Este protocolo demonstra a heterogeneidade na composição, estrutura e morfologia de armadilhas extracelulares de neutrófilos, dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Alta pureza e viabilidade de neutrófilos são obtidas. Isso permite comparar a concentração de DNA, LL-37 e a atividade enzimática da mieloperoxidase, elastase e catepsina G, liberadas por armadilhas extracelulares de neutrófilos.
Este protocolo permitiu analisar o efeito de fatores solúveis ou contato celular ou possíveis terapias ou mecanismos de fechamento sobre a produção de TNEs em doenças autoimunes. Esses métodos podem auxiliar na investigação de doenças autoimunes. Devido à reprodução celular descontrolada dos TNEs e à duração do alinhamento de seus componentes, que são considerados biomarcadores da doença.
A microscopia de fluorescência permite capturar imagens de TNEs mostrando a dispersão do DNA em associação com proteínas como a LL37, que co-localizada com microrganismos ajudando a entender como eles estão aparecendo. Para começar, realize punção de veia para coletar 10 mililitros de sangue periférico em tubos contendo EDTA dipotássico como anticoagulante. Em seguida, realize a biometria sanguínea padrão e o teste de proteína C-reativa para descartar infecção ou inflamação para garantir a qualidade da amostra.
Centrifugar a amostra de sangue periférico para remover o plasma rico em plaquetas, seguido de uma segunda centrifugação e descartar o plasma restante. Diluir o pacote de eritrócitos e leucócitos resultante na proporção de um para um volume com um DPBS 1X. Em seguida, em um tubo de vidro estéril de 10 mililitros, primeiro deposite um mililitro de 1,08 gramas por solução de densidade de mililitros, seguido por um mililitro de 1,079 gramas por solução de densidade de mililitro.
Em seguida, adicione quatro mililitros do pacote diluído de eritrócitos e leucócitos derramando sobre as paredes. Centrífuga sem aceleração ou desaceleração para evitar perturbar o gradiente. Aspirar a fase correspondente aos granulócitos e transferir para outro tubo de vidro estéril de 10 mililitros.
Lave com quatro mililitros de 1X DPBS a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Para remover os eritrócitos restantes, trate as células com choque osmótico adicionando quatro mililitros de solução salina a 0,2%. Incubar por dois minutos a quatro graus Celsius e centrifugar.
Rejeitar o sobrenadante e adicionar quatro mililitros de solução salina a 0,65%. Incubar por cinco minutos a quatro graus Celsius para restaurar a integridade da membrana e repetir a centrifugação. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em quatro mililitros de 1X DPBS para remover os detritos celulares.
Novamente, centrifugar e ressuspender a pastilha de célula em dois mililitros de tampão HBSS frio. Para realizar um teste de exclusão de azul de tripano, diluir cinco microlitros da suspensão celular em 20 microlitros de azul de tripano a 0,4%. Conte as células em uma nova câmara de bower e determine a viabilidade celular usando um teste de exclusão.
Em seguida, monte 5 microlitros da suspensão celular em uma lâmina e manche com a mancha de Wright por 15 segundos. Fixe imediatamente a amostra, lave com água destilada e observe a morfologia sob um microscópio óptico. Em seguida, adicione uma vez 10 às quintas células aos tubos de citometria de fluxo e core com um microlitro de 7AAD em 100 microlitros de tampão FACS por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Lave com 500 microlitros de tampão FACS a 300 G durante 10 minutos. Fixar as células com 500 microlitros de paraformaldeído a 2% e armazenar a quatro graus Celsius até a análise da citometria de fluxo. Para um controle de células mortas, fixe as células com 200 microlitros de paraformaldeído a 4% por 30 minutos e lave com 500 microlitros de 1XPBS a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante e adicione 200 microlitros de 0,1%Triton X-100. Incubar por uma hora a quatro graus Celsius. Lave com 500 microlitros de 1X PBS e manche com 7AAD.
Analise os dados capturados no software do citômetro de fluxo. Carregue os arquivos e clique duas vezes no arquivo de neutrófilos não manchado. Escolha dispersão para frente ou FSC no eixo X e dispersão lateral ou SSC no eixo Y para exibir a população celular correspondente aos neutrófilos.
Em seguida, selecione o canal B3-A:PerCP vio 700-A no eixo X para delimitar a autofluorescência das células e escolha o histograma no eixo Y. Em seguida, abra o arquivo de neutrófilos corado. Escolha FSC no eixo X e SSC no eixo Y para exibir a população celular correspondente aos neutrófilos.
Novamente, selecione o canal B3-A:PerCP vio 700-A para delimitar a população de neutrófilos positivos para o corante 7AAD. Gere o histograma final clicando com o botão direito do mouse na janela e selecionando copiar para o editor de layout. Adicione pseudo-hifas bacterianas ou fúngicas em microtubos de 1,5 mililitro.
Adicione 200 microlitros, então cinco CFSC micromolares em 1X PBS. Misture e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos no escuro. Pare a reação adicionando 500 microlitros de plasma descomplementado e centrífuga.
Descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de 1XPBS com centrifugação. Em seguida, ressuscite os microrganismos em 250 microlitros de 1X PBS. Prepare alíquotas de 50 microlitros em microtubos de 1,5 mililitro com duas vezes 10 para a sétima bactéria ou duas vezes 10 para a quinta pseudo-hifas para indução NET.
Coloque 10 por 10 milímetros de tampa de vidro estéril deslizes em uma placa de 24 poços. Cubra com 10 microlitros de 0,001% de l-lisina poli por uma hora à temperatura ambiente e lave duas vezes com 100 microlitros de 1X PBS. Secar ao ar e irradiar com luz UV por 15 minutos.
Em seguida, substitua a solução HBSS da suspensão de neutrófilos preparada anteriormente por um meio RPMI 1640 suplementado com plasma autólogo descomplementado a 10%. Adicione 350 microlitros desta suspensão celular à placa de 24 poços para uma concentração final de duas vezes 10 aos quintos neutrófilos por poço. Incubar a placa por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir que as células adiram ao fundo dos poços.
Para induzir a formação líquida, adicione os estímulos bacterianos MOI100 e pseudo-hifas no MOI1. Adicione também os estímulos bioquímicos e prepare um controle sem estímulo adicionando 50 microlitros de HBSS. Obter um volume final de 400 microlitros por poço e misturar em um agitador de placa a 140 RPM por 30 segundos.
Em seguida, incubar por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a indução líquida, retire o sobrenadante dos poços pipetando cuidadosamente e fixe as células com 300 microlitros de paraformaldeído a 4% por 30 minutos. Lave as células com 200 microlitros de 1X PBS sem centrifugar e adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos.
Para a coloração LL37, permeabilizar as células com 200 microlitros de 0,2%Triton X-100 em 1X PBS por 10 minutos e lavar com 1X PBS duas vezes. Monte a tampa desliza em lâminas de vidro. O DNA cora as células com dois microlitros de DAPI e armazena a menos 20 graus Celsius até a análise por microscopia de fluorescência confocal.
As fases celulares dinâmicas foram visualizadas após purificação do gradiente de dupla densidade. A morfologia típica dos neutrófilos foi confirmada pela coloração direita. As células também apresentaram viabilidade ótima observada pela exclusão do azul de tripano sem ruptura da membrana.
A análise do CSC versus FSC por citometria de fluxo confirmou uma população correspondente ao PMN com alta pureza celular. Gráficos de pontos PMN para células não coradas versus células de coloração 7AAD e seus respectivos histogramas indicaram uma alta viabilidade celular nos neutrófilos recém-isolados em comparação com as células controle permeabilizadas. Após estimular os neutrófilos com estimulantes químicos e microbianos, os TNEs foram visualizados por microscopia de fluorescência utilizando DNA DPI e anti-LL37.
Os microrganismos foram pré-corados com CFSE. Formação de rede suicida induzida por PMA indicada por co-localização com LL37. Enquanto os TNEs formados com HOCI mostraram menor dispersão de DNA no espaço extracelular que correspondeu à formação de TNE vital.
NET induzida por pseudo-hifas fúngicas mostrou baixas concentrações de DNA liberado no espaço extracelular com estruturas filamentosas características da formação de NET vital. S.aureus mostrou formação de NET vital, enquanto P.aeruginosa induziu a liberação de grandes concentrações de DNA com uma morfologia turva que co-localizou com LL37 indicando formação de NET suicida. A realização da metodologia de gradiente de dupla densidade nos permite obter uma alta pureza e viabilidade dos neutrófilos.
E elevamos as lavagens, evitamos danificar a estrutura delas. Seguindo este método, podemos analisar o efeito de substâncias ou células na produção de NET, bem como se elas estão envolvidas em algum mecanismo ou seu uso como terapias em doenças autoimunes.
