Esta pesquisa foi fundada pela Sociedade Alemã de Pesquisa (BO5534). Agradecemos a Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dra. Annika Heuer e PD Dr. Ingo Königs por nos fornecerem amostras. Além disso, os autores agradecem à equipe do UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) pelo suporte com a microscopia de imunofluorescência.

Este estudo incluiu tecidos de camundongos derivados de experimentos aprovados pela Administração Estadual de Pesquisa Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemanha (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Os tecidos utilizados foram pulmão e cólon de camundongo de modelo séptico e pele queimada. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com 8 semanas de idade. A Diretiva Europeia 2010/63/UE relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos foi seguida em todas as experiências. As amostras humanas anonimizadas incluíram tecidos de enterocolite neonatal, pele queimada, atresia biliar, espondilodiscite e miocárdio. De acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa Médica de Hamburgo, as amostras não necessitaram de consentimento informado, mas o estudo foi aprovado pelo comitê (WF-026/21).
1. Fixação da amostra
<ol><li>Utilizar o seguinte protocolo derivado de Abu Abed e Brinkmann para fixação da amostra, desidratação, incorporação em parafina, seccionamento e montagem 3,15.<ol><li>Preparar solução de formaldeído a 4% dissolvendo 40 g de paraformaldeído (PFA) em 800 ml de solução salina tamponada com Tris, pH 7,4 (TBS).</li>
		<li>Agitar a mistura a 60 °C sob um exaustor até dissolver o PFA. Levar a solução à temperatura ambiente (TR) e ajustar o volume com TBS para 1.000 mL.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,4. Conservar a 4 °C durante 2-3 semanas ou a -20 °C até 1 ano.</li>
	</ol></li>
	<li>Para fixação da amostra, colocar o tecido fresco em tampão TBS e dissecar em pedaços menores que 20 mm x 30 mm x 3 mm. Imergir os cortes de tecido em solução de paraformaldeído a 4% por 12-24 horas. NOTA: O protocolo original utilizava uma solução de PFA a 2% e um tempo de fixação de 8-20 h. Com esse método, alguns cortes teciduais não foram completamente fixados após 20 h, de modo que a concentração de PFA foi aumentada para 4% de PFA.</li>
	<li>Transfira as amostras para de processamento de tecidos marcados. Use marcadores resistentes a solventes ou lápis para rotulagem.</li>
	<li>Iniciar a desidratação da amostra imergindo em seguida os em etanol 70% por 1 h. Em seguida, mergulhe em etanol 80%, etanol 90%, etanol 96% e duas vezes em etanol 100%, com cada etapa durando 1 h.</li>
	<li>Imergir duas vezes em xileno a 100% (dimetilbenzeno) e, em seguida, duas vezes em parafina a 60 °C durante 1 h de cada vez.</li>
	<li>Use moldes de embutimento para montagem e deixe a parafina solidificar antes de remover o molde.</li>
	<li>Use um micrótomo para cortar cortes de tecido de 3 μm de espessura.</li>
	<li>Use uma pinça para colocar as seções cortadas em banho-maria a 37 °C e deixe-as flutuar na superfície para esticar os cortes de tecido.</li>
	<li>Coloque as seções em lâminas de vidro adesivo (Tabela de Materiais) e deixe-as secar durante a noite em uma câmara de calor de 40 °C.</li>
</ol>2. Reidratação da amostra
<ol><li>Para a desparafinização, empilhar as lâminas em um rack de corrediças e submergir duas vezes por 5 min cada no limoneno médio de reposição de xileno (Tabela de Materiais) e uma vez por 5 min em uma mistura de limoneno/etanol 1:1. CUIDADO: O limoneno é inflamável a 50 °C e pode causar reações alérgicas. Use sob um exaustor com proteção para os olhos e luvas. Manter longe de fogo aberto.</li>
	<li>Reidratar as amostras em uma série descendente de etanol submergindo a prateleira duas vezes em etanol 100% e uma vez em etanol 96%, etanol 90%, etanol 80% e etanol 70% por 5 min cada.</li>
	<li>Submergir o rack deslizante por 5 min em água deionizada (água DI) para limpar qualquer etanol restante.</li>
</ol>3. Bloqueio de autofluorescência e recuperação de antígenos
<ol><li>Preparar solução de recuperação alvo de citrato (TRS) pH 6 (Tabela de Materiais) de acordo com a ficha técnica. Este TRS é concentrado 10 vezes. Portanto, diluir 1:10 com água DI. Pré-aqueça em um frasco de coloração plástico a 96 °C. NOTA: O TRS quebra as pontes de metileno formadas durante a fixação da amostra para expor os epítopos do antígeno. Isso permite que os anticorpos primários se liguem ao antígeno alvo. Conservar TRS concentrado a 2-8 °C durante 8 meses. Prepare sempre TRS fresco.</li>
	<li>Retire as corrediças do rack de slides e coloque-as em uma câmara molhada. Pipetar uma a duas gotas de agente redutor de autofluorescência (Tabela de Materiais) em cada amostra. Incubar por 5 min. NOTA: O agente redutor de autofluorescência bloqueia a autofluorescência tecidual inerente causada por fluoróforos endógenos e fixadores. Armazene o agente redutor de autofluorescência em RT por até 1 ano. NOTA: Trabalhe apenas com pequenas seções de tecidos para evitar o ressecamento das amostras ou exceder o tempo de incubação.</li>
	<li>Empilhe as lâminas de volta no rack deslizante e enxágue por 1 min em etanol a 60% usando um movimento ascendente e descendente até que todo o reagente redutor de autofluorescência não utilizado tenha sido lavado.</li>
	<li>Submerja o rack deslizante por 5 min em água DI.</li>
	<li>Para recuperação de antígeno, transfira as lâminas para um frasco de coloração com o TRS pré-aquecido. Incubar durante 10 min a 96 °C em banho-maria. NOTA: O banho-maria de 96 °C pode ser substituído por um micro-ondas ou fogão a vapor se o TRS for pré-aquecido a 96 °C e 10 min de tempo de incubação a 96 °C for assegurado.</li>
	<li>Retire o frasco de coloração e deixe esfriar lentamente por aproximadamente 60-90 min. OBS: O protocolo pode ser pausado aqui por até 4 h, deixando os slides no TRS.</li>
	<li>Retire o TRS, mas mantenha as lâminas no frasco. Enxaguar duas vezes com solução salina tamponada com Tris com Tween 0,05% (TBST, pH 7,4) por 3 min cada para lavar os resíduos de TRS que sobraram.</li>
	<li>Para permeabilização, preparar Triton 0,2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, e preenchê-lo no frasco de coloração para permeabilizar as amostras por 10 min. NOTA: A permeabilização aumenta a ligação dos anticorpos primários com as proteínas-alvo intracelulares nas amostras fixas.</li>
	<li>Enxágue as lâminas novamente duas vezes em TBST por 3 min de cada vez.</li>
	<li>Prepare a câmara molhada e deite escorregadores. Limpe o excesso de água das lâminas com lenços de papel. Circule cada amostra com uma caneta de barreira hidrofóbica para evitar que a solução de anticorpos se esgote. OBS: Não deixe as amostras secarem. É melhor trabalhar com seções pequenas.</li>
</ol>4. Bloqueio da ligação de anticorpos inespecíficos
<ol><li>Tome solução de bloqueio pronta para uso com soro de burro (Tabela de Materiais) e pipete uma gota em cada amostra. Incubar por 30 min no TR. Observação : esta etapa de bloqueio minimiza a ligação do anticorpo secundário a locais de ligação inespecíficos na amostra. Após o bloqueio desses epítopos inespecíficos e a aplicação do anticorpo primário, o anticorpo secundário se ligará ao anticorpo primário e não interagirá com a superfície do tecido. Este reagente de bloqueio pronto a utilizar é armazenado a 2-8 °C durante 6 meses.</li>
	<li>Remova o excesso de solução de bloqueio das lâminas tocando a borda das lâminas contra uma superfície dura. Não enxágue.</li>
</ol>5. Anticorpo primário
<ol><li>Diluir anticorpos primários em tampão de diluição de anticorpos (Tabela de Materiais). Utilizar aproximadamente 100 μL da solução final para cada amostra. Para o anticorpo NE e H3cit (R8) e isocontrole, diluir a uma concentração de 5 μg/mL. Para MPO e isocontrole correspondente, utilizar 10 μg/mL. Prepare um tubo para cada anticorpo primário e um para cada anticorpo isocontrole. NOTA: H3cit (R8)/MPO ou NE/MPO e seus isocontroles podem ser combinados para coloração de NETs. Para a combinação de H3cit (R8)/MPO, diluir até uma concentração final de 5 μg/mL para H3cit (R8) e 10 μg/mL para MPO até um volume final de 100 μL por amostra. Para NE/MPO, diluir até uma concentração final de 5 μg/mL para NE e 10 μg/mL para MPO até um volume final de 100 μL por amostra. Para o isocontrole, use a mesma concentração que para cada anticorpo correspondente. Use sempre uma nova ponta de pipeta para cada anticorpo utilizado. Os anticorpos primários podem ser armazenados a 4 °C por 1-2 semanas e a -20 °C ou -80 °C por até 1 ano.</li>
	<li>Com duas amostras em uma lâmina, utilizar uma para os anticorpos de isocontrole e outra para a diluição de anticorpos MPO/H3cit ou MPO/NE. Use aproximadamente 100 μL para cada amostra e espalhe a solução de anticorpos uniformemente. OBS: Não deixe as amostras secarem. Tenha cuidado para evitar misturar o isocontrole e os anticorpos primários.</li>
	<li>Conservar numa câmara húmida durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, retire o excesso de solução de anticorpos primários das lâminas e empilhe as lâminas em uma cubeta. Enxaguar três vezes por 5 min cada vez com TBST para lavar a solução de anticorpos primários restante.</li>
</ol>6. Anticorpo secundário
<ol><li>Preparar a solução de anticorpos secundários. Use dois anticorpos secundários fluorescentes diferentes: burro-anti-cabra para MPO e burro-anti-coelho para coloração de H3cit. Diluir cada um deles na concentração de 7,5 μg/mL com tampão de diluição de anticorpos (Tabela de Materiais). NOTA: Para dupla coloração, use dois anticorpos fluorescentes com áreas de excitação diferentes e sobreposição espectral mínima. Combinar ambos os anticorpos secundários e diluir até uma concentração final de 7,5 μg/mL para cada anticorpo para um volume final de 100 μL por amostra. Proteger os anticorpos da luz. Os anticorpos secundários podem ser armazenados a 2-8 °C por 6-8 semanas ou a -80 °C por até 1 ano.</li>
	<li>Mantenha as lâminas na câmara húmida e adicione 100 μL da solução de anticorpos secundários em cada amostra. Deixe incubar por 30 min no RT e protegido da luz.</li>
	<li>Toque na solução de anticorpos secundários em excesso e empilhe as lâminas no rack de slides. Submergir três vezes por 5 min cada em um frasco de coloração cheio de PBS para lavar os anticorpos não ligados restantes.</li>
	<li>Preparar a solução de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Tabela de Materiais) e diluir até uma concentração de 1 μg/mL com água DI. Submergir o rack de slides em um frasco de coloração com solução DAPI e incubar por 5 min em RT no escuro. NOTA: DAPI é usado como uma coloração fluorescente para DNA de fita dupla. A solução DAPI preparada pode ser usada várias vezes. Armazene a solução DAPI preparada no RT. O concentrado DAPI pode ser armazenado a -20 °C por até 1 ano.</li>
	<li>Submergir o rack deslizante por 5 min em um frasco de coloração com PBS para lavar o excesso de solução DAPI.</li>
</ol>7. Montagem e armazenamento das amostras, análise microscópica
<ol><li>Monte as amostras com lamínulas e meio de montagem (Tabela de Materiais). NOTA: Use apenas pequenas quantidades de meio de montagem e limpe o meio em excesso com tecidos molhados. Use luvas e evite limpar acidentalmente qualquer meio das tampas ou corrediças. Evite a formação de bolhas e use cotonetes para pressionar suavemente as lamínulas para remover quaisquer bolhas das lâminas.</li>
	<li>Para aquisição de imagens, use um microscópio de campo largo ou um microscópio confocal. NOTA: Tire uma imagem do isocontrol primeiro. Diminua o tempo de exposição para os filtros de fluorescência (exceto o filtro azul para DAPI) até que quase nenhum sinal possa ser detectado. Em seguida, use essa configuração para examinar as amostras correspondentes. Procure áreas onde um sinal fluorescente pode ser detectado em cada amostra individual usando o canal de fluorescência. Depois de tirar uma imagem da área, o programa gera uma imagem composta de todos os canais e mostra os diferentes sinais de fluorescência como uma sobreposição de cores diferentes. A imagem pode então ser analisada para co-localização com software de imagem como o ImageJ.</li>
	<li>Conservar as lâminas a 4 °C até 6 meses.</li>
</ol>

Coloração e imagem para visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste trabalho, nosso objetivo foi adaptar e otimizar os protocolos existentes de obtenção de imagens de TNEs para mais tipos de tecidos, começando pelo processo de coloração propriamente dito. O primeiro passo crítico para este método é a seleção dos anticorpos mais adequados. Para NE, tentamos um anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo em tecido humano, que não mostrou coloração confiável em comparação com NE de um hospedeiro coelho. Além disso, Thålin et al., propuseram o H3cit (R8) como um antic...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram visualizadas pela primeira vez por Brinkmann e col. como uma via de morte celular diferente da apoptose e necrose em 20041. Nessa via, os neutrófilos liberam sua cromatina descondensada no espaço extracelular para formar grandes estruturas semelhantes a teias cobertas por proteínas antimicrobianas que antes eram armazenadas nos grânulos ou citosol. Essas proteínas antimicrobianas incluem elastase neutrofílica (NE), mieloperoxidase (MPO) e histona citrulinada H3 (H3cit), que são comumente usadas para detecção por imunofluorescência indireta de NETs2. Esse método não apenas identifica a presença quantitativa dessas proteínas; na verdade, ele tem a vantagem de detectar especificamente estruturas semelhantes à NET. Nas NETs, as proteínas mencionadas co-localizam-se com o DNA extracelular, que pode ser detectado por uma sobreposição dos sinais de fluorescência de cada proteína corada e do DNA extracelular. Em contraste com os sinais de sobreposição devido ao DNA extracelular e à co-localização de proteínas em NETs, os neutrófilos intactos não mostram co-localização. Aqui, os componentes NET são geralmente armazenados separadamente nos grânulos, núcleos e citosol3.
Desde sua primeira descoberta, tem sido demonstrado que as NETs desempenham um papel central em inúmeras doenças, particularmente aquelas que envolvem inflamação. Os TNEs apresentam funções antimicrobianas durante a infecção através do aprisionamento e morte de patógenos extracelulares no sangue e nos tecidos 4,5. No entanto, os TNEs também têm sido associados a doenças autoimunes e respostas hiperinflamatórias, como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumática e asma alérgica 6,7,8. Os TNEs promovem vaso-oclusão e inflamação na aterosclerose, adesão plaquetária e especula-se que desempenhem um papel no câncer metastático 9,10,11. No entanto, acredita-se que tenham propriedades anti-inflamatórias, reduzindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias12. Embora as NETs estejam ganhando mais interesse em um campo mais amplo de pesquisa, um método robusto de detecção de NET é fundamental para pesquisas futuras.
Embora a visualização de NETs em diferentes tecidos por imunofluorescência seja complexa e necessite de personalização, além da microscopia eletrônica, é atualmente um dos métodos mais renomados para visualizar as interações entre NETs e células, sendo predominantemente utilizada em tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE)13,14. No entanto, a comparação de imagens NET é difícil, pois diferentes laboratórios usam seus próprios protocolos personalizados. Esses protocolos diferem no uso de anticorpos, recuperação de antígenos ou método de permeabilização e são frequentemente otimizados para um tipo específico de tecido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27º.
Após Brinkmann e col. publicarem o primeiro estudo metódico utilizando a visualização imunofluorescente de NETs em tecido FFPE, quisemos otimizar esse protocolo para uma maior variedade de tecidos e espécies15. Além disso, para estabelecer um protocolo de imunofluorescência amplamente aplicável, testamos diferentes protocolos modificados de estudos que utilizaram métodos de imunofluorescência em tecido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Além disso, tentamos um novo anticorpo contra H3cit para coloração extracelular mais específica28. Nós hipotetizamos que, adaptando sistematicamente os protocolos de coloração atuais para diferentes espécies e tecidos, a imagem in vitro pode ser melhorada, resultando em uma melhor representação da interação entre neutrófilos e NETs tanto local quanto sistemicamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são liberadas pelos neutrófilos como resposta à infecção bacteriana ou dano traumático do tecido, mas também desempenham um papel em doenças autoimunes e inflamação estéril. São estruturas semelhantes a teias compostas por filamentos de DNA de fita dupla, histonas e proteínas antimicrobianas. Uma vez liberados, os NETs podem capturar e matar patógenos extracelulares no sangue e no tecido. Além disso, os TNEs participam da regulação homeostática, estimulando a adesão plaquetária e a coagulação. No entanto, a produção desregulada de TNEs também tem sido associada a várias doenças, incluindo sepse ou doenças autoimunes, o que as torna um alvo promissor para intervenção terapêutica. Além da microscopia eletrônica, a visualização de NETs usando imagens de imunofluorescência é atualmente um dos únicos métodos conhecidos para demonstrar interações de NET no tecido. Portanto, vários métodos de coloração para visualização de NETs têm sido utilizados. Na literatura, diferentes protocolos de coloração são descritos, e identificamos quatro componentes-chave mostrando alta variabilidade entre os protocolos: (1) os tipos de anticorpos utilizados, (2) o uso de agentes redutores de autofluorescência, (3) métodos de recuperação de antígenos e (4) permeabilização. Portanto, os protocolos de coloração por imunofluorescência in vitro foram adaptados e aprimorados sistemicamente neste trabalho para torná-los aplicáveis a diferentes espécies (camundongo, humano) e tecidos (pele, intestino, pulmão, fígado, coração, disco vertebral). Após fixação e inclusão em parafina, cortes de 3 μm de espessura foram montados sobre as lâminas. Essas amostras foram coradas com anticorpos primários para mieloperoxidase (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) e elastase neutrofílica (NE) de acordo com um protocolo de coloração modificado. As lâminas foram coradas com anticorpos secundários e examinadas em microscópio de fluorescência de campo largo. Os resultados foram analisados de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente.
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de coloração NET adequado para diferentes tecidos. Usamos um novo anticorpo primário para corar para H3cit e reduzimos a coloração inespecífica com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, demonstramos que a coloração NET requer uma alta temperatura constante e manuseio cuidadoso das amostras.

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

Autor em destaque: Imagens de armadilhas extracelulares de neutrófilos em tecidos humanos e de camundongos 

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Among antibody selection for tissue imaging, the fixation process poses a challenge by epitope masking. Therefore, customized retriever step is required to expose these antigens for antibody binding. Additionally, tissue inherent autofluorescence can cause difficulties through to a high background staining.However, the use of different approaches in the protocols in the literature hinders a standardized comparison between the images. Our study aims to address the demand for standardized procedures and assist the researcher in overcoming challenges during the imaging process. We established a versatile imaging protocol applicable to different tissues by comparing various different protocols.So our work provides guiding and troubleshooting tips from antibody usage to sample mounting, highlighting the potential pitfalls. Our findings advance research by introducing a new primary antibody for citrullinated hisone three, and an autofluorescent reducing agent to minimize background staining. Furthermore, for successful imaging, we emphasize the careful handling of samples and the importance of maintaining a constant high temperature for antigen retrieval.

Antes de iniciar nossa otimização de protocolo, identificamos os principais passos para o sucesso da coloração, pesquisando no PubMed estudos que utilizaram tecido FFPE para a imunomarcação de NETs e comparamos seus protocolos. As diferenças de protocolo mais promissoras foram identificadas como os passos chave para a otimização do protocolo, enquanto os passos que correspondiam em sua maioria não foram alterados (Tabela 1).
Tabela 1: Pesquisa PubMed para imu...

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Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Dentre a seleção de anticorpos para imagem tecidual, o processo de fixação representa um desafio pelo mascaramento de epítopos. Portanto, a etapa de recuperação personalizada é necessária para expor esses antígenos para ligação de anticorpos. Além disso, a autofluorescência inerente ao tecido pode causar dificuldades até uma alta coloração de fundo.Entretanto, a utilização de diferentes abordagens nos protocolos da literatura dificulta uma comparação padronizada entre as imagens. Nosso estudo visa atender à demanda por procedimentos padronizados e auxiliar o pesquisador na superação dos desafios durante o processo de aquisição de imagens. Estabelecemos um protocolo de imagem versátil aplicável a diferentes tecidos, comparando vários protocolos diferentes.Portanto, nosso trabalho fornece dicas de orientação e solução de problemas desde o uso de anticorpos até a montagem de amostras, destacando as possíveis armadilhas. Nossos resultados avançam a pesquisa introduzindo um novo anticorpo primário para a sitrulina sua três, e um agente redutor autofluorescente para minimizar a coloração de fundo. Além disso, para o sucesso das imagens, enfatizamos o manuseio cuidadoso das amostras e a importância de manter uma temperatura alta constante para a recuperação do antígeno.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

4.1K visualizações.  University of Hamburg. Dentre a seleção de anticorpos para imagem tecidual, o processo de fixação representa um desafio pelo mascaramento de epítopos. Portanto, a etapa de recuperação personalizada é necessária para expor esses antígenos para ligação de anticorpos. Além disso, a autofluorescência inerente ao tecido pode causar dificuldades até uma alta coloração de fundo.Entretanto, a utilização de diferentes abordagens nos protocolos da literatura dificulta uma comparação padronizada en...

Vídeo: Autor em destaque: Imagens de armadilhas extracelulares de neutrófilos em tecidos humanos e de camundongos 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imunologia e Infecção

﻿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples

Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples  

To begin, prepare 10 times concentrated citrate, target retrieval solution or TRS of pH six, according to the manufacturer's instructions. Dilute it to a ratio of 1:10 with deionized water. Then heat the solution in a plastic staining jar to 96 degrees Celsius.Remove the slides from the slide rack and place them into a wet chamber. Next, pipette one or two drops of the autofluorescence-reducing agent onto each tissue sample and incubate the samples for five minutes. Stack the slides back into the slide rack, and rinse for one minute in 60%ethanol using upward and downward motions to remove the unused autofluorescence-reducing reagent.Submerge the slide rack in deionized water for five minutes. Transfer the slides into a staining jar with preheated TRS Buffer for Antigen Retrieval. Incubate the slides for 10 minutes at 96 degrees Celsius in a water bath.Remove the staining jar and let it cool to room temperature for approximately 60 to 90 minutes. Next, remove the TRS while keeping the slides in the jar. Rinse the slides twice with TRIS Buffered Saline containing 0.05%Tween at pH 7.4 for three minutes each to remove any remaining TRS residues.Place the slides in a wet chamber. Gently wipe excess water from the slides using paper tissues, then encircle each sample using a hydrophobic barrier pen to prevent the antibody solution from running off.

Bloqueio de Autofluorescência e Recuperação de Antígenos em Amostras de Tecido

Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples

Begin by pipetting one drop of ready-to-use blocking solution with donkey serum onto the tissue samples. Then incubate the samples for 30 minutes at room temperature. Remove the excess blocking solution from the slides by tapping the edge against a hard surface.Dilute the primary antibodies in the antibody dilution buffer to prepare 100 microliters of the final solution for each sample. Set up the antibodies, one tube for each primary antibody and one for each isocontrol antibody. Evenly spread 100 microliters of isocontrol antibodies to one sample, and 100 microliters of myeloperoxidase and citrullinated histone H3, or myeloperoxidase and neutrophil elastase antibody dilution to the other sample.Place the slides in a wet chamber and store them overnight at four degrees Celsius. The following day, tap off excess primary antibody solution from the slides and stack them in a cuvette. Rinse the slides three times for five minutes each using Tris buffered saline with tween To remove the remaining primary antibody solution.Prepare two distinctly fluorescent secondary antibodies, donkey anti-goat for myeloperoxidase and donkey anti-rabbit for citrullinated histone H3 staining. Dilute each antibody to 7.5 micrograms per milliliter concentration in the antibody dilution buffer. Place the slides in a wet chamber and dispense 100 microliters of the secondary antibody solution onto each sample.Incubate them for 30 minutes at room temperature protected from light. Remove excess secondary antibody solution by tapping the slides. Put the slides in a slide rack.Submerge the slides three times for five minutes each in a staining jar filled with PBS to wash off unbound antibodies. Prepare the dappy solution and dilute it to a concentration of one microgram per milliliter with deionized water. Submerge the slide rack in a staining jar containing the dappy solution and incubate for five minutes at room temperature in the dark.Next, submerge the slide rack in a staining jar with PBS for five minutes to wash off any excess dappy solution. Finally, mount the samples using cover slips and mounting medium. The citrullinated histone H3 antibody only bound to the extracellular histones and showed no staining of intracellular histones.The human or mouse specific myeloperoxidase antibody showed no specific staining. While the universal human and mouse antibodies showed consistent good staining for myeloperoxidase. When no blocking agent was used, some mouse samples showed more non-specific and partial positive staining.When blocked, the five minutes blocking time showed good results compared to the 10 minutes blocking time. The higher temperatures in the microwave and water bath showed consistently moderate to good antigen retrieval. Whereas in a 60 degrees Celsius water bath there was only partially positive to no staining.For double staining, more favorable results were obtained for the samples incubated at 96 degrees Celsius water bath. However, exceeding the incubation time of 40 minutes at 96 degrees Celsius resulted in less intense antibody staining.