A imunohistoquímica de montagem total é uma técnica relativamente rápida e simples que permite a observação espacial e temporal de proteínas diretamente em um tecido ou organismo usando anticorpos rotulados. A utilidade desta técnica é que permite a coloração de um tecido intacto ou de um organismo sem ter que primeiro secioná-lo e a microscopia confocal pode ser usada para gerar uma representação tridimensional do padrão de expressão proteica. A imunohistoquímica é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para entender a etiologia e os mecanismos moleculares que sustentam a doença.
É também uma valiosa ferramenta de diagnóstico para identificar tumores em amostras patológicas. Para começar, prepare os tanques de desova cheios de água do sistema e com uma malha ou forro ranhum no lugar. Coloque zebrafish adultos em pares sexuais mistos em grupos nos tanques durante a noite.
Use um ciclo claro/escuro de 14 horas/10 horas com luzes acesas às 9h.m. Na manhã seguinte, com as luzes acesas, troque a água do tanque de desova com água fresca do sistema para remover as fezes. Uma vez colocados ovos, devolva os adultos para os tanques domésticos.
Colete os ovos desenhando-os usando uma pipeta de transferência. Transfira 50 ovos para cada placa de Petri preenchida no meio do caminho com o meio de embrião. Remova quaisquer ovos opacos e nublados que estejam mortos ou não se dividam.
Incubar o prato de ovos a 28,5 graus Celsius até 23 horas após a fertilização. Se os embriões forem mais de 24 horas após a fertilização, com uma pipeta transfira os embriões para 200 PTU micromolar em meio de embrião para prevenir a melanogênese. Sob um microscópio estéreo, descorionato os embriões não-esquesques usando fórceps de ponta ultra fina.
Usando pipetas Pasteur polidas em fogo para minimizar os danos, transfira-as para placas de vidro ou petri de plástico revestidas com 1-2% de agarose dissolvida em meio de embrião. Em seguida, transfira os embriões para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta plástica ou polida pelo fogo. Remova o meio do embrião com uma micropipette.
Deixe apenas líquido suficiente para cobrir os embriões. Fixar os embriões em 4%PFA por uma a duas horas com balanço suave à temperatura ambiente. Em seguida, lave os embriões três vezes em 1X PBS e 1%PBTriton por cinco minutos.
Use os embriões imediatamente ou armazene a quatro graus Celsius por até uma semana. Para armazenamento a longo prazo, desidrate e armazene os embriões em 100% de metanol a menos 20 graus Celsius. Para reidratar os embriões, realize incubações seriais de cinco minutos cada a temperatura ambiente com quantidades decrescentes de metanol e PBS e PBTriton para a lavagem final.
Prossiga com a preparação do embrião de acordo com o manuscrito. Selecione uma solução de bloqueio que corresponda à espécie de hospedeiro de anticorpos secundários, por exemplo 10% de soro de cabra em PBTriton com ou sem dois miligramas por mililitro de BSA. Adicione 0,5 mililitros da solução de bloqueio no tubo contendo o embrião e coloque o tubo em um roqueiro por uma a três horas à temperatura ambiente.
Em seguida, incubar o embrião em anticorpo primário diluído em solução de bloqueio e PBTriton durante a noite a quatro graus Celsius enquanto balança. Pela manhã, lave o embrião cinco vezes em PBTriton por 10 minutos cada um em temperatura ambiente enquanto balança. Em seguida, selecione um anticorpo secundário baseado nas espécies hospedeiras do anticorpo primário e no comprimento de onda desejado em 488 nanômetros.
Adicione o anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio no tubo que contém o embrião. Cubra o tubo com papel alumínio e incubar por duas horas em temperatura ambiente enquanto balança. Depois disso, lave os embriões três vezes em PBTriton por 10 minutos cada um em temperatura ambiente enquanto coberto com papel alumínio e balanço.
Com uma pipeta, transfira os embriões para uma solução de 50% de glicerol em PBS sobre um leito de 2% de agarose em meio de embrião. Para remover a gema, transfira 200 microliters de 1X PBS para um slide de depressão ou um escorregador de vidro simples. Use uma pipeta de transferência de plástico para mover um ou mais embriões para a gotícula PBS.
Use fórceps ultra finos e pinos duplos zero para quebrar a gema e raspar suavemente grânulos de gema da superfície ventral do embrião. Remova os grânulos da gema e reabasteca com PBS conforme necessário. Após a montagem, coloque a amostra no estágio do microscópio.
Localize a região de interesse selecionando um exemplo relativamente brilhante. Ajuste a exposição da câmera e ganhe para que o sinal seja suficientemente brilhante sem saturar. Ao comparar entre os embriões experimentais rotulados por anticorpos e controlar embriões de anticorpos, use as mesmas configurações de exposição.
Este protocolo de imunohistoquímica de montagem inteira é uma ferramenta valiosa para o estudo da expressão de proteína espacial e temporal usando o desenvolvimento de zebrafish. A subunidade GluN1 do receptor de glutamato tipo NMDA revelou expressão de subunidades receptoras de glutamato ao longo do desenvolvimento de músculos de zebrafish a 23 horas após a fertilização. Seções congeladas de embriões pós-fertilização de 72 horas foram montadas em lâminas e imunossuadas para fosfo-H3, um marcador de células proliferadoras.
Várias células expressaram fosfo-H3 e a expressão foi mais notável nas zonas ventriculares. Anticorpo de controle mouse IgG e excluindo anticorpos primários revelaram um baixo nível de expressão não específica. É importante selecionar soluções de bloqueio apropriadas e anticorpos secundários com base nas espécies de hospedeiros de anticorpos primários para garantir a detecção e minimizar manchas não específicas.
A imunohistoquímica deve ser verificada para garantir que o sinal observado seja, na verdade, a proteína de interesse. Experimentos de acompanhamento geralmente envolvem o uso de organismos geneticamente ou ambientalmente modificados. A imunohistoquímica concede aos pesquisadores a capacidade de observar proteínas in situ, acelerando consideravelmente nossa compreensão de inúmeros sistemas na biologia básica e aplicada, particularmente durante o desenvolvimento de embriões.
Metanol e formaldeído são tóxicos e devem ser tratados cuidadosamente. Os resíduos precisam ser coletados e descartados de acordo com os procedimentos institucionais.
