이 방법은 간단 하 고 일관 된 이며 다른 세포 유형에 쉽게 적응 시킬 수 있다.
동안이 방법을 가속화 되며 3D spheroids를 사용 하 여 수행 하는 분석 실험의 변환 값에 추가, 회전 타원 체 조작의 멀티플렉싱 및 처리 기술을 개발 하 여 향상 될 수 있습니다. 이 전체 시간, 비용 및 분석 결과 수행 하는 데 필요한 노동 감소 추가 해야 합니다. 또한, 정상화 OCR 신호6다른 사람에 의해 보고 하 회전 타원 체 볼륨을 사용할 수 있습니다. 회전 타원 체 볼륨 셀의 평균 볼륨 정규화 셀 당 OCR을 결정 하기 위해 사용 될 수 있지만 계산 셀 당 절대 OCR을 도전 수 있습니다 spheroids의 성장 같지 않을 것 이다, 이후. 현재,이 방법론은 환경 시험에 성장 격판덮개에서 다중 회전 타원 체 처리 및 전송에 효율적인 도구의 부족에 의해 제한 됩니다.
설명 하는 방법은 수정 하 고 자석 bioprinting 기술에서 적응 이며 더 교양된 spheroids 다운스트림 대사 분석 결과 적용 하 여 기능적 관련성을 표시 확인. 메서드는 대부분 종양 조직, 암 세포 및 다른 조사 가능한 분석 실험을 위해 채택 될 수 있다, 암 관련 된 섬유 아 세포에 있는 두 개의 주요 셀 형식을 포함 하는 강력 하 고, 가능한 고 기능 spheroids을 생성 하는 중요 한 도구를 제공 합니다. 같은 약물 스크린. 상대적 용이성 및 NS 방법론의 효율성 같은 교수형 드롭 방법2,26 회전 타원 체 세대의25의 다른 방법을 통해 주요 개선 이다.
이와 같이 생성 하는 강력한 spheroids는 생체 외에서 종양 모델 stromal 세포, 종종 많은 3D 문화 연구에서 포함 된 제공 합니다. 이와 같이 생성 된 3D 회전 타원 체 모델의 응용 프로그램에 대 한 가능성은 광대 한. 예를 들어 같은 모델 세포 세포 상호 작용, 생체 변화를 조사 하 고 유전적 민감성과 다양 한 치료 regimens의 테스트를 사용할 수 있습니다. Vivo에서 종양 microenvironment 정리 3D spheroids 마약 검사 연구와 현재 및 새로운 치료제의 행동의 메커니즘을 조사 하 고 그에 대 한 매우 적절 하 고 유용한 도구 역할을 합니다. 에너지 경로 spheroids 돌연변이 세포 문화 그 유전자 및 암, 관련 3D 모델에서 pathobiology에 관련 된 통로의 역할에 새로운 빛을 발산 도움이 될 수를 사용 하 여 프로 빙 대사 분석이이 연구에서 설명 하는 spheroids 같은.
이 방법의 성공적인 응용 프로그램 제일 이유 로그 단계에서 성장 하는 세포를 수확 해야 하며 자기는 자기 인쇄에 필요한 세포의 건강에 의존 합니다. 그것은 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 인쇄 자성 전지와 하지 지주 드라이브, 회전 타원 체 세척 및 미디어 보충 설명된 방법의 단계 중에 활용 해야 하는 중요. 변화 분석 실험의 성공적인 판독에 대 한 다른 가장 중요 한 측면은 시험 접시에 성장 격판덮개에서 전송 과정은 spheroids의 형태를 유지 하는 것입니다.
전반적으로,이 프로토콜 암, stromal 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 spheroids의 후속 대사 분석 결과 다음을 포함 하는 3D spheroids의 생성을 위해 설립 되었습니다. 이 방법의 주요 특징은은 빠르고, 쉽게 적응 하 고 일관 된, 관련 그리고 vivo에서 종양 microenvironment 모방, 비교적 저렴을 항 암 종양 생물학을 공부 하 고 개발 하기 위한 새로운 도구로 제공할 수 있다 요원입니다.

지난 10 년간에서 수많은 생체 외에서 3D 모델 정리 하는 비보에 종양 생물학, microenvironment 및 성장 조건 암 세포1,2의 조사 개발 되었습니다. 2 차원 (2D) 단층 세포 생화학 요소와 조사 가능한 화합물에 균일 한 노출 시스템 실패는 extracellular 통해 확산 하는 화합물의 그라데이션 노출 네이티브 3D stromal 종양 상호 복제 하 문화 매트릭스 단백질 (ECM)3,4. 따라서, 2D 조직 문화 모델에 비해 3D 암 모델 잠재적인 종양 microenvironment 시뮬레이션에 더 나은 표시를 등장 하 고 중요 한 도구를 역임 vivo에서 종양 특성, hypoxia, 등 이해 desmoplasia, 휴면, 마약 penetrance, 독성 및 치료 저항5,6. 이 위해 3D 모델 빠른 생성 및 일관성에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 최적화 하면서 종양 기능 vivo에서 을 흉내 낸에 의해 2 차원 세포 배양 및 전체 동물 모델 사이의 격차를 해소 하는 가능성이 있다. 이러한 장점은 암 생물학, morphogenesis와 조직7,8공학 등 많은 분야에서 번역 상 연구를 가속 화 하기 위해 악용 되 고 있습니다.
서 진화 하는 3 차원 조직 배양 방법을의 지, 자기 부상 기술을 최근 개발 되었고 성장에 대 한 설명, 다양 한 세포 유형9,10, 에서 파생 된 시 금 및 spheroids의 이미징 11 , 12. 자기 3D bioprinting 이용 생체 나노 입자를 세포 자화 및 멀티 잘 포맷에서 그들을 인쇄 하 여 조직 하 자기 세력의 사용. 일관성, 무력화 하 고 생화학 및 생물 조사10다운스트림 응용 프로그램의 과다에 대 한 고용 수 있는 동일한 3D spheroids 근처의 급속 한 생산 수 있습니다. 여기 우리는 산화 철, 폴 리 L-리 신 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포를 금 나노 입자의 구성 이라고 Nanoshuttle (NS) 생체 재료를 사용 하 여 자석 bioprinting 기술을 적응 했습니다. 원형질 막에 정전 NS 부착은 어떤 특정 한 수용 체, 바인딩할 알려져 있지 하 고 셀에서 출시 1 주일 이내 표면. 그것은 매우 낮은 자기 세력 (30pN) 필요, 충분히 집계 하지만 하지 해 세포와 세포 생존 능력, 신진 대사 또는 3D 문화10,13,14 매우 생체 수 있도록 확산에 영향을 미치지 않습니다. ,15.
이 연구에서는 생성 및 3D 암 세포 섬유 아 세포 spheroids의 대사 분석 결과 설명 예제 및 모델, 췌장암을 사용 하 여. 2D 선박에 경작 하는 세포에서 시작, 우리 자석 bioprinting를 사용 하 여 췌 장 종양-섬유 공동 문화 spheroids의 문화 및 성장 조건을 보여 줍니다. 교양된 spheroids는 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험에 사용 했다, 두 개의 주요 에너지 생산 경로, 분해 및 다양 한 라이브에서 미토 콘 드리 아 호흡 동시에 측정 하는 기술 시연 세포와 조직16,17,18,,1920. 분해 측정 했다 extracellular 산성화 속도 (ECAR) 변경으로 미토 콘 드리 아 호흡 또는 산화 인 산화 측정 되었다 하는 동안 산소 소비 속도 (OCR)으로. 우리는 췌 장 종양 spheroids에 대 한 개발이 방법 최적화 및 3D 종양 회전 타원 체 세대와 다른 세포/조직 유형 분석 결과 번역 백본으로 사용할 수 있습니다 제안 합니다.

<table style="border-collapse:collapse;width:646pt" width="861">
	<colgroup>
		<col style="width:186pt" width="248" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:230pt" width="307" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td class="xl22" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl34" style="width:89pt" width="119">25300-054</td>
			<td class="xl35" style="width:230pt" width="307"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:186pt;height:31.5pt" width="248">96 well cell repellant plate</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">USA Scientific/ Griener Bio-One</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655970</td>
			<td class="xl21">spheroid growth plate</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Cellometry Cell counting slides</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nexcelom&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">CHT4-SD100-002</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl19" height="20" style="width:186pt;height:15.0pt" width="248">D-Glucose</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">D9434</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl19" height="20" style="width:186pt;height:15.0pt" width="248">DPBS</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Gibco</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">14190-144</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">103020-100</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">L-Glutamine</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">59202C</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">103015-100</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">n3D Magnetic Spheroid drive</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:186pt;height:31.5pt" width="248">n3D Magnetic Spheroid holding drive</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">n3D NanoShuttle-PL&#160;</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit:&#160; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Patu8902 cells</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Laboratory Stock</td>
			<td class="xl19" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">pancreatic ductal adenocarcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">PS1 cells</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Laboratory Stock</td>
			<td class="xl19" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">activated pancreatic stellate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">RPMI1640</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Gibco</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">11875-093</td>
			<td class="xl21">growth media for cells, spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="45" style="height:33.75pt">
			<td class="xl19" height="45" style="width:186pt;height:33.75pt" width="248">SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">extracellular flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Sodium Pyruvate</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">S8636</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td class="xl19" height="24" style="width:186pt;height:18.0pt" width="248">XF Base media</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">102365-100</td>
			<td class="xl21">base media for metabolic assays on XFe96</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts

췌 장의 암 등 많은 암 종류, 조밀한 거리 기질 종양 진행에 침공 한 중요 한 역할을 했습니다. 활성화 된 암 관련 된 섬유 아 세포 종양 기질 암 세포와 상호 작용 하 고 그들의 성장 및 생존 지원의 핵심 구성 요소입니다. 암 세포의 상호 작용을 정리 하 고 섬유 아 세포를 활성화 하는 모델은 stromal 생물학을 공부 하 고 antitumor 에이전트의 개발을 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 췌장암 세포와 활성화 된 췌 장 fibroblasts 이후의 생물학 연구를 위해 사용할 수 있는 강력한 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 급속 한 세대에 대 한 메서드를 설명 합니다. 또한, 설명 이다 세포 생체 경로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 프로브를 기능 대사 분석 수행에 3D spheroids의 사용와 결합 회전 타원 체 미 판. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 된 췌 장 섬유 세포 (PS1) 공동 경작 했다 생체 나노 어셈블리를 사용 하 여 자기. 자성된 셀 bioprinted spheroids 문화의 5-7 일 이내 400-600 µ m 사이 직경을 가진 생성 하 성장 매체에서 96 잘 형식에서 마그네틱 드라이브를 사용 하 여 빠르게 했다. Patu8902-PS1 spheroids를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험 다음 세포 에너지 경로 조사 하는 세포 외 유출 기술을 사용 하 여 실행 되었다. 방법은 여기 간단, 암 세포 섬유 회전 타원 체 공동 문화의 일관 된 세대 수 이며 잠재적으로 다른 암 세포 유형 현재 기술된 방법론의 최적화에 따라 적용할 수 있습니다.

마그네틱 bioprinting 및 3D spheroids의 세포 외 유출 분석에 대 한 일반적인 워크플로 
그림 1 이 프로토콜에서 설명 하는 전체 프로세스에 대 한 개요를 보여 줍니다. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 방사상 세포 (PS1) 70-80%의 confluency에 적절 한 성장 매체를 포함 하는 조직 배양 플라스 크에서 경작 했다. 셀 2D 문화 용기에서 분리 했다 세척, 셀 밀도 결정 했다 그리고 마지막으로 1 × 106 셀/mL에 성장 매체에 resuspended 세포. NS, 금, 철 산화물, 그리고 폴 리-L-리 신으로 구성 된 나노 입자 어셈블리 끌다 셀에 사용 되었다. 개별적으로 자성된 Patu8902와 PS1 셀 혼합 그리고 자석 회전 타원 체 드라이브에 장착 된 96 잘 셀 구 충 제 성장 판에 인쇄 된 했다. 우리는 시드 단일 잘 (5000 Patu8902 셀 단일 회전 타원 체를 생성 하는 10000 PS1 세포와 혼합)를 위한 세포의 총 수를 15000을 최적화 했습니다. 어느 시간 동안 이러한 spheroids의 성장 했다 모니터링 하 고 기록 5-7 일에 대 한 적절 한 조직 배양 조건에서 부 화 후 3 차원 spheroids 획득 했다. 씻은 후 분석 결과 미디어와 함께, spheroids 분해 및 미토 콘 드리 아 호흡의 동시 측정을 위한 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 신진 대사 분석을 수행 하는 회전 타원 체 microplate에 물리적으로 옮겨 졌다.
문화 및 췌 장 종양-섬유 아 세포 spheroids의 성장 기능 및 강력한 spheroids를 하려면 상피 암 세포 Patu8902를 라인을 PS1 보충 소 태아 혈 청 RPMI 1640에 교양 있었다 방사상 세포를 활성화 합니다. Pat8902와 PS1 셀 NS와 자기 했다 다음 함께 혼합 1: 2의 비율에 성장 격판덮개에 잘 당 15, 000 셀의 총 씨 만큼. 마그네틱 드라이브에 셀 인쇄의 24 시간 이내 셀 focalized 우물의 센터에 각 잘 아래 각 자석 핀 위에 정확 하 게. Patu8902-PS1 spheroids의 성장 일 2, 4, 7 및 9 셀을 뿌리기 후에 영상 모니터링 했다. 그림 2 는 다양 한 시간 점에서 위의 대표 spheroids의 평균 직경의 정량화를 보여준다. Spheroids의 직경 7 일에 596 µ m 2 게시물 인쇄 당일 414 µ m에서 증가 합니다. 9, 7 일에 성장 사이의 큰 차이 고 따라서 모든 더 실험 제한 되었다 회전 타원 체 성장의 7 일. 우리는 spheroids 취득 외부 가장자리의 주위에 특히 선명 형태학 및 NS 점차적으로 더 균등 하 게 확산 되는 회전 타원 체의 볼륨에 걸쳐 문화에 더 많은 일을 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 그들의 축과 단축의 길이에 따라 10 spheroids의 구형 추정. 평균 구형 0.92 ± 0.04 Patu8902 혼자 (종양), PS1 (실질) 혼자와 0.94 ± 0.02 공동 문화 spheroids에 대 한 0.95 ± 0.04 이다.
를 사용 하 여 췌 장 3D spheroids의 기능 변화 분석 결과 세포 외 유출 분석기 spheroids의 기능을 테스트 하려면 우리 고용 대사 및 생체 분석 조사 spheroids에 에너지 경로. 우리 spheroids 위에서 설명한 교양에 분해 스트레스 테스트 실시. 이 위해, spheroids 공동 문화는 두 종류의 세포에서 인 뿐만 아니라 Patu8902 또는 PS1 세포에서 생성 된 분석 결과를 받게 했다. 흥미롭게도, 모든 세 가지 유형의 spheroids, 개별 또는 혼합 세포에서 발생 하는 여부 GST 분석 결과에 대 한 생물학 기능 응답 전시. Saturating 포도 당 농도, 주입 시 spheroids 유형 테스트 쇼 증가 glycolytic 통로에 ECAR (그림 3)에 있는 증가 의해 입증. Oligomycin를 사용 하 여 미토 콘 드리 아의 ATP 생산은 저해 하는 경우 에너지 생산 분해를 그리고 증가 ECAR에 볼 최대한 glycolytic 용량 셀을 밀어. 2-DG, 경쟁적으로 포도 당 hexokinase glycolytic 활동으로 인해 ECAR 이전 증가 했다는 ECAR 감소 귀착되는 포도 당 아날로그를 사용 하 여 분해 억제 우리는 PS1 혼자 spheroids (평균 직경 250 µ m)으로 인해 그들의 작은 크기와 낮은 glycolytic 용량 Patu8902 암에 비해 상대적으로 낮은 신호 했다 비록이 연구에서 테스트 spheroids이이 패션에 응답 발견 셀 (평균 직경 600 µ m)입니다. 일반적으로, 더 높은 ECAR 신호 파생 된 종양 세포에서 spheroids에서 상대적으로 작은 PS1 구와 그에 비해 파생 spheroids, 가능 하 게 분해22로 암 세포의 고유의 대사 성향에 표시 될 수 있습니다. 23. 비록 우리가 발견 하는 각 형식, PS1 혼자 spheroids 작은, 되 고 중 회전 타원 체 크기 변화 다음 공동 문화 spheroids, 모든 세 가지 유형의 spheroids 셀의 동일한 수를 뿌리기에서 파생 되었다 Patu8902 혼자 spheroids 되는 가장 큰.
3D spheroids에서 미토 콘 드리 아 기능을 테스트 하려면 우리 MST 분석 결과 공동 문화 spheroids 대상이. MST 셀 (그림 4A 와 4B)의 OCR를 직접 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능의 주요 매개 변수를 측정 합니다. 화합물 (oligomycin, FCCP, 그리고로 테 논 및 antimycin A의 혼합)와 직렬 주입 키 미토 콘 드리 아 등의 매개 변수, ATP 생산, 최대한 호흡, 비-미토 콘 드리 아 호흡을 측정 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 및 기초 호흡 속도 더 양성자 누출 및 예비 호흡기 용량 (그림 4C)을 계산 하기 위해 사용 되었다. 응답 oligomycin으로 OCR에 감소, ATP synthase (복잡 한 V)의 억제제 셀룰러 ATP 생산과 관련 된 미토 콘 드리 아 호흡에 연관 시킵니다. Spheroids는 oligomycin 최대한 침투 및 효율적인 응답 시간을 허용 하는 긴 기간에 대 한와 함께 알을 품을 했다. FCCP uncoupler와 함께 두 번째 주입 극대 산소 소비와 OCR 증가 자극. FCCP 자극 OCR 예비 호흡기 용량, 증가 에너지 수요에 대응 하는 세포의 능력의 측정을 계산 하는 데 사용 되었습니다. 3 주입; 로 테 논, 혼합 한 (복잡 한 나 억제제), 및 antimycin A (복잡 한 III 억제제) 차단 OCR (그림 4B 의 날카로운 감소도 미토 콘 드리 아 호흡옹 >).
전반적으로, 우리의 관측 위에서 설명한 대로 그들의 신진 대사 발자국/활동 모두 glycolytic 및 미토 콘 드리 아 잠재력 측면에서 측정으로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 경작된 spheroids의 기능을 확인 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
그림 1 . 문화와 췌장암 세포/섬유 spheroids의 분석 결과 대 한 방법론의 도식 대표. Patu8902 및 PS1cells 교양, trypsinized, 세척 되었고 계산. 시드의 각 회전 타원 체, Patu8902 (5, 000 셀/잘)와 PS1 섬유 아 세포 (10, 000 셀/잘) NS를 사용 하 고 하루에 1 셀 구 충 제 성장 플레이트에 인쇄 된 자력을 띠게 했다. 시드, 후 성장 플레이트 (96 잘 포맷 성장 플레이트의 각 우물에서 하나의 자석)와 자기 회전 타원 체 드라이브에 탑재 되었고 3D spheroids를 2-7 일에 대 한 문화 수 있습니다. 결과 spheroids 세척 되었고 세포 외 유출 악기에 대사 분석을 수행 하는 회전 타원 체 분석 결과 microplates로 전송. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
그림 2 . 췌 장 종양-섬유 아 세포 spheroids의 성장. (Patu8902-PS1 공동 문화 문화 날에 해당 회전 타원 체의 대표 이미지 A)를 상단에 표시 되 고 회전 타원 체 (µ m)의 직경에 크기 아래 계량. 회전 타원 체 크기와 볼륨에 걸쳐 NS 입자 (검은 점)의 보급에 있는 진보적인 증가 2 그리고 7 일 사이 분명 하다. Spheroids는 회전 타원 체 직경에 상당한 증가 초래 하지 않았다이 후, 추가 2 일 문화에 유지 했다. (종양 세포 (Patu8902), 기질 세포 (PS1)와 공동 배양된 세포 (Patu8902 + PS1)에서 파생 된 spheroids의 B) 대표적인 사진은 표시 됩니다. (C) 구형 데이터는 각 그룹에서 10 개인 spheroids에서 묘사 된다. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
그림 3 . 분해 스트레스 테스트 (GST) 췌 장 spheroids. (다양 한 분석 결과 매개 변수 묘사는 전형적인 glycolytic 함수 분석 결과의 A) 도식 표현입니다. (B) GST 테스트의 예 췌 장 spheroids 설명 된 방법론을 사용 하 여 양식에서 수행. 포도 당 주입 분해 ECAR, 미토 콘 드리 아 호흡을 차단 하는 oligomycin의 추가에 더 증가 함께 증가로 볼 최대 경사로. ECAR 분해를 차단 하 여 2-dg, 포도 당의 경쟁력 있는 아날로그 응답에 빠진다. 모든 spheroids는 GST 분석 결과에 대 한 기능 응답을 전시 설명 되어 있습니다. (GST 분석 결과의 세 가지 주요 매개 변수를 묘사 하는 제조업체의 보고서 생성기를 사용 하 여 GST 분석 결과의 C)는 출력. 오차 막대를 나타냅니다 표준 오차 (SEM)의. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
그림 4. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 (MST)와 Patu8902 PS1 spheroids. (다양 한 분석 결과 매개 변수는 전형적인 미토 콘 드 리아 기능 분석 결과의 A) 회로도 표현을 묘사 된다. (B) 췌 장 종양-섬유 spheroids에 MST의 예가 표시 됩니다. (C) 공동 문화 3D spheroids MST 분석 결과에 대 한 기능 응답을 전시 한다. 예상 했던 대로, OCR 하락으로 측정 하는 미토 콘 드 리아 기능 spheroids oligomycin, ATP synthase 억제제와 함께 도전 하는 때 주의 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여의 저해 시 즉시 축소 최대한 OCR 결과 FCCP 전자 흐름을 램프를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 복잡 한 억제제의-칵테일. 오차 막대를 나타냅니다 표준 오차 (SEM)의. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

preparation-metabolic-assay-3-dimensional-spheroid-co-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.1K 조회수.  Translational Genomics Research Institute. 여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

연구

암 연구학

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant behavior and high resistance to therapeutic treatments. Indeed, despite many efforts, both standard chemotherapy and innovative target therapies have substantially failed when moved from preclinical evaluation to the clinical setting. In this scenario, the development of preclinical mouse models better mimicking in vivo characteristics of PCa is urgently needed to test newly developed drugs. The present protocol describes a method to generate a mouse model of PCa, represented by an orthotopic xenograft obtained by ultrasound-guided injection of human pancreatic tumor cells. Using such a reliable and minimally invasive protocol, we also provide evidence of in vivo engraftment and development of tumor masses, which can be monitored by ultrasound (US) imaging. A noteworthy aspect of the PCa model described here is the slow development of the tumor masses over time, which allows precise identification of the starting point for pharmacological treatments and better monitoring of the effects of therapeutic interventions. Moreover, the technique described here is an example of implementation of the 3Rs principles since it minimizes pain and suffering and directly improves the welfare of animals in research.

We present a protocol to generate a minimally invasive orthotopic pancreatic cancer model by ultrasound-guided injection of human pancreatic cancer cells and the subsequent monitoring of tumor growth in vivo by ultrasound imaging.

초음파 유도 주사에 의한 췌장암 세포의 동종 이종이의 생성

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...