As biomoléculas sofrem pequenas e rápidas mudanças estruturais, muitas vezes em resposta à força. Pinças magnéticas de alta resolução podem explorar essas dinâmicas sob forças fisiologicamente relevantes. Como o método faz medições em nanoescala com precisão de milissegundos, é possível monitorar mudanças sutis em ácidos nucléicos e proteínas em tempo real.
Mau funcionamento no primeiro rolamento e proteínas mecanossensíveis podem potencialmente levar a distúrbios cardiovasculares e musculoesqueléticos. Pinças magnéticas podem fornecer informações sobre os mecanismos de funcionamento dessas proteínas. O conjunto deve estar devidamente alinhado e calibrado para obter boas resoluções.
Além disso, deve-se ter cuidado durante a preparação e identificação de construtos moleculares para medições. Comece configurando um microscópio invertido em uma mesa óptica antivibração. Em seguida, instale uma câmera CMOS de alta velocidade e um frame grabber.
Monte verticalmente um estágio linear motorizado com mais de 20 milímetros de comprimento de curso em um estágio XY manual para construir um estágio de translação para manipulação de ímãs em 3D. Em seguida, instale um motor de passo rotativo e um sistema de correia e polia para rotação do ímã. Monte os ímãs em um suporte de acrílico no qual os ímãs paralelos idênticos são espaçados um milímetro de distância.
Ajuste a posição vertical do estágio de translação para que a superfície inferior do ímã se alinhe com o plano da amostra na posição mais baixa do estágio. Usando uma lente objetiva de baixa ampliação, alinhe os ímãs ao centro do campo de visão. Verifique a rotação do ímã para garantir que o deslocamento do centro do par de ímãs seja limitado.
Instale um diodo super luminescente para iluminação de contas. Passe o feixe através da folga do ímã garantindo que o feixe esteja devidamente colimado para caber na lacuna e a iluminação não seja sombreada pelos ímãs. Agora instale um scanner de lente Piezo na peça do nariz e monte a lente objetiva de imersão em óleo 100X com uma abertura numérica de 1,5 para rastreamento de contas.
Certifique-se de que a iluminação seja uniforme com o movimento do ímã para evitar possíveis artefatos no rastreamento de contas. Finalmente, ajuste a luz para o brilho máximo sem saturação de pixels. Comece pegando duas tampas de vidro para a parte superior e inferior da célula.
Limpe as lamínulas sonicando-as em hidróxido de potássio molar por 30 minutos. Em seguida, enxágue as lamínulas em água destilada e mantenha-as imersas em água. Pegylate a tampa inferior e guarde-a a menos 20 graus Celsius até novo uso.
No dia do experimento, seque as tampas peguiladas com uma pistola de nitrogênio. Para fazer os canais simples, prepare tiras de fita dupla face de aproximadamente dois milímetros de largura e coloque quatro tiras paralelas entre si a cinco milímetros de distância na tampa inferior. Agora coloque uma tampa superior no centro da tampa inferior deixando cerca de cinco milímetros de espaço nas bordas curtas para entradas e saídas de canal.
Usando uma pinça, pressione suavemente a parte de trás da tampa superior para selar firmemente os canais. Corte a borda de uma ponta de pipeta de 200 microlitros e corte cerca de 10 milímetros da abertura mais ampla para permitir que ela segure mais de 200 microlitros de solução. Prepare três agulhas de seringa que se encaixam na tubulação para a bomba de seringa.
Conecte a agulha na saída do canal da célula de fluxo à bomba de seringa com tubo de polietileno. Equilibre os canais com PBS. Ressuspenda os agregados de contas por vórtice as soluções de contas.
Em seguida, introduza sequencialmente as soluções necessárias no canal, aspirando com a bomba. Lave todas as contas não encadernadas enquanto aplica 0,1 piconewtons de força. Na superfície do canal da célula de fluxo, identifique as esferas magnéticas presas a moléculas únicas da construção do DNA.
Localize um talão de referência nas proximidades. Gire o talão candidato para verificar se ele gira livremente. Gire as contas por mais algumas voltas e estime o raio de rotação, escolhendo um talão com um raio de rotação menor.
Aumente a força de zero para cinco piconewtons para identificar boas contas de amarração única, procurando uma grande mudança no padrão de difração de contas resultante de um trecho de amarração de par de cinco quilobases. Usando a PCR, prepare um par de cinco quilobases de fragmentos de DNA de fita dupla marcados com biotina em uma extremidade e azida na outra extremidade. Depois de preparar uma célula de fluxo com o produto de PCR, registre as coordenadas X e Y do talão amarrado a 1,2 kilohertz e os ímãs na posição de repouso.
Aproxime os ímãs da célula de fluxo e repita as medições de posição do talão até que os ímãs mal toquem no topo da célula de fluxo. Calcule a força em cada posição D do ímã usando um dos métodos alternativos. Repita as medidas de força para mais algumas construções de DNA sondando três a cinco contas para calcular a média da variabilidade de força entre as esferas magnéticas.
Uma vez que um talão magnético adequado esteja localizado junto com um talão de referência, clique no botão calibrar para começar a se preparar para o rastreamento do talão. Clique nas contas na imagem para definir a localização das contas. Para o rastreamento na direção Z, o software irá pisar a lente objetiva com um scanner Piezo em passos equidistantes e registrar imagens de contas médias de flutuação em cada posição para gerar uma tabela de pesquisa.
Habilite o rastreamento e o foco automático e clique no botão adquirir para registrar as posições das contas. A aplicação de força a uma construção de pino de DNA resultou no modelo de cadeia semelhante a um verme de extensão induzida por força. Em seis piconewtons, a construção exibiu flutuações na extensão associadas ao descompactamento reversível, que desapareceu em oito piconewtons e se encaixou em uma nova curva do modelo.
Experimentos de rastreamento de hairpin a 100 hertz mostraram um aumento na extensão, mas os histogramas não resolveram populações distintas. Com 1,2 kilohertz, as trajetórias medianas filtradas revelaram duas populações distintas. A separação entre as duas populações permaneceu a mesma no regime de força de descompactação.
O estado aberto superior tornou-se gradualmente dominante com o aumento da força. As taxas de transição variaram exponencialmente com a força aplicada favorecendo o descompactamento e inibindo o rezipping. No regime de forças intermediárias, obteve-se um desvio de Allan de dois a três nanômetros na velocidade máxima.
Os cabos de DNA de uma construção complexa SNARE comportaram-se como polímeros de cadeia semelhante a vermes. Quando a força foi relaxada de um regime mais alto, a extensão retornou à curva original ou seguiu um novo modelo. Em 14 piconewtons, o complexo SNARE falhou na transição para o estado descompactado, enquanto uma força aumentada permitiu a transição.
O desdobramento completo do complexo em forças mais elevadas foi confirmado pelo redobramento observado em dois piconewtons. A identificação de cordas de amostra devidamente formadas é a coisa mais importante a ser lembrada ao tentar nosso procedimento. Esta etapa permite a seleção precisa e, portanto, a análise da estrutura alvo.
Pinças magnéticas podem ainda ser usadas para estudar o super enrolamento de DNA aplicando torque. Além disso, poderia ser acoplado com imagens de fluorescência para observar interações ou desdobramentos de proteínas altamente complexas.
