A Sociedade Max Planck e um estipêndio Göttingen Graduate School Grupo Junior à HB financiou este trabalho.

1. Os instrumentos, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Usar um microscópio que é capaz de manter a amostra em foco e que está equipado com uma fase automática. Construir um aquecedor tampa feito por encomenda ou comprar uma solução comercial. Configuro um EMCCD LED sistema de câmera em que a exposição da câmera dispara iluminação LED através de um sinal TTL utilizando as instruções do fabricante. Nota: Veja a discussão para mais detalhes. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) selos: <ol><li> Fabricar PDMS selos em uma instalação de microfluídica ou ter os selos PDMS produzidos por uma fundição comercial. Para usar uma fundição comercial, enviar um arquivo do AutoCAD para a empresa e especificar a profundidade (15 mm, por exemplo) do dispositivo. Após a entrega da fundição, cortar o chip PDMS em seus selos 16 usando um bisturi. </li><li> Relacionar cada selo indivíduo para uma lâmina de vidro usando plasma de ar. Para a colagem, expor tanto o selo PDMS ea lâmina de vidro de plasma de ar para umataque 1 min (usando as definições de plasma mais elevados a 0,5 mbar). Certifique-se de que as superfícies de ligação virado para cima durante o tratamento de plasma. Em seguida, coloque o selo PDMS para a lâmina de vidro. </li></ol></li><li> Tomar um prato inferior 3,5 cm, e cortar uma área quadrada de 18 x 18 mm a partir do centro do fundo do prato utilizando uma fresadora vertical e lâminas rotativas afiadas. Use baixa velocidade de rotação da ferramenta de corte e de alimentação lenta para evitar que o plástico a partir de derretimento devido ao calor produzido pelo atrito. Prepare vários pratos de uma só vez. Nota: O prato inferior pode ser reutilizado muitas vezes depois da experiência, se for feita após imersão em etanol puro S / N. </li><li> Agarose: <ol><li> Dissolve-se 3 g de alto ponto de fusão de agarose em 100 ml de S-basal (5,85 g de NaCl, 1 g de K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 mL de colesterol (5 mg / ml em etanol), H 2 O para uma L, esterilizar em autoclave) por fervura. Faça alíquotas da dissolvido em 2 ml de agarose a tubos de Eppendorf e store. Além disso, preparar um lote de baixo ponto de fusão de agarose exactamente da mesma maneira que o ponto de agarose-elevado ponto de fusão. </li><li> Antes da utilização, colocar três alíquotas de alto ponto de fusão de agarose para um bloco de aquecimento a 95-98 ° C. Antes da utilização, colocar uma alíquota de baixo ponto de fusão de agarose para um bloco de aquecimento a 95-98 ° C até se ter fundido e em seguida, para um bloco de aquecimento a 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Seleção de Animais <ol><li> Crescer vermes em uma baixa densidade em placas NGM semeados obter animais limpos. Certifique-se de que há uma abundância de comida e apenas alguns animais sobre a placa. </li><li> Para imagens de larvas L1, transferir cerca de 30 ovos contendo embriões na fase de pretzel em um prato fresco NGM semeado. Para a transferência de estágios larvais mais tarde ou adulto C. elegans, transferir cerca de 30 vermes em um prato fresco NGM semeado. </li></ol> 3. Preparação de agarose microchambers <ol><li> Preparação da cápsula: <ol><li>Tomar um prato de plástico com uma abertura quadrada de 18 x 18 mm na parte inferior e colocá-lo de cabeça para baixo, com a abertura virada para cima. Feche a abertura, colocando um pedaço de fita adesiva dupla face de 20 x 20 mm para a abertura. Rodar o prato em torno de modo que a fita adesiva é na parte inferior e colocar o prato sobre uma superfície dura. Corte a abertura livre usando um bisturi. </li><li> Usando uma pipeta P1000, encher 2 ml de 3% de ponto de fusão elevado de agarose em S-basal para o prato. Coloque a agarose para a área que circunda a abertura e deixar solidificar. Aguarde até que a agarose é sólido. </li><li> Vire-se o prato e retire a película protetora que cobre a fita adesiva dupla face, de modo que o lado adesivo permanecerá no prato e serão expostos. Observação: Como resultado, uma fina anel de fita adesiva irá rodear o exterior da abertura. A agarose serve como um reservatório de humidade, que mais tarde irá rodear a amostra. </li></ol></li><li> Fundição de microchambers: <ol><li> Expor the superfície de PDMS para moldar com plasma de ar para 20-60 seg. Nota: O tratamento por plasma torna o PDMS superfície hidrofílica, o que evita o aprisionamento de bolhas de ar e produz impressões mais nítidas. </li><li> Construir dois espaçadores de altura igual empilhando 5-9 lâminas de vidro. Place, em paralelo com os seus lados compridos, o primeiro espaçador pilha, em seguida, uma única lâmina de vidro, em seguida, novamente uma pilha espaçador. Colocar a lâmina de vidro que contém o selo PDMS ortogonalmente entre os espaçadores. Ajustar a altura dos espaçadores, de modo que existe um espaço de cerca de 1,5 mm entre a superfície de moldagem do selo PDMS e a única lâmina de vidro. </li><li> Coloque uma gota de ponto quente agarose de alta fusão líquido sobre a lâmina de vidro única perto do selo PDMS e rapidamente deslizar as PDMS selo verticalmente no agarose líquido. Deixe a agarose solidificar. Verifique se ele ganha uma aparência opaca, o que normalmente leva cerca de 2 min. Retire o selo verticalmente com um movimento. Nota: É conveniente glue o espaçador desliza em conjunto com fita adesiva dupla face. O movimento vertical do selo evita bolhas de ar fiquem presas na agarose. </li></ol></li><li> Transferir os ovos ou vermes em conjunto com bactérias OP50 para a agarose usando uma picareta fio de platina bem. Distribuir um ovo ou um verme por câmara em conjunto com os alimentos utilizando uma pestana. Encha cerca de 30 ovos sobre uma almofada de agarose. </li><li> Corte a laje de agarose contendo os microchambers preenchidos em um quadrado de cerca de 15 x 15 mm para que ele se encaixa muito bem na abertura do prato. Pegue o pedaço de agarose quadrado com uma pinça e colocá-lo de cabeça para baixo sobre uma lamela de vidro de 20 x 20 mm. Uma vez que caiu, não levantá-lo novamente ou deslize-o ao redor, porque isso pode fazer com que as bactérias e vermes para ser empurrado para fora de suas câmaras. </li><li> Assembléia do prato: <ol><li> Coloque a lamela de vidro para a abertura do prato de plástico. Pressione suavemente a lamela de vidro no anel feito de fita adesiva dupla face.Tome cuidado para não quebrar o vidro. </li><li> Rodar o prato de cabeça para baixo e usar uma pipeta P1000 para preencher a lacuna entre a laje de agar contendo as microcâmaras e o reservatório de líquido de agarose com ponto de agarose de baixo ponto de fusão arrefecidos a cerca de 30 ° C. Aguarde até que a agarose solidificou. </li><li> Selar o prato com uma tampa. Para microscópios invertidos usar uma tampa aquecida. Para microscópios verticais usar uma tampa normal e selar o prato com Parafilm. </li></ol></li><li> Depois de terminar a preparação de microchambers, vê-los sob um microscópio estereoscópico. O preenchimento correto é crucial. Veja a discussão para mais detalhes. </li></ol> Imagem 4. Cálcio <ol><li> Use linhagens transgênicas expressando sensores de cálcio geneticamente codificados como HBR16 (goeIs5 [rmnp-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Use um microscópio composto equipado para todo o campo de epifluorescência. Ligue a saída TTL da câmera para EMCCDa entrada TTL do LED, de modo que cada vez que a câmera registra uma moldura a amostra será iluminado. Usar um tempo de exposição de cerca de 5 mseg. Use EM ganho na gama de 50-300. </li><li> Especifique um filme estouro funcionamento durante 24 horas com cada um verme que está sendo exibido a cada 15-30 min primeiro por 20 s com DIC, em seguida, durante 20 segundos com uma fluorescência da GFP para gravar GCaMP, e em seguida, tomar uma imagem final do sinal mKate2 é levado para controlo para níveis de expressão. Use uma taxa de quadros de 2 / seg durante cada explosão. </li><li> Para a inspeção visual de dados, use um mapa de cores falsas para aumentar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade de fluorescência. Plot dados fluorescentes como Af / F, com F sendo o valor médio basal de fluorescência. Uma descrição pormenorizada da análise dos dados de cálcio pode ser encontrada na literatura 20. </li></ol> 5. AMI paralela de múltiplas Worms <ol><li> Coloque o prato contendo os microchambers para o microscópio, concentrar-se na amostra e envolver o autofocus. Configurar um protocolo de software de modo que a câmera adquire uma explosão de 40 quadros de imagem em 20 segundos a cada meia hora, durante 24 horas, o que resultará em 1.920 quadros por verme, uma quantidade razoável de dados. Configurar a digitalização para que ele visita cada verme utilizando o palco. Destinam-se a filmar cerca de 30 vermes em uma corrida. </li><li> Imagem vários vermes por zoom out, ou seja, usando uma ampliação menor. Use uma menor ampliação para cobrir várias microchambers com o chip da câmera e filmar vários microchambers adjacentes simultaneamente. Após o final da aquisição da imagem, separar os dados de cada câmara individual do recorte de uma região de interesse cobrindo um animal. </li><li> Para avaliar rapidamente os dados de mobilidade, utilize quadro subtração 28-32. </li></ol> 6. de imagem Fases da vida diferentes de C. elegans <ol><li> Use microchambers agarose para todas as fases da vida de C. elegans de L1 para adulto e incluindo dauers. Use as dimensões da câmara apropriadas para differentes fases da vida que são mostrados na Tabela 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Estádio de vida </td><td> Tamanho da câmara </td><td> Profundidade da câmara </td><td> Tempo de gravação normal </td><td> Ampliação </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 mm </td><td> 10 - 15 uM </td><td> ovo - meados L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 15 uM </td><td> ovo - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larva </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 25 uM </td><td> 4 dias </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 ^ M </td><td> 45 uM </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 ^ M </td><td> 45 uM </td><td> jovem L4 - jovem, adulto </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Jovens adultos </td><td> 700 x 700 ^ M </td><td> 45 uM </td&gt; <td> 12-24 hr </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Câmara tamanhos para diferentes fases da vida. Mostrado são dimensões da câmara e ampliações que são úteis para várias fases optimizadas para um chip de câmara de 8 x 8 mm.

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P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Equipamento O foco de um microscópio normalmente deriva durante a aquisição de imagem a longo prazo. Para microscópios compostos, o foco de manutenção de sistemas podem ser adquiridos a partir dos principais fabricantes de microscópios. No caso de um microscópio composto com controle de foco é muito caro, uma alternativa simples seria usar um microscópio estereoscópico. Microscópios compostos permite o uso de objectivos com elevada abertura numérica (NA) e pode ser facilmente automatizado. Objectivos de petróleo 40X estão bem adaptados. Lentes de imersão em água não são ideais por causa da evaporação durante a imagem a longo prazo. Contraste de interferência diferencial (DIC) gera um contraste agradável que ajuda a acompanhar as alterações morfológicas e comportamentais, mas simples imagem de campo claro, também pode ser usado. Para DIC ou imagiologia campo brilhante, usar luz vermelha por colocação de um filtro de luz vermelha para o caminho do dia-a iluminação do microscópio. Para a digitalização de vários microchambers uma etapa automatizada é necessária. Melhor desempenho é achieved quando uma etapa é usado que tem aceleração e desaceleração não-linear e pode ser ajustado para baixo velocidade de digitalização para evitar perturbar os animais durante a digitalização. Não observamos respostas comportamentais ou aumento de cálcio nos neurônios mechanosensitive (ALM e PLM) durante a digitalização, o que sugere que a digitalização lenta na verdade não ativa o sistema mechanosensitive do worm (dados não mostrados). Sistemas comerciais de LED pode ser usado. Várias empresas oferecem soluções prontas para uso, que incluem os LEDs em diferentes comprimentos de onda. O LED deve ter a opção de desencadear externamente o LED com um sinal TTL. Uma câmera altamente sensível é necessário para geração de imagens de cálcio de mover os animais. Câmeras EMCCD são as câmeras mais sensíveis no mercado. A câmera precisa ter uma saída TTL durante a exposição (também chamado de saída &quot;fogo&quot;). Um aquecedor de tampa é necessário para evitar a condensação sobre a tampa se utilizando um microscópio invertido. Em um microscópio vertical, o prato vai ser colocada de modo que a tampa Wiestará na parte inferior e, assim, evitar condensação e sem aquecimento tampa é necessária. A tampa deve fechar-se hermeticamente o recipiente para evitar a evaporação de água durante o exame a longo prazo. PDMS selos A superfície do selo PDMS que contém a estrutura de moldagem para a agarose é Moderada da lâmina de vidro, que suporta o selo PDMS. Uma lista com as empresas que oferecem chips personalizados microfluídicos podem ser encontrados no Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Encher os nematóides em suas câmaras Este é o passo mais crítico no protocolo e os seguintes pontos devem ser considerados: A) A umidade do agarose é crucial para a transferência dos vermes e para a imagem latente. Se a agarose é muito úmido, ou seja, há uma cov líquidorando uma área de vários microchambers, não será possível para distribuir alimentos de bactérias e vermes de uma maneira controlada, porque o líquido irá tornar as bactérias escoar-se. Se a agarose é muito seco, em seguida, as bactérias e vermes não pode sair da picareta facilmente o que significa que o aumento da força precisa ser usada para soltar os vermes e bactérias que facilmente provoca danos ao agarose. Ao preencher um monte de vermes a agarose pode secar. No pior dos casos a agarose será tão seco no final que as câmaras entrará em colapso. Se a agarose é demasiado seco pode ser re-hidratado, colocando uma pequena gota (cerca de 2 ul) de S-basal para o lado do chip onde não existem vermes. Em seguida, mergulhar o fio de platina pegar no líquido e até mesmo puxar algum do líquido para dentro da área onde as câmaras são cheias com vermes. B) A quantidade de alimentos é fundamental para a imagem latente de sucesso a longo prazo. Se não há comida suficiente, os vermes podem ficar sem ele. Se houver excesso de comida na cavidade da câmaranão se comportará como um líquido, mas sim como um sólido e permitirá vermes para escapar da câmara, empurrando as bactérias. Destinam-se a obter uma suspensão bacteriana que preenche toda a câmara. Os vermes estão em constante contacto físico com a superfície de agar e de vidro ao longo da maioria do seu comprimento durante a experiência e a rastejar comportamento parece ser similar ao movimento sobre um prato e diferente de debulha em líquido. C) Mecânica prejudicial do agarose pode arruinar a experiência. Uma escolha bem é essencial. Ele não deve ter cantos afiados. Uma pestana macio ligado a uma ponta de pipeta pode ser usado para mover as bactérias ou vermes para dentro das câmaras, em vez de usar uma palheta de platina. Na maioria dos casos, no entanto, completamente seca de agarose é a razão para danos. A picareta ou cílios deve, idealmente, apenas a apenas tocar a própria agarose, e a película de água na superfície da agarose deve retirar vermes e bactérias. Quando as câmaras de selagem, mais uma vez, a humidade da agarose é essencial. Não deveser qualquer líquido livre na superfície de agarose porque esta pode lavar as bactérias e os vermes durante a selagem. Grandes bolhas pode ser removido levantando suavemente um canto da placa de agar. Pequenas bolhas que são menores do que a câmara muitas vezes ficam presos dentro das câmaras. Essas bolhas não são um problema e vai desaparecer por absorção. Depois de montar o prato, verifique novamente que a agarose não é muito seco nem muito úmido. As câmaras devem ser bem vedados e não deve haver qualquer fluxo de líquido entre as câmaras. Se a agarose é muito úmido, as câmaras não veda corretamente. Worms pode escapar ou seus alimentos serão lavados. Se a amostra for muito úmido, simples abrir a tampa e deixe secar agarose por um minuto ou dois. Se a agarose é muito seco, as câmaras podem entrar em colapso e os vermes vai escapar. Intensificação por diminuir o zoom Para imagens de fluorescência, zoom out é limitada pela baixa quantidade de luz obtida em ampliações inferiores. Além disso, ECâmeras MCCD são otimizados para a sensibilidade e muitas vezes têm uma resolução relativamente baixa. No entanto, ampliação de imagem quatro vezes é bem possível. Por exemplo, quatro câmaras de 190 mm x 190 mm pode caber em um quadro quando usando 140x ampliação (conseguido através de um 20X Objective e uma câmera 0,7X de montagem) e um pixel 512 x 512, câmera de 8 x 8 mm. A câmera de alta resolução com um grande chip (como câmeras scmos, 16,6 milímetros x 14 mm Chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 Megapixel) otimiza a intensificação das DIC e brilhante imaging campo. Por exemplo, até 30 vermes L1 em 190 mm ​​x 190 mm ​​câmaras podem caber em cada frame da câmera ao usar um aumento de 100x (ver Figura 3). Em princípio, o zoom e a digitalização pode também ser combinados para obter um número ainda maior de animais. A maioria dos neurônios ficar muito bem em foco, de modo que apenas um plano focal precisa ser trabalhada. Se os neurônios são encontrados para sair do foco, AZ varredura usando uma unidade piezo podem ser tomadas a cada vez que point. Adaptação a diferentes comportamentos Este protocolo dá uma boa idéia do comportamento através de escalas de tempo. Obviamente, o calendário das explosões deve ser adaptado a diferentes comportamentos e fases da vida. Limitações da técnica Vários fatores limitam a duração da imagem. O mais importante é a quantidade de alimentos. Uma vez que a comida é consumida, parar o desenvolvimento de larvas. Assim, em pequenas câmaras (190 x 190 ^ m) vermes desenvolver até o estádio L3 e então prender. Se for necessária uma maior tempo de imagem, câmaras maiores têm de ser usado. A duração máxima da imagem latente a longo prazo está na gama de 2,5-3 dias. Se mais de imagem for necessária, as minhocas precisam ser recuperados e colocados em novas câmaras. Quando imagiologia vermes adultos, outra limitação é causada pela prole destes vermes. Vermes adultos põem ovos a partir do qual as larvas eclodem. Essas larvas também vai ficar dentro da câmara, Consumir alimentos, e podem perturbar a análise de imagem. Se prole é um problema, a solução é usar tanto adultos estéreis ou para colocar repetidamente os vermes em câmaras frescas. Para recuperar vermes, a laje de agarose contendo a câmara é cortado com um bisturi livre, é puxado para fora da lamela, e é colocado numa placa de NGM a partir do qual os vermes podem ser recuperados. Outro limite é a restrição dos vermes para áreas relativamente pequenas. Isto pode ser um problema se o movimento de longo alcance deve ser analisado. Enquanto os animais nas câmaras pode ser estimulada mecanicamente e optogenetically 21,27,34,35, a natureza estanque da câmara fará com que seja difícil aplicar estimulantes solúveis ou voláteis. Gases biologicamente importantes, tais como o oxigénio ou o dióxido de carbono podem livremente difundir no agar. O grande reservatório de ar no prato deve manter as concentrações de gases nas câmaras constantes durante o tempo necessário para as experiências. No entanto, deve ser mantido em mente que o Concentraçã oxigénio locaisn na câmara pode assemelhar-se mais as condições encontradas na cultura líquida do que na placa de cultura. Significativas relativamente a métodos existentes Dispositivos microfluídicos têm muito avançado comportamento e de desenvolvimento estudado em C. elegans. Frequentemente, as estruturas são feitas de microfluidos de PDMS 12. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de câmaras de cultura de microfluidos feitas a partir de agarose. A força desta técnica é a combinação de alta qualidade de imagem, a correlação de comportamento com as medições fisiológicas, imagiologia de longo prazo, e um razoavelmente elevado rendimento. Alta qualidade de imagem é obtida por imagem através da lamela de vidro usando objetivos elevados de NA. Como resultado, imagens de fluorescência, tais como imagiologia de cálcio e de imagem confocal de estruturas subcelulares pode ser realizada. Uma vez que os animais não são imobilizados como noutros sistemas, que permite um comportamento de correlação com as medições fisiológicas. Because os animais têm comida suficiente, eles continuam desenvolvendo permitindo imaging longo prazo. Este sistema pode imagem muitos vermes em uma corrida porque os animais estão restritos a suas câmaras definidas. Assim, este método pode ser facilmente dimensionado para cima 9,27,34-36. As aplicações futuras Até agora, este sistema tem sido usado principalmente para estudar o comportamento do sono em C. elegans larvas L1. No entanto, a adaptação a todas as fases, será possível estudar uma grande variedade de comportamentos também em dauers e adultos. Uma grande variedade de comportamentos pode ser estudada com esta técnica que varia de acasalamento para a postura dos ovos.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

O comportamento é controlado pelo sistema nervoso. Imagem de cálcio é um método simples no nematóide Caenorhabditis elegans transparente para medir a actividade dos neurónios durante vários comportamentos. Para correlacionar com actividade neuronal comportamento, o animal não deve ser imobilizada, mas deve ser capaz de se mover. Muitas mudanças comportamentais ocorrem durante escalas de tempo longos e exigem a gravação ao longo de muitas horas de comportamento. Isto também faz com que seja necessário para a cultura os vermes na presença de alimentos. Como vermes podem ser cultivadas e sua atividade neural fotografada em escalas de tempo longos? Agarose MicroChamber Imagem (AMI) foi desenvolvido anteriormente para a cultura e observar pequenas larvas e agora foi adaptado para estudar todas as fases da vida do início L1 até o estágio adulto de C. elegans. AMI pode ser realizada em vários estágios da vida de C. elegans. Imagem de cálcio a longo prazo é conseguido sem imobilizar os animais usando exposições de curta acionadas externamente comcombinada com um elétron multiplicação de carga acoplada gravação dispositivo (EMCCD) câmera. Diminuir o zoom ou a digitalização pode escalar até este método para a imagem até 40 vermes em paralelo. Assim, é descrito um método para o comportamento e actividade neural imagem em escalas de tempo longos em todas as fases da vida de C. elegans.

Microcâmaras de agarose pode ser aplicado a qualquer fase da vida de C. elegans. Como pode ser observado na Figura 1A, o desenvolvimento das larvas e do comportamento do sono durante lethargus L1 pode ser observada. São mostrados os tamanhos de câmara que são 190 x 190 mm, 10 um de profundidade. Se forem necessários escalas de tempo mais longos, maiores câmaras pode ser utilizado. Como pode ser visto na Figura 1B, utilizando uma câmara com dimensões maiores (370 x 370 mm, 25 um de profundidade) permite o desenvolvimento de C. elegans do ovo até adulto. A Figura 1C mostra uma análise das mudanças a longo prazo no comportamento usando quadro subtração de um verme crescido em uma câmara de ovo até adulto. São mostrados intensidades médias após quadro de subtração para rajadas selecionados durante velório e lethargus. Quanto mais baixa a intensidade média após subtracção valores armação é, quanto menor for a mobilidade do sem-fim. Mostrado são selecionados vestígios de ruptura de uma condição de vigília e uma condição lethargus por estágio larval. Oaumento observado na média intensidade durante o desenvolvimento é principalmente devido ao aumento do contraste e tamanho do animal. Figura 1D mostra uma larva Dauer, um estágio de vida alternativo que está envolvida em condições ambientais adversas 33. Tamanho da câmara é de 370 x 370 mm, 15 um de profundidade. Note-se que a larva Dauer foi colocado para dentro da câmara sem alimentos bacteriana, o que causaria saída da fase larval dauer. A Figura 1E mostra um verme adulto que já estabeleceu muitos ovos para dentro da câmara. Dimensões da câmara utilizada para o adulto foram de 700 x 700 mm, 45 um de profundidade. Finalmente, a Figura 1F mostra um hermafrodita adulto e um acoplamento macho no interior de uma câmara de adulto. Imagem de cálcio em vermes motilidade é possível com sensores de cálcio GCaMP. As Figuras 2A, B mostram imagens de cálcio do comando interneurônio AVA para uma larva L1 27. As Figuras 2C, D mostram a atividade de cálcio para a same tipo de neurônio em um animal adulto. Intensificação de imagem a longo prazo é possível através da digitalização e fazendo zoom out. Figura 3A mostra a qualidade da imagem de gravação simultânea de 30 vermes em um só chip da câmera com uma câmera de 5 megapixels. Figura 3B mostra a qualidade de imagem de 4 de vermes cálcio iluminados simultaneamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Adaptação da AMI para todas as fases de vida de C. elegans. (A) Larva trabalhada desde o início até à fase L1 L2 no início de 190 x 190 mm ​​câmaras. (B) O desenvolvimento do ovo até adulto em uma câmara de 370 x 370 mm. (C) Mobilidade de um verme avaliada utilizando quadro subtração. É mostrada a intensidade média de todas as imagens da imagem após a subtração moldura para um filme explosão selecionado para cada sta larvalge para velório e comportamento lethargus. (D) Uma larva Dauer na ausência de comida numa câmara de 370 x 370 uM. Hermafrodita (E) Adulto com muitos ovos colocados em uma câmara de 700 x 700 mm. (F) de acoplamento de um macho e uma hermafrodita dentro de uma câmara 700 x 700 | im. YA significa jovem adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Imagem de cálcio com a AMI. (A) Imagem de cálcio com GCaMP3 no interneurônio AVA de larvas L1 usando o RMN-1 promotor de comando. São mostradas duas imagens de cores falsas. Na imagem à esquerda, a atividade de AVA é baixa eo bicho não está fazendo um movimento para trás. Na imagem da direita a atividade de AVA é<html> alta, eo worm está se movendo para trás. transientes (B) de cálcio ao longo do tempo para um worm de L1. (C, D) transientes de cálcio em um animal adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Imaginologia vários vermes em paralelo por diminuir o zoom. (A) de imagem simultânea de 30 vermes L1 por quadro usando 190 x 190 mm ​​câmaras e uma ampliação de 100X (usando uma objetiva de 10X) e um chip da câmera 16,6 x 14 mm. (B) imagem simultânea de quatro vermes L3 por quadro, utilizando 370 x 370 uM câmaras e uma ampliação de 100X e uma região de interesse de um chip câmara 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K visualizações.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Vídeo: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neurociência

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...