Name: visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

Este trabalho foi financiado em parte pela subvenção R01DK100237 para RAW e o não nacional ciência Fundação pós-graduação Research Fellowship. DGE-1313583 para A.N.M. Agradecemos também a faculdade de ciência graduação pesquisa Fellowship programa de verão para suporte para Magal Gostaríamos de agradecer o centro Zebrafish pesquisa na Universidade de Notre Dame para seus cuidados dedicado de nosso zebrafish. Também gostaríamos de agradecer o departamento de ciências biológicas, bem como os membros do nosso laboratório para todos de apoio e informações valiosas.

O seguinte protocolo usa adultos zebrafish mantido e cuidadas pelo centro para a pesquisa de Zebrafish na Universidade de Notre Dame. Todos os métodos para trabalhar com embriões e zebrafish adultos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.
1. o embrião fixação
<ol><li>Colete embriões zebrafish usando métodos anteriormente descritos39,40. Em 24 hpf, adicionar 500 µ l de solução de mistura de protease específico (50 mg/mL) para a E3 em um embrião prato incubar à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Uma vez que os embriões começam a fugir do cório, remova todo o líquido do prato embrião.</li>
	<li>Lave os embriões 2 - 3 vezes com E3 fresco adicionando cerca de 20 mL de E3, agitando suavemente o E3 no prato, e então, decantando o líquido para um recipiente de resíduos líquido.</li>
	<li>Para abater os embriões antes de corrigir, adicione 2 mL de metanosulfonato de 0,2% para o E3.</li>
	<li>Transferi os embriões em um frasco de vidro de 5 mL usando uma pipeta Pasteur de plástico. Remova a maioria da solução tricaina/E3 usando a pipeta, depois que os embriões se instalaram no fundo do frasco.</li>
	<li>Correção 24 embriões hpf com 5 mL de paraformaldeído 4% (PFA) para 2-4 h em RT, sem agitação. Cuidado: PFA é tóxico e soluções PFA devem ser tratadas sob uma capa de química enquanto o pesquisador está vestindo um jaleco, luvas e óculos de proteção. Preparação do fixador PFA do pó granulado de PFA deve ser executada com cuidados excepcionais, como o PFA granulado tende a se dispersar através de carga estática. Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C. Preparar 4% PFA por aquecimento de 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para ferver, agitando continuamente a solução para dissolver completamente o PFA granulado. Uma vez que a solução tenha arrefecido até RT, os 4% PFA é filtro esterilizado por passagem através de um sistema descartável de 0,45 µm para filtragem do vácuo, então e aliquotadas em porções de 15 mL ou 50 mL de armazenamento-20 ° c.</li>
	<li>Remova os 4% PFA e embriões de lavar duas vezes com 1 tamponada de fosfato X salina com 0.1% Tween-20 (PBST) no RT. lavar os embriões uma vez com 5 mL de 100% de metanol (MeOH) no RT. adicionar 5 mL de fresco 100% MeOH para os embriões e incubar a-20 º C pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem ser armazenados em 100% MeOH a-20 ° C até que esteja pronto para a preparação do embrião.</li>
</ol>2. hibridação e preparação do embrião
<ol><li>Hidratar os embriões por lavar uma vez em 5 mL de 50% MeOH em 1 x PBST durante 5 min à reidratação RT. Continue lavando os embriões em 5 mL de 30% MeOH em 1 x PBST por 5 min em RT. lavar os embriões em 5 mL de 1 x PBST duas vezes por 5 min à RT.</li>
	<li>Permeabilize os embriões incubando-os em 5 mL de uma solução de 1:1,000 de proteinase K (pK) (10 mg/mL) em 1 x PBST por 2 min em RT Nota: Os embriões mais velhos podem ser incubados mais do que 2 min na concentração pK acima referida, no entanto, uma concentração de 5 mg/mL e incubação tempo menos de 2 min é sugerido para embriões mais jovens do que 24 hpf.</li>
	<li>Remover pK solução e lave imediatamente em 5 mL de 1x PBST duas vezes em RT. fixar os embriões em 5 mL de 4% PFA em RT pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o PFA e lavar duas vezes em 5 mL de 1 x PBST em RT</li>
	<li>Transferência de embriões em 5 mL de 1 x PBST para tubos de fundo plano microcentrifuga colocados em pé em um rack de microcentrifuga em RT para facilitar interações entre cada embrião e a solução de hibridação subsequentes.</li>
	<li>Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de solução de hibridação (Hyb +) em RT. adicionar 1,5 mL de fresco Hyb + e incubar embriões a 70 ° C em um forno de hibridização para 4-6 h.</li>
	<li>Substituir a 1,5 mL de Hyb + com um volume de solução de sonda (10 µ l do RNA sonda/500 µ l Hyb +) suficiente para cobrir completamente os embriões. Nota: Sintetiza antisentido sonda RNA usando anteriormente descritos métodos39.</li>
	<li>Cruzar a sonda durante a noite em estufa a 70 ° C hibridação com a verticalidade de tubos individuais posicionados no rack microcentrifuga, sem tremer.</li>
</ol>3. hot lavagens e bloqueio
Nota: Lava quente é executadas, colocando a solução adequada sobre os embriões e então incubar em estufa a 70 ° C. hibridação Para manter as soluções de lavagem a 70 ° C, coloque os tubos de 50 mL de cada solução no forno hibridação quando a sonda / Hyb + mistura é adicionada.
<ol><li>Retire a sonda. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 50% formamida/2x buffer de solução salina-citrato de sódio (SSC) para 20-30 min cada. Nota: A sonda pode ser armazenada Hyb + a-20 ° C e re-utilizada em uma data posterior.</li>
	<li>Lave os embriões, uma vez, a 70 ° C em 1,5 mL de 2 x SSC de 15 min. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 0,2 X SSC para 20-30 min cada. Substitua 0.2 x SSC com 1,5 mL de reagente de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: É possível incubar bloqueio reagente em RT para 4 h em vez de durante a noite.</li>
</ol>4. anticorpo incubação e lavagens tampão de ácido maleico
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Substituir o reagente de bloqueio com 0,2 mL de anti-DIG-POD em bloqueio reagente na proporção de 1:1,000 e incubar durante 3 h sob a folha ou outra cobertura de bloqueio de luz no RT Nota: Como alternativa, o anticorpo pode incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Após 3h, lave os embriões em 1,5 mL de tampão de ácido maleico, 2 - 4 vezes por 10-15 min cada em RT. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C em 1,5 mL de tampão de fresco ácido maleico. Nota: Não é necessário incubar durante uma noite em tampão de ácido maleico, mas fazendo assim diminui a sonda fundo.</li>
</ol>5. sonda deteção e remoção de Peroxidase
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Retire o tampão de ácido maleico e substitua com 1,5 mL de 1X PBS. Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de 1X PBS durante 5 min cada à RT. Incubar embriões em 0,2 mL de Cy3 fluorescente coloração solução por 60 min em RT Nota: O tempo de incubação pode variar para diferentes sondas.</li>
	<li>Lave os embriões uma vez com 1,5 mL da seguinte porcentagem MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.</li>
	<li>Incubar os embriões com 1,5 mL de 1% H2O2 em MeOH por 30 min em RT. Wash os embriões uma vez com 1,5 mL das seguintes soluções MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lave os embriões duas vezes por 5 min cada a RT em 1,5 mL de 1X PBS. Nota: Os embriões podem ser armazenados em PBS durante a noite a 4° C.</li>
</ol>6. imunofluorescência
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Lave os embriões em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões em 1,5 mL de acetona pre-refrigerada (mantida a-20 ° C) para 7 min em RT. lavar os embriões, uma vez em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões, uma vez em 1.5 mL de 1 x PBST com 1% DMSO (PBDT) durante 5 min à RT</li>
	<li>Incube os embriões em 1,5 mL de PBDT + 10% de soro fetal bovino (FBS) sobre um roqueiro em RT para 2h.</li>
	<li>Remover PBDT + FBS e substituir com 1,5 mL de anticorpos primários, antiacetilado tubulina (produzido a partir do mouse) e anti-γ-tubulina (produzido a partir de coelho), diluída-se juntos em 1: 400 em PBDT + 1% FBS. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C. Nota: Tempos de incubação podem variar dependendo do anticorpo primário. Teste de intervalos de tempo diferentes pode ser necessário para otimizar a rotulagem.</li>
</ol>7. secundário anticorpo
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Para remover o excesso anticorpo desacoplado de embriões, lavar em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 1 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lave os embriões 5 vezes em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 30 min em uma cadeira de balanço em RT. lava os embriões em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS por 30 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C, em 200 µ l dos anticorpos secundários, Alexa 488 cabra anti-rato IgG e Alexa 647 cabra anti-IgG de coelho, diluída juntos em PBDT no 1: 500.</li>
</ol>8. DAPI coloração
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Lave os embriões rapidamente a RT em 1,5 mL de PBDT duas vezes. Substituir PBDT com 1,5 mL de DAPI, dilui-se 1:15000 em 1 X de PBST e incubar 15 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lave os embriões em 1,5 mL de PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl três vezes em RT para 15-20 min cada. Armazenar os embriões em 1,5 mL de PBDT a 4 ° C até que esteja pronto para montagem e imagem.</li>
</ol>9. montagem e imagens para Pronephros de Zebrafish
<ol><li>Lateral do embrião leigos na lâmina de vidro em um pequeno volume, cerca de 10 µ l, de PBDT.</li>
	<li>Esprema o embrião atrás dos olhos com um par de pinças bem para remover a cabeça e alguns da esfera de gema.</li>
	<li>Use a pinça fina para raspar suavemente a bola gema restante do corpo do embrião. Retire a gema dissociada e líquido extra do slide com um tecido fino.</li>
	<li>Adicionar uma gota de mídia para a restante de cauda do embrião de montagem e posicione de modo que a cauda é colocada lateralmente. Coloque uma lamela em cima da cauda para achatar a amostra e, em seguida, coloque em uma caixa de slides coberto.</li>
	<li>Cílios de rim na ampliação de X 60 em um microscópio confocal, usando os seguintes canais de imagem: DAPI em azul (conjunto no 408.0 a laser nm), FITC em verde (conjunto no 488.0 a laser nm), Cy3 tingir-etiquetados em vermelho (laser conjunto no 561.0 nm) e Alexa 680 em branco (conjunto no 637.0 a laser nm).</li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cilia+in+zebrafish.">Imaging cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).</li><li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3.">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060 (2013).</li><li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish.">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li><li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo detalhado acima é otimizado para a rotulagem MCCs na pronephros com transcrições de odf3b e α-tubulina em 24 embriões de zebrafish hpf. Para os melhores resultados, é recomendável usar embriões recém fixos e preparados. Os embriões que foram fixados e armazenados em MeOH ou Hyb + a-20 ° C por mais de uma semana podem ser usados, mas a probabilidade de fundo indesejado coloração aumenta com o tempo que os embriões são mantidos no armazenamento.
Modificações e solução de problemas desta técnica são necessários para adaptar esse método para outros conjuntos de marcadores particulares, por exemplo, outros riboprobes antisentido e outros anticorpos. Muitos métodos para ajustar os parâmetros das etapas no processo de hibridação de toda montagem in situ têm sido documentadas anteriormente pelo nosso grupo e outros31,34,36,38, 39. Da mesma forma, cada anticorpo da proteína vai exigir um pouco de solução de problemas em termos de coloração vezes e intervalos aproximados de diluições e tempos de incubação para cada anticorpo primário são melhor estimados pela avaliação de resultados documentados28, 35. para embriões mais jovens do que 24 hpf, tratamento de pK deve ser inferior a 2 min, onde mais de 24 embriões hpf deve ser tratados com pK por mais de 2 min. Além disso, os embriões mais velhos do que 24 hpf deve ser branqueada de pigmento antes do tratamento de pK.
Após a coloração com a solução de coloração fluorescente, é fundamental para remover qualquer mancha remanescente, anticorpo e peroxidases, realizando a série de lavagens de metanol e água oxigenada. As lavagens de PBS imediatamente a seguir são vitais para remover o metanol em excesso de embriões. Importante, antes de prosseguir com os anticorpos se, encontramos que a acetona e água desionizada lavagens fazem os menos propensos a aderir a um outro e/ou os tubos de centrífuga de embriões. Em nossa experiência, anticorpos para fatores de transcrição específicos e outros genes, embora eles podem trabalhar eficientemente borrões ocidentais, não funcionam bem pelo IF o zebrafish. No entanto, proteínas altamente conservadas e abundantes, como α-tubulina e β-catenina, funcionam bem no zebrafish para se16,37.
Com peixes, é possível visualizar os transcritos de RNA de genes que ainda não tem anticorpos específicos no zebrafish. Combinando peixes com se, como demonstrado pelo presente protocolo, localização co de transcritos de RNA e proteína pode ser visto na vivo (Figura 2). A natureza flexível do protocolo permite a rápida resolução de problemas para a visualização de diversas transcrições de RNA e proteínas em diversos tecidos e pontos de tempo. Quando combinado com os traços já respeitados de embriões de peixe-zebra, este protocolo de peixe + se oferece outra ferramenta para explorar a expressão dos genes e proteínas importantes para o Regulamento do caminho do desenvolvimento.

Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um organismo modelo principal para estudar a biologia do desenvolvimento. Os embriões desenvolvem-se fora da mãe e são opticamente transparentes. Além disso, ocorre a formação de órgãos vitais como o olho, rim e cérebro anterior rapidamente, com estruturas formadas por apenas 24h pós fertilização (hpf). Importante, o genoma de zebrafish é altamente conservado com mamíferos1,2,3. Além disso, o zebrafish e órgãos de mamíferos têm anatomia e fisiologia similares. O zebrafish rim embrionário, ou pronephros, demonstra o valor do sistema modelo para examinar a função dos genes durante a nephrogenesis precoce e determinação do destino das populações de células epiteliais conservada do néfron vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. da mesma forma, o embrião de zebrafish tornou-se cada vez mais importante ao analisar a ontogenia dos MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como seu nome sugere, MCCs são células epiteliais, caracterizadas por um conjunto de cílios motile localizado sobre a superfície apical17. No zebrafish, MCCs funcionam no fluxo de fluido em são dispersos em um "sal e pimenta" como a moda em todo o meio de cada néfron do pronephros por 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. embora eles só foram anotados em um punhado de rim humano doença casos,18,19,20,21, MCCs são predominantes em outros tecidos de mamíferos como o cérebro e traqueia22,23,24, que apresenta uma série de desafios para o projeto experimental. Estudos elegantes em vários modelos de vertebrados, incluindo o zebrafish demonstraram uma via conservada do destino do MCC, com o entalhe de sinalização via como inibidor da MCC desenvolvimento12,17,25 ,26,,27. Portanto, o zebrafish pronephros fornece um modelo facilmente acessível para estudar os mecanismos genéticos de MCC desenvolvimento na vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparência e fácil manipulação genética de embriões de zebrafish provaram para ser inestimáveis traços ao estudar as vias genéticas e moleculares que regulam o destino da célula, crescimento do tecido e o desenvolvimento do início embrião1,2 ,3. Como tais, as técnicas tradicionais Visualizar transcrições da proteína e do gene, tais como a hibridação in situ e toda montagem se, tem sido aplicado a e otimizado para o zebrafish16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando protocolos populares para peixe e se, é possível rotular e analisar MCCs na vivo16,28,37,38.

<table><tbody><tr><td>non-specific protease mixture solution</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td><td>Dilute in E3 &lt;strong&gt;without&lt;/strong&gt; methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>E3 solution</td><td></td><td></td><td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td></tr><tr><td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td></tr><tr><td>embryo dishes</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glass vials</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic Pasteur pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&amp;deg;C. Do not refreeze once thawed for use.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>flat bottom microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization solution (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &amp;mu;g/&amp;mu;L heparin; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td></tr><tr><td>blocking reagent solution</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>maleic acid buffer solution</td><td>Sigma</td><td>M0375 and S7653</td><td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 fluorescent staining solution</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td><td>store at 4&amp;deg;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>store an aliquot at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>anti-&amp;gamma;-tubulin anitbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>store bacterial glycerol stock at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>mounting media</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly/Mount</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>confocal microscope and associated software</td><td></td><td></td><td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td></tr><tr><td>rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

Nos últimos anos, o embrião de zebrafish tem emergido como um modelo popular para estudar a biologia do desenvolvimento, devido a características como ex utero desenvolvimento do embrião e transparência óptica. Em particular, o embrião de zebrafish tornou-se um organismo importante estudar organogênese de vertebrados nos rins, bem como desenvolvimento de célula multiciliated (MCC). Para visualizar as MCCs no rim embrionário zebrafish, temos desenvolvido um protocolo combinado de hibridação toda montagem fluorescente em situ (FISH) e montar toda a imunofluorescência (IF) que permite a geração de imagens de alta resolução. Este manuscrito descreve nossa técnica para localização de transcritos de RNA e proteína co como uma ferramenta para entender melhor o Regulamento dos programas de desenvolvimento através da expressão de vários fatores de linhagem.

Zebrafish do selvagem-tipo embriões foram fixados em 24 hpf e imediatamente preparado como descrito acima. Figura 1 mostra um fluxo de trabalho experimental juntamente com fases ilustrados selecionados. O fluxo de trabalho descrito nas etapas 1-8 engloba os processos de aquisição de amostra, fixação e manipulação do tecido fixo para rotular transcrições endógenas com antisentido riboprobes seguido por imunofluorescência para rótulo somáticas de interesse. Etapa 9 do fluxo de trabalho refere-se a montagem imagem e técnicas desenvolvidas especificamente para otimizar a visualização do tronco embrionárias zebrafish. Nos desenhos que acompanham a etapa 9, ilustraremos o método de manipulação para posicionamento do tecido em uma lâmina de vidro. Nesta etapa, a bola de cabeça e gema de embrião são removidos, deixando a cauda deve ser posicionado lateralmente entre uma lâmina de vidro e lamela. Remoção de gema bola de cabeça é sugerida para a melhor imagem da população residente de MCC no pronephros, como a bola de gema autofluorescente e obstruir o processo de montagem.
Obtidos usando um microscópio confocal de imagens representativas são fornecidas na Figura 2, que mostra o mesmo embrião do selvagem-tipo ampliação de 60 X e um zoom digital com a mesma ampliação. Os painéis superiores fornecem imagens de cada canal individual, enquanto os parte inferior dois painéis são a composto sobreposição destes dados de imagem. Caixa branca (na imagem da coluna da esquerda) descreve a área que é o foco do zoom digital (a imagem da coluna da direita). Destaque no painel final do zoom digital, núcleos foram rotulados em DAPI e MCCs foram detectados com base em um riboprobe antisentido projetado para reconhecer odf3b, onde os anticorpos de γ-tubulina denotam os corpos basais e α-tubulina denota os cílios. O zoom digital da sobreposição composto, o círculo amarelo tracejado indica o perímetro de uma MCC, que foi identificada devido a posse de transcrições de odf3b , vários corpos basais e cílios. Célula adjacente mono-ciliadas, marcada com um círculo pontilhado amarelo, foi identificada baseia o fenótipo de possuir um único corpo basal e um único cílio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do fluxograma experimental. Este fluxograma mostra um fluxo de trabalho experimental, acompanhados de ilustrações de estágios críticos em que o floco de neve indica incubação fria, as três linhas curvas representam o calor e o relógio representa tempos de incubação longa. O fluxo de trabalho pode ser executado em um mínimo de 6 dias (número de dias no canto superior direito de cada fase do processo), embora algumas etapas podem ser executadas durante períodos de tempo mais longos, como observado no protocolo. Uma descrição detalhada do processo de montagem é retirada, demonstrando a cauda do embrião montado final entre a lâmina de vidro e lamela. Uma preta caixa tracejada descreve a área que é fotografada na ampliação de X 60. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: representante resultados para poder visualizar MCCs de pronephros o zebrafish. Projeções de imagem máxima de um embrião de zebrafish do selvagem-tipo 24 hpf em 60 X de ampliação, bem como sobre a ampliação de 60 X do embrião mesmo confocal, um zoom digital. As caixas brancas indicam a área voltada para o zoom. Manchas individuais de DAPI (núcleos), odf3b (MCC), γ-tubulina (corpos basais) e α-tubulina (cílios) são etiquetadas e então fundiram-se os painéis de fundo dois. O zoom digital, nós fornecemos aproximações dos locais de célula como segue: um MCC é descrito pelo tracejado círculo amarelo, e o círculo pontilhado amarelo descreve uma célula mono-ciliadas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

8.1K visualizações.  University of Notre Dame. Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neurociência

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biologia do Desenvolvimento

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Química

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Biologia

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...