Name: visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações da Monash University, National Health e Medical Research Council e o pulmão de Monash e Instituto do sono. Os autores gostaria de agradecer o pessoal da imunologia clínica na saúde de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) para obter ajuda com a microscopia confocal da imagem latente, e os autores reconhecem as instalações do MMI da Universidade de Monash. Os autores reconhecem a instalações e assistência científica e técnica da plataforma de histologia de Monash.

este protocolo segue experiências aprovadas em: (1) os seres humanos pelo Comitê de ética de Monash Medical centro e (2) animais pelo Comitê de ética da Universidade de Melbourne.
 1. macrófagos do lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li>BAL de uso para obter os macrófagos pulmonares em: (1) humanos sujeitos por broncoscopia 6 e (2) ratos usando aspiração intratraqueal 13 . 
	Nota: Aquisição de macrófagos em geral, causa uma ativação dessas células. Os macrófagos são obtidos de pacientes que requerem uma broncoscopia para investigar um problema médico potencial e nem todos os temas podem ser adequados para análise dos METs (isto terá de ser determinado para cada projecto).
	<ol><li>Tomar a solução de BAL e spin-down (500 x g durante 10 minutos) para formar um pellet, lave duas vezes com meio de cultura (Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) com 5% de soro fetal bezerro e 1% L-glutamina) à temperatura ambiente e em seguida diluir as células em 4 mL de cultura medi ....</li>
		<li>, Se necessário, solicitar um formal contagem diferencial; a maioria das células (geralmente &#62; 80%) será macrófagos 6. 
		Nota: Isso geralmente será executado por um serviço clínico Histologia usando a aparência morfológica dos tipos diferentes de células 6.</li>
		<li>Executar uma célula macrófago viável conta com a solução de BAL usando Trypan azul exclusão e um hemocytometer. 
		Nota: Solução de BAL é Obtida de seres humanos e ratos como mencionado na etapa 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 macrófagos para placas boas 24 em lamelas em 500 µ l do meio de cultura por bem e deixar durante a noite a 37 ° C; as células irão aderir as lamelas. Para amostras humanas, adicionar antibióticos (por exemplo, penicilina e estreptomicina, 10 4 U/mL) para evitar a contaminação bacteriana.</li>
	</ol></li></ol> 2. Rotulagem/microscopia de imunofluorescência de macrófagos BAL Nota: as células são respeitadas em lamelas, como mencionado acima.
<ol><li>Remover o meio de cultura e lavar as células uma vez com solução salina tampão fosfato (PBS). Consertar as células em fixador de paraformaldeído/periodato/lisina (PLP) 2% durante 10 min.</li>
	<li>Lavar as células brevemente em PBS e em seguida permeabilize em 0,2% Tween 20 em PBS por 20 min.</li>
	<li>Células de bloco com sera de frango de 10% em 5% albumina de soro bovino (BSA) diluído em PBS durante 30 min.</li>
	Anticorpos <li>incubar com primário e do isotipo controle por 1h à temperatura ambiente em concentrações de 1: 100 (detalhes mais específicos estão listados na Tabela de materiais) a 37 ° C. 
	Nota: Para as amostras de BAL, um marcador específico de macrófagos normalmente não é necessário.</li>
	<li>Após a adição de anticorpos primários, lavar as células em PBS e incube ainda mais com os correspondentes anticorpos secundários por 40 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>1,0 at óleo objetivo, lave as seções em PBS e montagem com meio de montagem baseada em DAPI para visualização usando um microscópio confocal (como mencionado acima), a laser excitações 405, 488, 561 e 647 nm e uma 40 X.</li>
</ol> 3. Amostras de tecido de pulmão Nota: estudos em vivo do tecido pulmonar, estudar as amostras após a exposição relevante (por exemplo, como descrito por O &#39; Sullivan et al 7). a exposição que é mais relevante para este experimento são microorganismos infecciosos, particularmente bactérias. Cepas de mouse que podem ser usadas para este método são camundongos C57BL/6 ou BALB/c, 10-12 semanas de idade e peso 25-30 g macho.
<ol><li>Euthanize ratos, através de uma injeção intraperitoneal de cetamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Abra a cavidade torácica e expor os pulmões e o coração usando a tesoura e pinça cirúrgica.
	<ol><li>Infundir PBS quente usando uma agulha de calibre 21 para o ventrículo direito para lavar o sangue dos vasos por 30 s, infundir em seguida 10 mL de fixador PLP 2% por 30 s (para o ventrículo direito).</li>
		<li>Use quente PBS (42 ° C) para lavagem da cavidade de peito aberto. Intubação da traqueia com uma agulha de calibre 21 e um pedaço de tubo de 0,8 mm, corte ao tamanho e injetar 800 µ l de previamente aquecido (a 42 ° C), baixo ponto de fusão ponto solução de agarose 3.</li>
		<li>Gravata fora da traqueia com seda trançada (USP 4.0). Coloque a linha ao redor da traqueia, logo abaixo do ponto de inserção da cânula e fixá-lo através de um simples nó de laçada. Para solidificar o agarose, administre PBS gelado ao redor dos pulmões. Remova os pulmões e o coração como um bloco da cavidade torácica, usando uma tesoura e dissecção romba. Remover cada pulmão individualmente e então corrigi-los para 16 h em 2% PLP ou formalina a 4 ° C.</li>
		<li>Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até o corte de tecido. Esses métodos para a obtenção de tecido pulmonar têm sido descritas anteriormente 13.</li>
	</ol></li> <li>Para preparar o tecido pulmonar amostras usam as seguintes etapas.
	<ol><li>Reparo do tecido pulmonar tecidos (ressecados em passo 3.1) em tampão natural formol a 10% por 24 horas à temperatura ambiente. Transferência de 75% de etanol e colocar em um processador de tecido em um ciclo de 12 h, (2.5 h em 75% EtOH, 3h em EtOH absoluto, 3,5 h em solvente 3B e para 3h em parafina).</li>
		<li>Embed em parafina padrão para criar formalin-fixas, parafina blocos (FFPE) que são armazenados à temperatura ambiente. 
		Nota: Nesta fase, é geralmente conveniente cortar as seções de pulmão para slides padrão.</li>
		<li>Cortar as seções de pulmão FFPE na espessura de 4-5 µm usando um micrótomo e montar no cobrado, revestidos slides conforme descritos por s &#39; et al. Sullivan 7</li> <li>para montar slides, coloque 3 gotas de meio de montagem em lamelas de 60 mm x 24 mm (tamanho 1.5), inverter o slide na lamela e empurrar para fora o excesso de meio. Hermeticamente selar com esmaltes e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparação/microscopia de amostras de tecido de pulmão <ol><li>de cera, hidratar e pré-tratamento da amostra de tecido de pulmão FFPE com solução de recuperação de antígeno.
	<ol><li>Forno seco o FFPE desliza por 60 min a 60 ° C. Então coloque as lâminas em solução de xilol por 30 min e transferência para solução de etanol 70% por 5 min à temperatura ambiente. Enxaguar em água da torneira.</li>
		<li>Lugar em plástico resistente ao calor e sujeitos a recuperação HIER-antígeno em uma panela de pressão por 10 min em 10 m/mol/L Tris, pH 1 mmol/EDTA 9.0. Legal de 20 min. lavar duas vezes na água da torneira por 5 min em uma cadeira de balanço, em seguida, uma vez com PBS basculante.</li>
		<li>Bloco com soro de frango de 10% em 5% BSA/PBS durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Manchar o tecido.
	<ol><li>Definir METs em macrófagos, acrescente os anticorpos primários (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 1% BSA/PBS para 16 h a 4 ° C, a diluição de 1/100 (detalhes específicos sobre quantidades de anticorpos são listados na Tabela de materiais). Lave duas vezes com PBS por 5 min em um balancim.</li>
		Anticorpos <li>alcançar a deteção fluorescente de incubação com secundário correspondente em 1% BSA/PBS durante 40 min à temperatura ambiente. Os anticorpos são: anti-rato (1) frango (verde) 488, anti-cabra de frango (2) 594 (vermelho) e (3) burro anti-mouse 647 (vermelho distante).</li>
		<li>Lavar as seções em PBS e montagem com DAPI-contendo o meio de montagem para coloração de cromatina.</li>
	</ol></li> <li>Obter imagens fluorescentes, usando um laser confocal de varredura anexada a um microscópio invertido de cabeça.
	Lasers de nm <ol><li>Excite a preparação com 405, 488, 561 e 647. Capturar imagens de 512 x 512-pixel único avião clicando sobre a linha sequencial, nivelamento de botão (2 linha média) usando 20 X 0.1 ar at e 40 X 1.0 at óleo objectivos.</li>
		<li>Obter pelo menos dez campos de vista por seção de análise e dados para cada resultado (ou seja, 10 de alta potência campos de visão (HFOV) para o controle, 10 para a amostra estimulada, etc., para cada rato). 
		Nota: Para obter uma amostra representativa de todo o campo, um sistema de matriz pode ser usado em que o campo é dividido em as seções diferentes e para cada amostra diferente a mesma matriz é usada para selecionar campos de visão (por exemplo, o campo pode ser dividido em 9 seções, e do centro e os 4 cantos, são tomadas duas HFOV).</li>
	</ol></li></ol> 5. Tridimensional (3D) de imagens de METs Nota: como METs são estruturas 3-d, tomando z-pilha múltiplas imagens, que são reconstituídas, podem dar informações valiosas.
<ol><li>Seção as amostras de pulmão de blocos de parafina, em 200 µm usando um vibratome em uma amplitude de 1,8 mm e velocidade de 0.1-0.5 mm/s.</li>
	<li>Bloco de tecido pulmonar com 20% do respectivo soro (10% de soro fetal bezerro e frango de 10% de soro) e em seguida permeabilize em PBS completadas e 3,75% Triton-X100 para 7 h à temperatura ambiente sob leve agitação.</li>
	<li>Mancha as seções para 16 h a 4 ° C, com os anticorpos primários relevantes (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 200 volumes µ l em tubos microcentrifuga (concentrações de anticorpos são listadas na Tabela de materiais).</li>
	<li>Lave as seções em PBS, 3 vezes por 10 minutos antes da incubação com anticorpos secundários relevantes à temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Mancha as seções de pulmão para DAPI (1:5, 000) na solução por 20 min, antes de adicionar as lamínulas para microscópio desliza em PBS.</li>
	<li>Obter imagens de fluorescência usando um microscópio confocal invertido (40 x 1.3 NA) equipado com 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm de lasers.</li>
	<li>Gravar o 3-d z-pilhas de 0,54 µm de espessura com z-corte ideal para o objectivo de óleo at 40 x 1.3. 
	Nota: O software utilizado pode variar dependendo do microscópio individual. Um exemplo de como o software pode ser usado para um microscópio é fornecido no arquivo suplementar 1.</li>
</ol> 6. Análise de imagem Nota: A análise de amostras requer o uso de software de análise de imagem específicos e exemplos estão listados na Tabela de materiais. Enquanto a análise dos resultados dependerá o programa específico utilizado, os pontos listados abaixo são importantes.
<ol><li>De amostras de análise de BAL <ol><li>Define o número de macrófagos, selecionando o canal azul para DAPI e atribuindo um tamanho mínimo para as células (por exemplo, &#62; 18 µm de diâmetro). Usando o software relevante, medir o número total de macrófagos por campo.</li>
		<li>Contar o número de células que possuem as características de um MET pela presença de cromatina extracelular detectada pelo DAPI com expressão co de outros marcadores (por exemplo, MMP12, PAD2 e H3Cit). 
		Nota: O número de marcadores que podem ser analisados depende do número de lasers disponíveis, mas idealmente além de DAPI, pelo menos, dois outros marcadores devem ser incluídos. Outros menos parâmetros específicos para expressão MET (por exemplo, o número de células com cromatina extracelular e um núcleo alargado) pode ser usado.</li>
		<li>Para comparar a expressão MET em BAL amostras (entre o controle, fumo e fumo/DNase Tratado grupos), analisar um mínimo de 100 macrófagos BAL por amostra.</li>
		<li>Para medir o anticorpo secundário e isotipo controlar níveis de fluorescência; medir um mínimo de 100 células em cada amostra para sua fluorescência. Medir o nível médio de fluorescência de fundo para cada marcador (por exemplo, H3Cit) usando o software padrão.</li>
		<li>Para definir a expressão do MET, contar as células com o fenótipo típico (por exemplo, cromatina extracelular com expressão co de H3Cit e MMP9) e para cada MET, medir o nível de fluorescência dos marcadores (por exemplo, H3Cit e MMP9). Excluir células produzindo METs se sua coloração não foi acima do fundo e do isotipo controle.</li>
		<li>Para amostras humanas de BAL, analisar um mínimo de 100 células para cada amostra para o percentual de macrófagos que fazem METs. Para amostras de murino, como as células são menores e METs são mais difíceis de definir, analisar um número maior de células para cada amostra (por exemplo, 200 macrófagos).</li>
	</ol></li> <li>Análise de amostras de tecido de pulmão <ol><li>para determinar a presença de metástases no tecido pulmonar, use o marcador para macrófagos específicos tais como F4/80.</li>
		<li>Definir a presença de metástases no tecido pulmonar, usando a localização co de F4/80 em células que expressam extracelular cromatina com outros parâmetros, conforme listado na seção 6.1.</li>
		<li>Determinar os níveis de fluorescência de fundo em amostras com anticorpo secundário e os controles do isotipo. Excluir o METs de análise que não está acima do plano de fundo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. 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Os autores têm sem divulgações para fazer em relação a este trabalho.

O método descrito nesta revisão é baseado em que usado para definir a presença de redes14. Os macrófagos são, de longe, o tipo de célula dominante em amostras de BAL... e este método de coleta é particularmente adequado para o estudo dos METs. Se células vermelhas do sangue estiverem presentes no BAL, estas células devem ser lysed usando cloreto de amônio. O procedimento de BAL geralmente irá ativar os macrófagos e, portanto, espera-se que haverá METs presentes em amostras não-esti...

Neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), foi primeiramente descrito pelo Brinkmann et al 1 eles são predominantemente produzidos em resposta à infecção (especialmente para as bactérias) e têm um papel importante na defesa de anfitrião1,2. Eles também têm sido descritos para ocorrer em resposta a doenças não-infecciosas, incluindo vasculite e Lúpus eritematoso sistémico (SLE); e ao mitógeno phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente foi reconhecido que outros tipos de células podem também produzir armadilhas extracelulares, incluindo macrófagos. Armadilhas extracellular do macrófago (METs) ainda não são uma entidade bem definida na literatura4,5. Nós recentemente estabeleceram métodos para detectar a presença de metástases tanto in vitro e in vivode6,7. Neste artigo, será descrita a medição dos METs usando microscopia confocal.
Principais características do NETosis que a distinguem de outras vias celulares (como a apoptose8) são a extrusão da cromatina em conjunto com: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) expressão co de proteases grânulo10 e (3) participação do peptidyl arginina deiminase (PAD) 411,12. Os macrófagos também expressam H3Cit, proteases do grânulo e almofada, e esses recursos podem ser usados para definir a presença de metástases.
Os METs podem ter um papel particularmente importante no pulmão, como o macrófago é a célula dominante presente nos alvéolos e vias aéreas do pulmão e tem papel inicial na direção da resposta imune celular a infecção/inflamação. Além disso, enquanto grande parte do pulmão é espaço vazio (por exemplo, dentro do alvéolo), os METs são potencialmente capazes de expandir-se para o espaço disponível, em contraste com órgãos sólidos.
O método mais utilizado para definir a presença de redes é por microscopia confocal. Não há ainda uma maneira claramente definida para medir METs. A técnica para a medição de redes tem sido adaptada para medir a presença de metástases no presente protocolo. Os requisitos principais para este método são acesso a microscopia confocal e software de imagem apropriado para análise.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Human samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 concentration not quantifiable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascites, no concentration given</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mouse samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slides</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotype control</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Sheep IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software Programs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Confocal scanning microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue sources&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natural formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 black 6</td><td>Monash animal research platform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Um método primário usado para definir a presença de neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) é a microscopia confocal. Modificamos a microscopia confocal estabelecidos métodos para visualizar armadilhas extracellular do macrófago (METs). Estas armadilhas extracelulares são definidas pela presença de cromatina extracelular com expressão co de outros componentes como proteases do grânulo, citrulinado histonas e peptidyl arginase deiminase (PAD). A expressão dos METs geralmente é medida após a exposição a um estímulo e em comparação com amostras não-estimuladas. As amostras também estão incluídas para plano de fundo e do isotipo controle. As células são analisadas usando software de análise de imagem bem definida. Microscopia confocal pode ser usada para definir a presença de metástases tanto in vitro e em vivo no tecido pulmonar.

Os METs podem ser visualizados de amostras de BAL, no tecido pulmonar e nas seções mais grossas de pulmão com imagens em 3D. Um exemplo de METs visualizado em uma amostra de BAL é mostrado na Figura 1. A morfologia do METs irá variar de acordo com seu estágio de maturação. A primeira característica detectável na microscopia é o movimento do núcleo à borda da célula. Isto é seguido por cromatina extracelular com outros mediadores co expressas, t...

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Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K visualizações.  Monash Medical Centre. Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.

Vídeo: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Imunologia e Infecção

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Medicina

Coloração e imagem para visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autor em destaque: Imagens de armadilhas extracelulares de neutrófilos em tecidos humanos e de camundongos 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

Source: Zhang, Y., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60541">In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vitro stimulation of macrophage extracellular traps (METs) in human monocyte-derive macrophages using different inflammatory stimuli such as TNF-alpha, PMA, and HOCL. The video also demonstrates the method of SYTOX dye staining of METs for visualization.

Estimulação in vitro e visualização de armadilhas extracelulares de macrófagos

1. Polarization of HMDM

	Under sterile conditions, prepare the M1 priming media by adding interferon &#947; (IFN&#947;; 20 ng/mL) and lipopolysaccharide ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Imaging and Visualization Techniques

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

Source: Sharma, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56459">Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the immunolabeling of macrophage extracellular traps, METs, in bronchoalveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid, and their visualization using a confocal microscope.

Visualização de Armadilhas Extracelulares em Macrófagos de Fluidos de Lavagem Broncoalveolar Humana

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) ...

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

Resumo

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Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

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Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Estimulação in vitro e visualização de armadilhas extracelulares de macrófagos

Visualização de Armadilhas Extracelulares em Macrófagos de Fluidos de Lavagem Broncoalveolar Humana