Name: agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Sociedade Max Planck e um estipêndio Göttingen Graduate School Grupo Junior à HB financiou este trabalho.

1. Os instrumentos, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Usar um microscópio que é capaz de manter a amostra em foco e que está equipado com uma fase automática. Construir um aquecedor tampa feito por encomenda ou comprar uma solução comercial. Configuro um EMCCD LED sistema de câmera em que a exposição da câmera dispara iluminação LED através de um sinal TTL utilizando as instruções do fabricante. Nota: Veja a discussão para mais detalhes. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) selos: <ol><li> Fabricar PDMS selos em uma instalação de microfluídica ou ter os selos PDMS produzidos por uma fundição comercial. Para usar uma fundição comercial, enviar um arquivo do AutoCAD para a empresa e especificar a profundidade (15 mm, por exemplo) do dispositivo. Após a entrega da fundição, cortar o chip PDMS em seus selos 16 usando um bisturi. </li><li> Relacionar cada selo indivíduo para uma lâmina de vidro usando plasma de ar. Para a colagem, expor tanto o selo PDMS ea lâmina de vidro de plasma de ar para umataque 1 min (usando as definições de plasma mais elevados a 0,5 mbar). Certifique-se de que as superfícies de ligação virado para cima durante o tratamento de plasma. Em seguida, coloque o selo PDMS para a lâmina de vidro. </li></ol></li><li> Tomar um prato inferior 3,5 cm, e cortar uma área quadrada de 18 x 18 mm a partir do centro do fundo do prato utilizando uma fresadora vertical e lâminas rotativas afiadas. Use baixa velocidade de rotação da ferramenta de corte e de alimentação lenta para evitar que o plástico a partir de derretimento devido ao calor produzido pelo atrito. Prepare vários pratos de uma só vez. Nota: O prato inferior pode ser reutilizado muitas vezes depois da experiência, se for feita após imersão em etanol puro S / N. </li><li> Agarose: <ol><li> Dissolve-se 3 g de alto ponto de fusão de agarose em 100 ml de S-basal (5,85 g de NaCl, 1 g de K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 mL de colesterol (5 mg / ml em etanol), H 2 O para uma L, esterilizar em autoclave) por fervura. Faça alíquotas da dissolvido em 2 ml de agarose a tubos de Eppendorf e store. Além disso, preparar um lote de baixo ponto de fusão de agarose exactamente da mesma maneira que o ponto de agarose-elevado ponto de fusão. </li><li> Antes da utilização, colocar três alíquotas de alto ponto de fusão de agarose para um bloco de aquecimento a 95-98 ° C. Antes da utilização, colocar uma alíquota de baixo ponto de fusão de agarose para um bloco de aquecimento a 95-98 ° C até se ter fundido e em seguida, para um bloco de aquecimento a 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Seleção de Animais <ol><li> Crescer vermes em uma baixa densidade em placas NGM semeados obter animais limpos. Certifique-se de que há uma abundância de comida e apenas alguns animais sobre a placa. </li><li> Para imagens de larvas L1, transferir cerca de 30 ovos contendo embriões na fase de pretzel em um prato fresco NGM semeado. Para a transferência de estágios larvais mais tarde ou adulto C. elegans, transferir cerca de 30 vermes em um prato fresco NGM semeado. </li></ol> 3. Preparação de agarose microchambers <ol><li> Preparação da cápsula: <ol><li>Tomar um prato de plástico com uma abertura quadrada de 18 x 18 mm na parte inferior e colocá-lo de cabeça para baixo, com a abertura virada para cima. Feche a abertura, colocando um pedaço de fita adesiva dupla face de 20 x 20 mm para a abertura. Rodar o prato em torno de modo que a fita adesiva é na parte inferior e colocar o prato sobre uma superfície dura. Corte a abertura livre usando um bisturi. </li><li> Usando uma pipeta P1000, encher 2 ml de 3% de ponto de fusão elevado de agarose em S-basal para o prato. Coloque a agarose para a área que circunda a abertura e deixar solidificar. Aguarde até que a agarose é sólido. </li><li> Vire-se o prato e retire a película protetora que cobre a fita adesiva dupla face, de modo que o lado adesivo permanecerá no prato e serão expostos. Observação: Como resultado, uma fina anel de fita adesiva irá rodear o exterior da abertura. A agarose serve como um reservatório de humidade, que mais tarde irá rodear a amostra. </li></ol></li><li> Fundição de microchambers: <ol><li> Expor the superfície de PDMS para moldar com plasma de ar para 20-60 seg. Nota: O tratamento por plasma torna o PDMS superfície hidrofílica, o que evita o aprisionamento de bolhas de ar e produz impressões mais nítidas. </li><li> Construir dois espaçadores de altura igual empilhando 5-9 lâminas de vidro. Place, em paralelo com os seus lados compridos, o primeiro espaçador pilha, em seguida, uma única lâmina de vidro, em seguida, novamente uma pilha espaçador. Colocar a lâmina de vidro que contém o selo PDMS ortogonalmente entre os espaçadores. Ajustar a altura dos espaçadores, de modo que existe um espaço de cerca de 1,5 mm entre a superfície de moldagem do selo PDMS e a única lâmina de vidro. </li><li> Coloque uma gota de ponto quente agarose de alta fusão líquido sobre a lâmina de vidro única perto do selo PDMS e rapidamente deslizar as PDMS selo verticalmente no agarose líquido. Deixe a agarose solidificar. Verifique se ele ganha uma aparência opaca, o que normalmente leva cerca de 2 min. Retire o selo verticalmente com um movimento. Nota: É conveniente glue o espaçador desliza em conjunto com fita adesiva dupla face. O movimento vertical do selo evita bolhas de ar fiquem presas na agarose. </li></ol></li><li> Transferir os ovos ou vermes em conjunto com bactérias OP50 para a agarose usando uma picareta fio de platina bem. Distribuir um ovo ou um verme por câmara em conjunto com os alimentos utilizando uma pestana. Encha cerca de 30 ovos sobre uma almofada de agarose. </li><li> Corte a laje de agarose contendo os microchambers preenchidos em um quadrado de cerca de 15 x 15 mm para que ele se encaixa muito bem na abertura do prato. Pegue o pedaço de agarose quadrado com uma pinça e colocá-lo de cabeça para baixo sobre uma lamela de vidro de 20 x 20 mm. Uma vez que caiu, não levantá-lo novamente ou deslize-o ao redor, porque isso pode fazer com que as bactérias e vermes para ser empurrado para fora de suas câmaras. </li><li> Assembléia do prato: <ol><li> Coloque a lamela de vidro para a abertura do prato de plástico. Pressione suavemente a lamela de vidro no anel feito de fita adesiva dupla face.Tome cuidado para não quebrar o vidro. </li><li> Rodar o prato de cabeça para baixo e usar uma pipeta P1000 para preencher a lacuna entre a laje de agar contendo as microcâmaras e o reservatório de líquido de agarose com ponto de agarose de baixo ponto de fusão arrefecidos a cerca de 30 ° C. Aguarde até que a agarose solidificou. </li><li> Selar o prato com uma tampa. Para microscópios invertidos usar uma tampa aquecida. Para microscópios verticais usar uma tampa normal e selar o prato com Parafilm. </li></ol></li><li> Depois de terminar a preparação de microchambers, vê-los sob um microscópio estereoscópico. O preenchimento correto é crucial. Veja a discussão para mais detalhes. </li></ol> Imagem 4. Cálcio <ol><li> Use linhagens transgênicas expressando sensores de cálcio geneticamente codificados como HBR16 (goeIs5 [rmnp-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Use um microscópio composto equipado para todo o campo de epifluorescência. Ligue a saída TTL da câmera para EMCCDa entrada TTL do LED, de modo que cada vez que a câmera registra uma moldura a amostra será iluminado. Usar um tempo de exposição de cerca de 5 mseg. Use EM ganho na gama de 50-300. </li><li> Especifique um filme estouro funcionamento durante 24 horas com cada um verme que está sendo exibido a cada 15-30 min primeiro por 20 s com DIC, em seguida, durante 20 segundos com uma fluorescência da GFP para gravar GCaMP, e em seguida, tomar uma imagem final do sinal mKate2 é levado para controlo para níveis de expressão. Use uma taxa de quadros de 2 / seg durante cada explosão. </li><li> Para a inspeção visual de dados, use um mapa de cores falsas para aumentar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade de fluorescência. Plot dados fluorescentes como Af / F, com F sendo o valor médio basal de fluorescência. Uma descrição pormenorizada da análise dos dados de cálcio pode ser encontrada na literatura 20. </li></ol> 5. AMI paralela de múltiplas Worms <ol><li> Coloque o prato contendo os microchambers para o microscópio, concentrar-se na amostra e envolver o autofocus. Configurar um protocolo de software de modo que a câmera adquire uma explosão de 40 quadros de imagem em 20 segundos a cada meia hora, durante 24 horas, o que resultará em 1.920 quadros por verme, uma quantidade razoável de dados. Configurar a digitalização para que ele visita cada verme utilizando o palco. Destinam-se a filmar cerca de 30 vermes em uma corrida. </li><li> Imagem vários vermes por zoom out, ou seja, usando uma ampliação menor. Use uma menor ampliação para cobrir várias microchambers com o chip da câmera e filmar vários microchambers adjacentes simultaneamente. Após o final da aquisição da imagem, separar os dados de cada câmara individual do recorte de uma região de interesse cobrindo um animal. </li><li> Para avaliar rapidamente os dados de mobilidade, utilize quadro subtração 28-32. </li></ol> 6. de imagem Fases da vida diferentes de C. elegans <ol><li> Use microchambers agarose para todas as fases da vida de C. elegans de L1 para adulto e incluindo dauers. Use as dimensões da câmara apropriadas para differentes fases da vida que são mostrados na Tabela 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Estádio de vida </td><td> Tamanho da câmara </td><td> Profundidade da câmara </td><td> Tempo de gravação normal </td><td> Ampliação </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 mm </td><td> 10 - 15 uM </td><td> ovo - meados L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 15 uM </td><td> ovo - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larva </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 25 uM </td><td> 4 dias </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 ^ M </td><td> 45 uM </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 ^ M </td><td> 45 uM </td><td> jovem L4 - jovem, adulto </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Jovens adultos </td><td> 700 x 700 ^ M </td><td> 45 uM </td&gt; <td> 12-24 hr </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Câmara tamanhos para diferentes fases da vida. Mostrado são dimensões da câmara e ampliações que são úteis para várias fases optimizadas para um chip de câmara de 8 x 8 mm.

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P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Equipamento O foco de um microscópio normalmente deriva durante a aquisição de imagem a longo prazo. Para microscópios compostos, o foco de manutenção de sistemas podem ser adquiridos a partir dos principais fabricantes de microscópios. No caso de um microscópio composto com controle de foco é muito caro, uma alternativa simples seria usar um microscópio estereoscópico. Microscópios compostos permite o uso de objectivos com elevada abertura numérica (NA) e pode ser facilmente automatizado. Objectivos de petróleo 40X estão bem adaptados. Lentes de imersão em água não são ideais por causa da evaporação durante a imagem a longo prazo. Contraste de interferência diferencial (DIC) gera um contraste agradável que ajuda a acompanhar as alterações morfológicas e comportamentais, mas simples imagem de campo claro, também pode ser usado. Para DIC ou imagiologia campo brilhante, usar luz vermelha por colocação de um filtro de luz vermelha para o caminho do dia-a iluminação do microscópio. Para a digitalização de vários microchambers uma etapa automatizada é necessária. Melhor desempenho é achieved quando uma etapa é usado que tem aceleração e desaceleração não-linear e pode ser ajustado para baixo velocidade de digitalização para evitar perturbar os animais durante a digitalização. Não observamos respostas comportamentais ou aumento de cálcio nos neurônios mechanosensitive (ALM e PLM) durante a digitalização, o que sugere que a digitalização lenta na verdade não ativa o sistema mechanosensitive do worm (dados não mostrados). Sistemas comerciais de LED pode ser usado. Várias empresas oferecem soluções prontas para uso, que incluem os LEDs em diferentes comprimentos de onda. O LED deve ter a opção de desencadear externamente o LED com um sinal TTL. Uma câmera altamente sensível é necessário para geração de imagens de cálcio de mover os animais. Câmeras EMCCD são as câmeras mais sensíveis no mercado. A câmera precisa ter uma saída TTL durante a exposição (também chamado de saída &quot;fogo&quot;). Um aquecedor de tampa é necessário para evitar a condensação sobre a tampa se utilizando um microscópio invertido. Em um microscópio vertical, o prato vai ser colocada de modo que a tampa Wiestará na parte inferior e, assim, evitar condensação e sem aquecimento tampa é necessária. A tampa deve fechar-se hermeticamente o recipiente para evitar a evaporação de água durante o exame a longo prazo. PDMS selos A superfície do selo PDMS que contém a estrutura de moldagem para a agarose é Moderada da lâmina de vidro, que suporta o selo PDMS. Uma lista com as empresas que oferecem chips personalizados microfluídicos podem ser encontrados no Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Encher os nematóides em suas câmaras Este é o passo mais crítico no protocolo e os seguintes pontos devem ser considerados: A) A umidade do agarose é crucial para a transferência dos vermes e para a imagem latente. Se a agarose é muito úmido, ou seja, há uma cov líquidorando uma área de vários microchambers, não será possível para distribuir alimentos de bactérias e vermes de uma maneira controlada, porque o líquido irá tornar as bactérias escoar-se. Se a agarose é muito seco, em seguida, as bactérias e vermes não pode sair da picareta facilmente o que significa que o aumento da força precisa ser usada para soltar os vermes e bactérias que facilmente provoca danos ao agarose. Ao preencher um monte de vermes a agarose pode secar. No pior dos casos a agarose será tão seco no final que as câmaras entrará em colapso. Se a agarose é demasiado seco pode ser re-hidratado, colocando uma pequena gota (cerca de 2 ul) de S-basal para o lado do chip onde não existem vermes. Em seguida, mergulhar o fio de platina pegar no líquido e até mesmo puxar algum do líquido para dentro da área onde as câmaras são cheias com vermes. B) A quantidade de alimentos é fundamental para a imagem latente de sucesso a longo prazo. Se não há comida suficiente, os vermes podem ficar sem ele. Se houver excesso de comida na cavidade da câmaranão se comportará como um líquido, mas sim como um sólido e permitirá vermes para escapar da câmara, empurrando as bactérias. Destinam-se a obter uma suspensão bacteriana que preenche toda a câmara. Os vermes estão em constante contacto físico com a superfície de agar e de vidro ao longo da maioria do seu comprimento durante a experiência e a rastejar comportamento parece ser similar ao movimento sobre um prato e diferente de debulha em líquido. C) Mecânica prejudicial do agarose pode arruinar a experiência. Uma escolha bem é essencial. Ele não deve ter cantos afiados. Uma pestana macio ligado a uma ponta de pipeta pode ser usado para mover as bactérias ou vermes para dentro das câmaras, em vez de usar uma palheta de platina. Na maioria dos casos, no entanto, completamente seca de agarose é a razão para danos. A picareta ou cílios deve, idealmente, apenas a apenas tocar a própria agarose, e a película de água na superfície da agarose deve retirar vermes e bactérias. Quando as câmaras de selagem, mais uma vez, a humidade da agarose é essencial. Não deveser qualquer líquido livre na superfície de agarose porque esta pode lavar as bactérias e os vermes durante a selagem. Grandes bolhas pode ser removido levantando suavemente um canto da placa de agar. Pequenas bolhas que são menores do que a câmara muitas vezes ficam presos dentro das câmaras. Essas bolhas não são um problema e vai desaparecer por absorção. Depois de montar o prato, verifique novamente que a agarose não é muito seco nem muito úmido. As câmaras devem ser bem vedados e não deve haver qualquer fluxo de líquido entre as câmaras. Se a agarose é muito úmido, as câmaras não veda corretamente. Worms pode escapar ou seus alimentos serão lavados. Se a amostra for muito úmido, simples abrir a tampa e deixe secar agarose por um minuto ou dois. Se a agarose é muito seco, as câmaras podem entrar em colapso e os vermes vai escapar. Intensificação por diminuir o zoom Para imagens de fluorescência, zoom out é limitada pela baixa quantidade de luz obtida em ampliações inferiores. Além disso, ECâmeras MCCD são otimizados para a sensibilidade e muitas vezes têm uma resolução relativamente baixa. No entanto, ampliação de imagem quatro vezes é bem possível. Por exemplo, quatro câmaras de 190 mm x 190 mm pode caber em um quadro quando usando 140x ampliação (conseguido através de um 20X Objective e uma câmera 0,7X de montagem) e um pixel 512 x 512, câmera de 8 x 8 mm. A câmera de alta resolução com um grande chip (como câmeras scmos, 16,6 milímetros x 14 mm Chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 Megapixel) otimiza a intensificação das DIC e brilhante imaging campo. Por exemplo, até 30 vermes L1 em 190 mm ​​x 190 mm ​​câmaras podem caber em cada frame da câmera ao usar um aumento de 100x (ver Figura 3). Em princípio, o zoom e a digitalização pode também ser combinados para obter um número ainda maior de animais. A maioria dos neurônios ficar muito bem em foco, de modo que apenas um plano focal precisa ser trabalhada. Se os neurônios são encontrados para sair do foco, AZ varredura usando uma unidade piezo podem ser tomadas a cada vez que point. Adaptação a diferentes comportamentos Este protocolo dá uma boa idéia do comportamento através de escalas de tempo. Obviamente, o calendário das explosões deve ser adaptado a diferentes comportamentos e fases da vida. Limitações da técnica Vários fatores limitam a duração da imagem. O mais importante é a quantidade de alimentos. Uma vez que a comida é consumida, parar o desenvolvimento de larvas. Assim, em pequenas câmaras (190 x 190 ^ m) vermes desenvolver até o estádio L3 e então prender. Se for necessária uma maior tempo de imagem, câmaras maiores têm de ser usado. A duração máxima da imagem latente a longo prazo está na gama de 2,5-3 dias. Se mais de imagem for necessária, as minhocas precisam ser recuperados e colocados em novas câmaras. Quando imagiologia vermes adultos, outra limitação é causada pela prole destes vermes. Vermes adultos põem ovos a partir do qual as larvas eclodem. Essas larvas também vai ficar dentro da câmara, Consumir alimentos, e podem perturbar a análise de imagem. Se prole é um problema, a solução é usar tanto adultos estéreis ou para colocar repetidamente os vermes em câmaras frescas. Para recuperar vermes, a laje de agarose contendo a câmara é cortado com um bisturi livre, é puxado para fora da lamela, e é colocado numa placa de NGM a partir do qual os vermes podem ser recuperados. Outro limite é a restrição dos vermes para áreas relativamente pequenas. Isto pode ser um problema se o movimento de longo alcance deve ser analisado. Enquanto os animais nas câmaras pode ser estimulada mecanicamente e optogenetically 21,27,34,35, a natureza estanque da câmara fará com que seja difícil aplicar estimulantes solúveis ou voláteis. Gases biologicamente importantes, tais como o oxigénio ou o dióxido de carbono podem livremente difundir no agar. O grande reservatório de ar no prato deve manter as concentrações de gases nas câmaras constantes durante o tempo necessário para as experiências. No entanto, deve ser mantido em mente que o Concentraçã oxigénio locaisn na câmara pode assemelhar-se mais as condições encontradas na cultura líquida do que na placa de cultura. Significativas relativamente a métodos existentes Dispositivos microfluídicos têm muito avançado comportamento e de desenvolvimento estudado em C. elegans. Frequentemente, as estruturas são feitas de microfluidos de PDMS 12. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de câmaras de cultura de microfluidos feitas a partir de agarose. A força desta técnica é a combinação de alta qualidade de imagem, a correlação de comportamento com as medições fisiológicas, imagiologia de longo prazo, e um razoavelmente elevado rendimento. Alta qualidade de imagem é obtida por imagem através da lamela de vidro usando objetivos elevados de NA. Como resultado, imagens de fluorescência, tais como imagiologia de cálcio e de imagem confocal de estruturas subcelulares pode ser realizada. Uma vez que os animais não são imobilizados como noutros sistemas, que permite um comportamento de correlação com as medições fisiológicas. Because os animais têm comida suficiente, eles continuam desenvolvendo permitindo imaging longo prazo. Este sistema pode imagem muitos vermes em uma corrida porque os animais estão restritos a suas câmaras definidas. Assim, este método pode ser facilmente dimensionado para cima 9,27,34-36. As aplicações futuras Até agora, este sistema tem sido usado principalmente para estudar o comportamento do sono em C. elegans larvas L1. No entanto, a adaptação a todas as fases, será possível estudar uma grande variedade de comportamentos também em dauers e adultos. Uma grande variedade de comportamentos pode ser estudada com esta técnica que varia de acasalamento para a postura dos ovos.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table><tbody><tr><td>High melting point agarose</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>Top Vision low melting point agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>LED system</td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>now sold as iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>Lid heater</td><td>MPI workshop</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Z-stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Nano Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td>PDMS stamp</td><td>Abbott Laboratories</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Red light filter</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Falcon</td><td>Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td><td></td></tr><tr><td>Double sided sticky tape</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>double sided 25 mm x 33 m</td><td>alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td></tr></tbody></table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

O comportamento é controlado pelo sistema nervoso. Imagem de cálcio é um método simples no nematóide Caenorhabditis elegans transparente para medir a actividade dos neurónios durante vários comportamentos. Para correlacionar com actividade neuronal comportamento, o animal não deve ser imobilizada, mas deve ser capaz de se mover. Muitas mudanças comportamentais ocorrem durante escalas de tempo longos e exigem a gravação ao longo de muitas horas de comportamento. Isto também faz com que seja necessário para a cultura os vermes na presença de alimentos. Como vermes podem ser cultivadas e sua atividade neural fotografada em escalas de tempo longos? Agarose MicroChamber Imagem (AMI) foi desenvolvido anteriormente para a cultura e observar pequenas larvas e agora foi adaptado para estudar todas as fases da vida do início L1 até o estágio adulto de C. elegans. AMI pode ser realizada em vários estágios da vida de C. elegans. Imagem de cálcio a longo prazo é conseguido sem imobilizar os animais usando exposições de curta acionadas externamente comcombinada com um elétron multiplicação de carga acoplada gravação dispositivo (EMCCD) câmera. Diminuir o zoom ou a digitalização pode escalar até este método para a imagem até 40 vermes em paralelo. Assim, é descrito um método para o comportamento e actividade neural imagem em escalas de tempo longos em todas as fases da vida de C. elegans.

Microcâmaras de agarose pode ser aplicado a qualquer fase da vida de C. elegans. Como pode ser observado na Figura 1A, o desenvolvimento das larvas e do comportamento do sono durante lethargus L1 pode ser observada. São mostrados os tamanhos de câmara que são 190 x 190 mm, 10 um de profundidade. Se forem necessários escalas de tempo mais longos, maiores câmaras pode ser utilizado. Como pode ser visto na Figura 1B, utilizando uma câmara com dimensões maiores (370 x 370 mm, 25 um de profundidade) permite o desenvolvimento de C. elegans do ovo até adulto. A Figura 1C mostra uma análise das mudanças a longo prazo no comportamento usando quadro subtração de um verme crescido em uma câmara de ovo até adulto. São mostrados intensidades médias após quadro de subtração para rajadas selecionados durante velório e lethargus. Quanto mais baixa a intensidade média após subtracção valores armação é, quanto menor for a mobilidade do sem-fim. Mostrado são selecionados vestígios de ruptura de uma condição de vigília e uma condição lethargus por estágio larval. Oaumento observado na média intensidade durante o desenvolvimento é principalmente devido ao aumento do contraste e tamanho do animal. Figura 1D mostra uma larva Dauer, um estágio de vida alternativo que está envolvida em condições ambientais adversas 33. Tamanho da câmara é de 370 x 370 mm, 15 um de profundidade. Note-se que a larva Dauer foi colocado para dentro da câmara sem alimentos bacteriana, o que causaria saída da fase larval dauer. A Figura 1E mostra um verme adulto que já estabeleceu muitos ovos para dentro da câmara. Dimensões da câmara utilizada para o adulto foram de 700 x 700 mm, 45 um de profundidade. Finalmente, a Figura 1F mostra um hermafrodita adulto e um acoplamento macho no interior de uma câmara de adulto. Imagem de cálcio em vermes motilidade é possível com sensores de cálcio GCaMP. As Figuras 2A, B mostram imagens de cálcio do comando interneurônio AVA para uma larva L1 27. As Figuras 2C, D mostram a atividade de cálcio para a same tipo de neurônio em um animal adulto. Intensificação de imagem a longo prazo é possível através da digitalização e fazendo zoom out. Figura 3A mostra a qualidade da imagem de gravação simultânea de 30 vermes em um só chip da câmera com uma câmera de 5 megapixels. Figura 3B mostra a qualidade de imagem de 4 de vermes cálcio iluminados simultaneamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Adaptação da AMI para todas as fases de vida de C. elegans. (A) Larva trabalhada desde o início até à fase L1 L2 no início de 190 x 190 mm ​​câmaras. (B) O desenvolvimento do ovo até adulto em uma câmara de 370 x 370 mm. (C) Mobilidade de um verme avaliada utilizando quadro subtração. É mostrada a intensidade média de todas as imagens da imagem após a subtração moldura para um filme explosão selecionado para cada sta larvalge para velório e comportamento lethargus. (D) Uma larva Dauer na ausência de comida numa câmara de 370 x 370 uM. Hermafrodita (E) Adulto com muitos ovos colocados em uma câmara de 700 x 700 mm. (F) de acoplamento de um macho e uma hermafrodita dentro de uma câmara 700 x 700 | im. YA significa jovem adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Imagem de cálcio com a AMI. (A) Imagem de cálcio com GCaMP3 no interneurônio AVA de larvas L1 usando o RMN-1 promotor de comando. São mostradas duas imagens de cores falsas. Na imagem à esquerda, a atividade de AVA é baixa eo bicho não está fazendo um movimento para trás. Na imagem da direita a atividade de AVA é<html> alta, eo worm está se movendo para trás. transientes (B) de cálcio ao longo do tempo para um worm de L1. (C, D) transientes de cálcio em um animal adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Imaginologia vários vermes em paralelo por diminuir o zoom. (A) de imagem simultânea de 30 vermes L1 por quadro usando 190 x 190 mm ​​câmaras e uma ampliação de 100X (usando uma objetiva de 10X) e um chip da câmera 16,6 x 14 mm. (B) imagem simultânea de quatro vermes L3 por quadro, utilizando 370 x 370 uM câmaras e uma ampliação de 100X e uma região de interesse de um chip câmara 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.5K visualizações.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Bioquímica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociência

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Comportamento

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Bioengenharia

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Biologia do Desenvolvimento

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

Imagem de cálcio: um método para visualizar a atividade neural em C. elegans vivos

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de

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