Este protocolo utiliza uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, e serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Este protocolo é aplicável a embriões em diferentes estágios, cortes de tecidos de várias espessuras e diferentes órgãos. Para começar, fixe aproximadamente 10 embriões com 0,5 a 1 mililitro de paraformaldeído fresco a 4% em um tubo de microfuga de 1,5 mililitro a quatro graus Celsius durante a noite por 12 a 14 horas.
Desidratar gradualmente os embriões lavando com 25, 50 e 75% de metanol em PBST sucessivamente por cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Em seguida, lavar os embriões em metanol a 100% por cinco minutos à temperatura ambiente. Incubar os embriões em metanol a 100% a menos 20 graus Celsius durante pelo menos durante a noite, durante 12 a 14 horas.
Reidratar gradualmente os embriões lavando com 75, 50 e 25% de metanol em PBST sucessivamente por cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Novamente, lave o embrião três vezes com PBST por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Digerir os embriões com 10 microgramas por mililitro de proteinase K em PBST à temperatura ambiente e lavar os embriões três vezes com PBST durante cinco minutos.
Em seguida, refixar os embriões lavados em paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente. Novamente, lave o embrião três vezes com PBST enquanto incuba por cinco minutos durante cada lavagem. Para pré-hibridização dos embriões, incubá-los em solução de pré-hibridização a 65 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, substitua a solução de pré-hibridização pela solução de hibridização e pré-hibridize por pelo menos quatro horas. Aqueça a sonda na solução de hibridização por cinco minutos a 95 graus Celsius antes de adicionar aos embriões. Remova o máximo possível de solução de pré-hibridização sem deixar os embriões entrarem em contato com o ar.
Ao tubo que contém os embriões, adicione a sonda pré-aquecida na solução de hibridização e deixe a sonda hibridizar durante a noite por 12 a 14 horas a 50 a 70 graus Celsius. No dia seguinte, aspirar a solução da sonda com uma pipeta e armazená-la em um tubo a menos 20 graus Celsius para que possa ser reutilizada muitas vezes. Lavar os embriões com solução de hibridização a 100% seguida de lavagem sequencial com solução de hibridização a 75, 50 e 25% em duas vezes a concentração de SSCT durante 15 minutos a 65 graus Celsius.
Em seguida, lave os embriões em duas vezes e 0,2 vezes a concentração de SSCT por 15 minutos a 65 graus Celsius. Lavar os embriões duas vezes por 10 minutos em MABT à temperatura ambiente. Bloquear os embriões hibridizados e lavados por pelo menos duas horas à temperatura ambiente, com solução de bloqueio a 2%-1.
Substitua a solução de bloqueio-1 por fosfatase alcalina antidigoxigenina em uma solução de bloqueio a 2%-1 fresca e agite durante a noite por 12 a 14 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, lavar os embriões quatro vezes em MABT por 30 minutos em temperatura ambiente. Novamente, lave os embriões duas vezes em NTMT e remova o máximo possível de NTMT dos embriões usando uma pipeta.
Substitua pelo substrato de fosfatase alcalina roxa BM e core os embriões à temperatura ambiente no escuro. Uma vez que a mancha tenha se desenvolvido, pare a reação enxaguando brevemente duas vezes com NTMT. Após hibridização in situ, enxaguar os embriões com PBST três vezes por 20 minutos.
Imergir os embriões em sacarose a 5% em PBS durante a noite por 12 a 14 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, troque a solução que cobre os embriões para 15% de sacarose em PBS e incube durante a noite por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius. Novamente, troque a solução que cobre os embriões para 30% de sacarose em PBS e incube por um a dois dias a quatro graus Celsius.
Transfira os embriões para um novo criomold para tecido e preencha-o suavemente com meio de temperatura de corte ideal, evitando a formação de bolhas. Em seguida, corte os corpos de prova em seções de 12 a 20 micrômetros de espessura usando um criostato e transfira rapidamente as seções para lâminas de vidro. Permitir que as amostras atinjam a temperatura ambiente e armazenar as secções numa caixa deslizante selada a menos 80 graus Celsius para utilização subsequente.
Lave as lâminas contendo as seções com PBS por cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas no tampão e aqueça a solução por aproximadamente 20 minutos para mantê-la próxima à temperatura de ebulição. Escorra o excesso de solução e seque cuidadosamente a área ao redor de cada seção com um pedaço de tecido.
Em seguida, desenhe um círculo ao redor da seção com uma caneta hidrorrepelente para formar uma barreira hidrofóbica e bloqueie a seção por duas horas em solução de bloqueio-2 à temperatura ambiente. Pipetar a solução de anticorpos primários por lâmina e incubar as lâminas em uma caixa úmida imunohistoquímica a quatro graus Celsius durante a noite. Lave as lâminas três vezes com PBS enquanto incuba por 10 minutos durante cada lavagem e escorra o excesso de PBS.
Em seguida, incubar as lâminas com o anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente em PBS. Novamente, lave as lâminas três vezes com PBS enquanto incuba por 10 minutos durante cada lavagem e escorra o excesso de PBS. Posteriormente, pipete o meio de montagem na corrediça e monte com uma tampa deslizante.
A expressão do receptor 5-HT2C no sistema nervoso central foi detectada na linhagem transgênica foxP2 egfp-caax. A expressão simultânea de 5-HT2C foi observada na linhagem transgênica juntamente com os neurônios foxP2, os quais foram marcados pela proteína fluorescente verde fluoresceína. A expressão de insm1a, um fator de transcrição zinco-dedo na medula espinhal e neurônios motores do peixe-zebra, foi detectada na linhagem transgênica.
A expressão simultânea de insm1a foi observada na linhagem transgênica juntamente com os neurônios hb9, os quais foram marcados pela proteína fluorescente verde fluoresceína. O peixe-zebra deve ser fixado com paraformaldeído preparado na hora.
