Este trabalho foi financiado em parte pela subvenção R01DK100237 para RAW e o não nacional ciência Fundação pós-graduação Research Fellowship. DGE-1313583 para A.N.M. Agradecemos também a faculdade de ciência graduação pesquisa Fellowship programa de verão para suporte para Magal Gostaríamos de agradecer o centro Zebrafish pesquisa na Universidade de Notre Dame para seus cuidados dedicado de nosso zebrafish. Também gostaríamos de agradecer o departamento de ciências biológicas, bem como os membros do nosso laboratório para todos de apoio e informações valiosas.

O seguinte protocolo usa adultos zebrafish mantido e cuidadas pelo centro para a pesquisa de Zebrafish na Universidade de Notre Dame. Todos os métodos para trabalhar com embriões e zebrafish adultos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.
1. o embrião fixação
<ol><li>Colete embriões zebrafish usando métodos anteriormente descritos39,40. Em 24 hpf, adicionar 500 µ l de solução de mistura de protease específico (50 mg/mL) para a E3 em um embrião prato incubar à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Uma vez que os embriões começam a fugir do cório, remova todo o líquido do prato embrião.</li>
	<li>Lave os embriões 2 - 3 vezes com E3 fresco adicionando cerca de 20 mL de E3, agitando suavemente o E3 no prato, e então, decantando o líquido para um recipiente de resíduos líquido.</li>
	<li>Para abater os embriões antes de corrigir, adicione 2 mL de metanosulfonato de 0,2% para o E3.</li>
	<li>Transferi os embriões em um frasco de vidro de 5 mL usando uma pipeta Pasteur de plástico. Remova a maioria da solução tricaina/E3 usando a pipeta, depois que os embriões se instalaram no fundo do frasco.</li>
	<li>Correção 24 embriões hpf com 5 mL de paraformaldeído 4% (PFA) para 2-4 h em RT, sem agitação. Cuidado: PFA é tóxico e soluções PFA devem ser tratadas sob uma capa de química enquanto o pesquisador está vestindo um jaleco, luvas e óculos de proteção. Preparação do fixador PFA do pó granulado de PFA deve ser executada com cuidados excepcionais, como o PFA granulado tende a se dispersar através de carga estática. Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C. Preparar 4% PFA por aquecimento de 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para ferver, agitando continuamente a solução para dissolver completamente o PFA granulado. Uma vez que a solução tenha arrefecido até RT, os 4% PFA é filtro esterilizado por passagem através de um sistema descartável de 0,45 µm para filtragem do vácuo, então e aliquotadas em porções de 15 mL ou 50 mL de armazenamento-20 ° c.</li>
	<li>Remova os 4% PFA e embriões de lavar duas vezes com 1 tamponada de fosfato X salina com 0.1% Tween-20 (PBST) no RT. lavar os embriões uma vez com 5 mL de 100% de metanol (MeOH) no RT. adicionar 5 mL de fresco 100% MeOH para os embriões e incubar a-20 º C pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem ser armazenados em 100% MeOH a-20 ° C até que esteja pronto para a preparação do embrião.</li>
</ol>2. hibridação e preparação do embrião
<ol><li>Hidratar os embriões por lavar uma vez em 5 mL de 50% MeOH em 1 x PBST durante 5 min à reidratação RT. Continue lavando os embriões em 5 mL de 30% MeOH em 1 x PBST por 5 min em RT. lavar os embriões em 5 mL de 1 x PBST duas vezes por 5 min à RT.</li>
	<li>Permeabilize os embriões incubando-os em 5 mL de uma solução de 1:1,000 de proteinase K (pK) (10 mg/mL) em 1 x PBST por 2 min em RT Nota: Os embriões mais velhos podem ser incubados mais do que 2 min na concentração pK acima referida, no entanto, uma concentração de 5 mg/mL e incubação tempo menos de 2 min é sugerido para embriões mais jovens do que 24 hpf.</li>
	<li>Remover pK solução e lave imediatamente em 5 mL de 1x PBST duas vezes em RT. fixar os embriões em 5 mL de 4% PFA em RT pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o PFA e lavar duas vezes em 5 mL de 1 x PBST em RT</li>
	<li>Transferência de embriões em 5 mL de 1 x PBST para tubos de fundo plano microcentrifuga colocados em pé em um rack de microcentrifuga em RT para facilitar interações entre cada embrião e a solução de hibridação subsequentes.</li>
	<li>Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de solução de hibridação (Hyb +) em RT. adicionar 1,5 mL de fresco Hyb + e incubar embriões a 70 ° C em um forno de hibridização para 4-6 h.</li>
	<li>Substituir a 1,5 mL de Hyb + com um volume de solução de sonda (10 µ l do RNA sonda/500 µ l Hyb +) suficiente para cobrir completamente os embriões. Nota: Sintetiza antisentido sonda RNA usando anteriormente descritos métodos39.</li>
	<li>Cruzar a sonda durante a noite em estufa a 70 ° C hibridação com a verticalidade de tubos individuais posicionados no rack microcentrifuga, sem tremer.</li>
</ol>3. hot lavagens e bloqueio
Nota: Lava quente é executadas, colocando a solução adequada sobre os embriões e então incubar em estufa a 70 ° C. hibridação Para manter as soluções de lavagem a 70 ° C, coloque os tubos de 50 mL de cada solução no forno hibridação quando a sonda / Hyb + mistura é adicionada.
<ol><li>Retire a sonda. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 50% formamida/2x buffer de solução salina-citrato de sódio (SSC) para 20-30 min cada. Nota: A sonda pode ser armazenada Hyb + a-20 ° C e re-utilizada em uma data posterior.</li>
	<li>Lave os embriões, uma vez, a 70 ° C em 1,5 mL de 2 x SSC de 15 min. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 0,2 X SSC para 20-30 min cada. Substitua 0.2 x SSC com 1,5 mL de reagente de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: É possível incubar bloqueio reagente em RT para 4 h em vez de durante a noite.</li>
</ol>4. anticorpo incubação e lavagens tampão de ácido maleico
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Substituir o reagente de bloqueio com 0,2 mL de anti-DIG-POD em bloqueio reagente na proporção de 1:1,000 e incubar durante 3 h sob a folha ou outra cobertura de bloqueio de luz no RT Nota: Como alternativa, o anticorpo pode incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Após 3h, lave os embriões em 1,5 mL de tampão de ácido maleico, 2 - 4 vezes por 10-15 min cada em RT. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C em 1,5 mL de tampão de fresco ácido maleico. Nota: Não é necessário incubar durante uma noite em tampão de ácido maleico, mas fazendo assim diminui a sonda fundo.</li>
</ol>5. sonda deteção e remoção de Peroxidase
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Retire o tampão de ácido maleico e substitua com 1,5 mL de 1X PBS. Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de 1X PBS durante 5 min cada à RT. Incubar embriões em 0,2 mL de Cy3 fluorescente coloração solução por 60 min em RT Nota: O tempo de incubação pode variar para diferentes sondas.</li>
	<li>Lave os embriões uma vez com 1,5 mL da seguinte porcentagem MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.</li>
	<li>Incubar os embriões com 1,5 mL de 1% H2O2 em MeOH por 30 min em RT. Wash os embriões uma vez com 1,5 mL das seguintes soluções MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lave os embriões duas vezes por 5 min cada a RT em 1,5 mL de 1X PBS. Nota: Os embriões podem ser armazenados em PBS durante a noite a 4° C.</li>
</ol>6. imunofluorescência
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Lave os embriões em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões em 1,5 mL de acetona pre-refrigerada (mantida a-20 ° C) para 7 min em RT. lavar os embriões, uma vez em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões, uma vez em 1.5 mL de 1 x PBST com 1% DMSO (PBDT) durante 5 min à RT</li>
	<li>Incube os embriões em 1,5 mL de PBDT + 10% de soro fetal bovino (FBS) sobre um roqueiro em RT para 2h.</li>
	<li>Remover PBDT + FBS e substituir com 1,5 mL de anticorpos primários, antiacetilado tubulina (produzido a partir do mouse) e anti-γ-tubulina (produzido a partir de coelho), diluída-se juntos em 1: 400 em PBDT + 1% FBS. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C. Nota: Tempos de incubação podem variar dependendo do anticorpo primário. Teste de intervalos de tempo diferentes pode ser necessário para otimizar a rotulagem.</li>
</ol>7. secundário anticorpo
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Para remover o excesso anticorpo desacoplado de embriões, lavar em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 1 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lave os embriões 5 vezes em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 30 min em uma cadeira de balanço em RT. lava os embriões em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS por 30 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C, em 200 µ l dos anticorpos secundários, Alexa 488 cabra anti-rato IgG e Alexa 647 cabra anti-IgG de coelho, diluída juntos em PBDT no 1: 500.</li>
</ol>8. DAPI coloração
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Lave os embriões rapidamente a RT em 1,5 mL de PBDT duas vezes. Substituir PBDT com 1,5 mL de DAPI, dilui-se 1:15000 em 1 X de PBST e incubar 15 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lave os embriões em 1,5 mL de PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl três vezes em RT para 15-20 min cada. Armazenar os embriões em 1,5 mL de PBDT a 4 ° C até que esteja pronto para montagem e imagem.</li>
</ol>9. montagem e imagens para Pronephros de Zebrafish
<ol><li>Lateral do embrião leigos na lâmina de vidro em um pequeno volume, cerca de 10 µ l, de PBDT.</li>
	<li>Esprema o embrião atrás dos olhos com um par de pinças bem para remover a cabeça e alguns da esfera de gema.</li>
	<li>Use a pinça fina para raspar suavemente a bola gema restante do corpo do embrião. Retire a gema dissociada e líquido extra do slide com um tecido fino.</li>
	<li>Adicionar uma gota de mídia para a restante de cauda do embrião de montagem e posicione de modo que a cauda é colocada lateralmente. Coloque uma lamela em cima da cauda para achatar a amostra e, em seguida, coloque em uma caixa de slides coberto.</li>
	<li>Cílios de rim na ampliação de X 60 em um microscópio confocal, usando os seguintes canais de imagem: DAPI em azul (conjunto no 408.0 a laser nm), FITC em verde (conjunto no 488.0 a laser nm), Cy3 tingir-etiquetados em vermelho (laser conjunto no 561.0 nm) e Alexa 680 em branco (conjunto no 637.0 a laser nm).</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization.">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, (2011).</li><li>Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tbx2a/b+transcription+factors+direct+pronephros+segmentation+and+corpuscle+of+Stannius+formation+in+zebrafish.">The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish.</a> Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).</li><li>Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cilia+in+zebrafish.">Imaging cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).</li><li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3.">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060 (2013).</li><li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish.">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li><li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo detalhado acima é otimizado para a rotulagem MCCs na pronephros com transcrições de odf3b e α-tubulina em 24 embriões de zebrafish hpf. Para os melhores resultados, é recomendável usar embriões recém fixos e preparados. Os embriões que foram fixados e armazenados em MeOH ou Hyb + a-20 ° C por mais de uma semana podem ser usados, mas a probabilidade de fundo indesejado coloração aumenta com o tempo que os embriões são mantidos no armazenamento.
Modificações e solução de problemas desta técnica são necessários para adaptar esse método para outros conjuntos de marcadores particulares, por exemplo, outros riboprobes antisentido e outros anticorpos. Muitos métodos para ajustar os parâmetros das etapas no processo de hibridação de toda montagem in situ têm sido documentadas anteriormente pelo nosso grupo e outros31,34,36,38, 39. Da mesma forma, cada anticorpo da proteína vai exigir um pouco de solução de problemas em termos de coloração vezes e intervalos aproximados de diluições e tempos de incubação para cada anticorpo primário são melhor estimados pela avaliação de resultados documentados28, 35. para embriões mais jovens do que 24 hpf, tratamento de pK deve ser inferior a 2 min, onde mais de 24 embriões hpf deve ser tratados com pK por mais de 2 min. Além disso, os embriões mais velhos do que 24 hpf deve ser branqueada de pigmento antes do tratamento de pK.
Após a coloração com a solução de coloração fluorescente, é fundamental para remover qualquer mancha remanescente, anticorpo e peroxidases, realizando a série de lavagens de metanol e água oxigenada. As lavagens de PBS imediatamente a seguir são vitais para remover o metanol em excesso de embriões. Importante, antes de prosseguir com os anticorpos se, encontramos que a acetona e água desionizada lavagens fazem os menos propensos a aderir a um outro e/ou os tubos de centrífuga de embriões. Em nossa experiência, anticorpos para fatores de transcrição específicos e outros genes, embora eles podem trabalhar eficientemente borrões ocidentais, não funcionam bem pelo IF o zebrafish. No entanto, proteínas altamente conservadas e abundantes, como α-tubulina e β-catenina, funcionam bem no zebrafish para se16,37.
Com peixes, é possível visualizar os transcritos de RNA de genes que ainda não tem anticorpos específicos no zebrafish. Combinando peixes com se, como demonstrado pelo presente protocolo, localização co de transcritos de RNA e proteína pode ser visto na vivo (Figura 2). A natureza flexível do protocolo permite a rápida resolução de problemas para a visualização de diversas transcrições de RNA e proteínas em diversos tecidos e pontos de tempo. Quando combinado com os traços já respeitados de embriões de peixe-zebra, este protocolo de peixe + se oferece outra ferramenta para explorar a expressão dos genes e proteínas importantes para o Regulamento do caminho do desenvolvimento.

Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um organismo modelo principal para estudar a biologia do desenvolvimento. Os embriões desenvolvem-se fora da mãe e são opticamente transparentes. Além disso, ocorre a formação de órgãos vitais como o olho, rim e cérebro anterior rapidamente, com estruturas formadas por apenas 24h pós fertilização (hpf). Importante, o genoma de zebrafish é altamente conservado com mamíferos1,2,3. Além disso, o zebrafish e órgãos de mamíferos têm anatomia e fisiologia similares. O zebrafish rim embrionário, ou pronephros, demonstra o valor do sistema modelo para examinar a função dos genes durante a nephrogenesis precoce e determinação do destino das populações de células epiteliais conservada do néfron vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. da mesma forma, o embrião de zebrafish tornou-se cada vez mais importante ao analisar a ontogenia dos MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como seu nome sugere, MCCs são células epiteliais, caracterizadas por um conjunto de cílios motile localizado sobre a superfície apical17. No zebrafish, MCCs funcionam no fluxo de fluido em são dispersos em um "sal e pimenta" como a moda em todo o meio de cada néfron do pronephros por 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. embora eles só foram anotados em um punhado de rim humano doença casos,18,19,20,21, MCCs são predominantes em outros tecidos de mamíferos como o cérebro e traqueia22,23,24, que apresenta uma série de desafios para o projeto experimental. Estudos elegantes em vários modelos de vertebrados, incluindo o zebrafish demonstraram uma via conservada do destino do MCC, com o entalhe de sinalização via como inibidor da MCC desenvolvimento12,17,25 ,26,,27. Portanto, o zebrafish pronephros fornece um modelo facilmente acessível para estudar os mecanismos genéticos de MCC desenvolvimento na vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparência e fácil manipulação genética de embriões de zebrafish provaram para ser inestimáveis traços ao estudar as vias genéticas e moleculares que regulam o destino da célula, crescimento do tecido e o desenvolvimento do início embrião1,2 ,3. Como tais, as técnicas tradicionais Visualizar transcrições da proteína e do gene, tais como a hibridação in situ e toda montagem se, tem sido aplicado a e otimizado para o zebrafish16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando protocolos populares para peixe e se, é possível rotular e analisar MCCs na vivo16,28,37,38.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>non-specific protease mixture solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td>
			<td>Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embryo dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>225012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic Pasteur pippettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&#176;C. Do not refreeze once thawed for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB11072</td>
			<td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 stock</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-300; 87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization solution (HYB+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &#956;g/&#956;L heparin; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-247-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB13156</td>
			<td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking reagent solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maleic acid buffer solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375 and S7653</td>
			<td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207739910</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 fluorescent staining solution</td>
			<td>PerkinElmer, Inc.</td>
			<td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td>
			<td>store at 4&#176;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-500mL</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-055-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00636-01000</td>
			<td>store an aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438-034</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6793</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#947;-tubulin anitbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5192</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td>
			<td>OpenBiosystems</td>
			<td>IMAGE:6792478</td>
			<td>store bacterial glycerol stock at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915-05000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td>store at 4&#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>store at 4&#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td>18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-1050</td>
			<td>Dumont Tweezers Pattern #55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting media</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18606, Aqua-Poly/Mount</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope and associated software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660710EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

Nos últimos anos, o embrião de zebrafish tem emergido como um modelo popular para estudar a biologia do desenvolvimento, devido a características como ex utero desenvolvimento do embrião e transparência óptica. Em particular, o embrião de zebrafish tornou-se um organismo importante estudar organogênese de vertebrados nos rins, bem como desenvolvimento de célula multiciliated (MCC). Para visualizar as MCCs no rim embrionário zebrafish, temos desenvolvido um protocolo combinado de hibridação toda montagem fluorescente em situ (FISH) e montar toda a imunofluorescência (IF) que permite a geração de imagens de alta resolução. Este manuscrito descreve nossa técnica para localização de transcritos de RNA e proteína co como uma ferramenta para entender melhor o Regulamento dos programas de desenvolvimento através da expressão de vários fatores de linhagem.

Zebrafish do selvagem-tipo embriões foram fixados em 24 hpf e imediatamente preparado como descrito acima. Figura 1 mostra um fluxo de trabalho experimental juntamente com fases ilustrados selecionados. O fluxo de trabalho descrito nas etapas 1-8 engloba os processos de aquisição de amostra, fixação e manipulação do tecido fixo para rotular transcrições endógenas com antisentido riboprobes seguido por imunofluorescência para rótulo somáticas de interesse. Etapa 9 do fluxo de trabalho refere-se a montagem imagem e técnicas desenvolvidas especificamente para otimizar a visualização do tronco embrionárias zebrafish. Nos desenhos que acompanham a etapa 9, ilustraremos o método de manipulação para posicionamento do tecido em uma lâmina de vidro. Nesta etapa, a bola de cabeça e gema de embrião são removidos, deixando a cauda deve ser posicionado lateralmente entre uma lâmina de vidro e lamela. Remoção de gema bola de cabeça é sugerida para a melhor imagem da população residente de MCC no pronephros, como a bola de gema autofluorescente e obstruir o processo de montagem.
Obtidos usando um microscópio confocal de imagens representativas são fornecidas na Figura 2, que mostra o mesmo embrião do selvagem-tipo ampliação de 60 X e um zoom digital com a mesma ampliação. Os painéis superiores fornecem imagens de cada canal individual, enquanto os parte inferior dois painéis são a composto sobreposição destes dados de imagem. Caixa branca (na imagem da coluna da esquerda) descreve a área que é o foco do zoom digital (a imagem da coluna da direita). Destaque no painel final do zoom digital, núcleos foram rotulados em DAPI e MCCs foram detectados com base em um riboprobe antisentido projetado para reconhecer odf3b, onde os anticorpos de γ-tubulina denotam os corpos basais e α-tubulina denota os cílios. O zoom digital da sobreposição composto, o círculo amarelo tracejado indica o perímetro de uma MCC, que foi identificada devido a posse de transcrições de odf3b , vários corpos basais e cílios. Célula adjacente mono-ciliadas, marcada com um círculo pontilhado amarelo, foi identificada baseia o fenótipo de possuir um único corpo basal e um único cílio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do fluxograma experimental. Este fluxograma mostra um fluxo de trabalho experimental, acompanhados de ilustrações de estágios críticos em que o floco de neve indica incubação fria, as três linhas curvas representam o calor e o relógio representa tempos de incubação longa. O fluxo de trabalho pode ser executado em um mínimo de 6 dias (número de dias no canto superior direito de cada fase do processo), embora algumas etapas podem ser executadas durante períodos de tempo mais longos, como observado no protocolo. Uma descrição detalhada do processo de montagem é retirada, demonstrando a cauda do embrião montado final entre a lâmina de vidro e lamela. Uma preta caixa tracejada descreve a área que é fotografada na ampliação de X 60. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: representante resultados para poder visualizar MCCs de pronephros o zebrafish. Projeções de imagem máxima de um embrião de zebrafish do selvagem-tipo 24 hpf em 60 X de ampliação, bem como sobre a ampliação de 60 X do embrião mesmo confocal, um zoom digital. As caixas brancas indicam a área voltada para o zoom. Manchas individuais de DAPI (núcleos), odf3b (MCC), γ-tubulina (corpos basais) e α-tubulina (cílios) são etiquetadas e então fundiram-se os painéis de fundo dois. O zoom digital, nós fornecemos aproximações dos locais de célula como segue: um MCC é descrito pelo tracejado círculo amarelo, e o círculo pontilhado amarelo descreve uma célula mono-ciliadas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

8.1K visualizações.  University of Notre Dame. Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Vídeo: Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Biologia do Desenvolvimento

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...