Este protocolo permite a reconstrução 3D de organelas de forma simples e robusta, ao mesmo tempo em que é acessível a laboratórios que atualmente não possuem microscópios eletrônicos de volume especializado. Esta técnica é extremamente flexível, fornecendo excelente resolução X/Y, ao mesmo tempo em que pode re-imagem amostras, se necessário. Também é compatível com tomografia de inclinação quando é necessária uma resolução Z muito alta.
Esta técnica permite interrogatórios de morfologia organela no contexto inter organela. Portanto, pode ser estendido para examinar quaisquer condições patológicas com defeitos organelas. Essa abordagem pode fornecer informações sobre interações organelas e eventos de tráfico celular.
Esse método também pode ser aplicado a outros tecidos, modelos organoides e sistemas de cultura celular, além de hepatócitos. Os usuários iniciantes podem encontrar seção serial e pegar desafiador sem perdas. Recomenda-se ser proficiente em seção ultrafina regular antes de aplicar este protocolo a uma amostra preciosa.
Comece aparando cuidadosamente o tecido embutido em resina usando uma lâmina de barbear com a amostra presa no adaptador de corte. Transfira a arca do espécime juntamente com o mandril e a amostra para o braço do espécime do microtome e posicione a arca do espécime para que o alcance de viagem da arca funcione de cima para baixo. Coloque e tranque a faca de diamante no suporte da faca, garantindo que o ângulo de corte da faca esteja definido adequadamente.
Tranque o porta-faca no palco com segurança. Desligue o palco, ligue o palco iluminado, mova cautelosamente a faca em direção ao espécime, ajustando continuamente o ângulo lateral da faca, inclinação do espécime e rotação do espécime, ajustando os botões relevantes até que a face do bloco esteja alinhada à borda da faca. Coloque a parte superior e inferior da janela de corte do braço do espécime e deixe o espécime logo abaixo da borda da faca.
Encha o barco da faca com água limpa e dupla destilada e certifique-se de que a superfície da água esteja nivelada com a borda da faca e ligeiramente côncava. Então, comece a cortar seções. Pare o corte logo após a amostra ter passado a ponta da faca.
Use uma grade de ranhura vazia para estimar o número de seções para coletar em cada grade. Usando um cílio em cada mão, quebre suavemente a fita em fitas menores que podem caber no comprimento da grade de ranhura. Anote mentalmente suas posições relativas dentro da amostra.
Usando uma haste aplicadora de vidro, passe uma gota de clorofórmio sobre as seções para achatá-las. Pegue a primeira grade de ranhura vazia com as primeiras fórceps numeradas e mergulhe-a suavemente no Triton X-100 e, em seguida, duas vezes na água destilada. Use um pedaço de papel filtro para remover o excesso de água da borda das fórceps.
Usando fórceps, abaixe suavemente aproximadamente 2/3 da grade de fenda revestida de formvar na água do barco da faca. Certifique-se de que o lado formvar está voltado para baixo e a longa borda direita da fenda está na superfície da água e paralela à borda da água. Puxe suavemente a grade na água em direção às fitas de modo que, após o curso de retorno, as seções derivam em direção à grade.
Continue a fazer isso em wafts cada vez menores, até que a borda direita da fita se a linha com a borda direita do slot. Em seguida, com o último waft, leve suavemente a grade para pegar as seções até a grade de ranhura. Coloque várias pelotas de hidróxido de sódio sob uma tampa de placa de Petri para fornecer um ambiente livre de dióxido de carbono.
Em seguida, cuidadosamente pipeta 40-microliter gotas do citrato de chumbo de Reynold no parafilme, uma gota para cada grade. Inverta cada grade na queda do citrato de chumbo e deixe protegido pela tampa da placa de Petri por 7 a 10 minutos. Enquanto as grades estão manchando, coloque cinco gotas de aproximadamente 300 microliter de água destilada para cada rede no parafilme.
No final da incubação do citrato de chumbo, transfira cada rede para uma gota de água destilada para lavar por um minuto sem respirar diretamente nas grades. Repita isso mais quatro vezes. Use fórceps cruzados numerados para pegar a primeira grade.
Toque na borda da grade para filtrar o papel para afastar a maior parte da água e deixe secar nos fórceps por pelo menos 20 minutos. Repita isso para cada grade. Em baixa ampliação, observe a ordem, localização e posição das seções seriais.
Navegue até a parte central da série na grade. Navegue pela amostra e identifique uma região de interesse. Em seguida, observe a amostra na ampliação desejada.
Considere coletar a série em uma ampliação ligeiramente menor, pois as seções muitas vezes não estão perfeitamente alinhadas, e as imagens podem precisar ser cortadas mais tarde. Em seguida, tire imagens de referência em ampliações mais baixas. Isso ajudará a apreciar o contexto da região de interesse, é uma localização áspera em diferentes ampliações em relação aos limites da seção e características de referência dentro da amostra.
Use-os para sinalizar a região de interesse em outras seções. Para fazer referências na tela, use massa adesiva reutilizável, adesivos ou um pedaço de papel do projetor aéreo colado na tela para colocar marcadores temporários na tela. Isso permitirá a reimaginação rotineira das mesmas características da região de interesse no centro da imagem ao longo do conjunto de dados.
Abra a pilha de imagens, especifique as medidas do voxel e selecione a guia Segmentação para iniciar a segmentação. Clique em Novo no painel do editor de segmentação para definir novos objetos na lista de materiais. Clique com o botão direito do mouse para alterar a cor do objeto e clique duas vezes para renomear o objeto.
Para segmentação manual, escolha a ferramenta de segmentação abaixo da lista de materiais e selecione a ferramenta de pincel padrão para destacar os pixels. A imagem de microscopia eletrônica de dois hepatócitos opostos é mostrada aqui. Imagens de ampliação mais elevadas permitem a observação dos detalhes morfológicos das diferentes organelas com resolução de nanômetros.
A imagem representativa mostra a versão segmentada do mesmo tomograma, traço do ritúlume endoplasmático, mitocôndrias e os contatos intermembranos entre o ER e as mitocôndrias de diferentes espaços são mostrados aqui. A imagem representativa mostra uma orto-fatia inclinada sobreposta com traços de segmentação e sua posição relativa dentro de toda a mitocôndria. A reconstrução 3D das organelas segmentadas e os contatos endoplasmáticos de órticia-mitocôndrias em diferentes ângulos são mostrados aqui.
Como este protocolo é compatível com a tomografia de inclinação quando é necessária uma resolução Z muito alta, ajuda a resolver estruturas pequenas ou complicadas. Esta técnica é perfeita para a avaliação inicial da relação espacial entre diferentes organelas e, portanto, particularmente útil no campo de progresso dos contatos de membrana na homeostase da membrana.
