Name: semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto para desenvolvimento de pesquisas inovadoras sobre câncer Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) e o projeto para pesquisa do câncer e evolução terapêutica (P-criar) (16cm 01061150001, K.M.) da agência do Japão para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED; a Fundação de ciência Takeda (Y.M.); Concessão do fundo de pesquisa do câncer de princesa Takamatsu (13-24520, Y.M.); e JSPS KAKENHI Grant número JP16K07133 (Y.M.).

1. reagente Setup
<ol><li>
Reagentes utilizados para sincronização do celular
	<ol>
<li>Para gerar médio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) contendo timidina 2,5 mM, dissolva 30,28 mg de timidina por 1 mL de água de grau de cultura de tecidos para preparar timidina 125 mM. Filtra a solução com uma unidade de filtro de seringa 0,22 do μm. Adicione 1 mL do thymidine 125mm recentemente preparada por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS).</li>
		<li>Para gerar DMEM contendo 0,1 μg/mL de nocodazole, dissolva nocodazole em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar 5 μg/μL nocodazole. Adicionar 1 µ l de 5 µ g / µ l nocodazole por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS.</li>
		<li>Para gerar DMEM contendo 0,002% (vol/vol) de DMSO, adicione 1 µ l de DMSO por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagentes utilizados para o ensaio do IP-RdRP
	<ol>
<li>Prepare-se do lysis buffer r: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) e 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 5 x tampão de acetato: ácido 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic de 50mm (HEPES)-KOH (pH 7,8), acetato de potássio de 500 mM e 20 mM MgCl2. Armazene os reagentes à temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar o tampão de acetato de 1: 1 x de tampão de lavagem, glicerol 10% (vol/vol), 0,1% (vol/vol) Triton x X-100 e 0.06 inibidor da protease cocktail, ácido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-gratuito. Prepare o tampão de lavagem 1 dia útil ou no dia antes do uso. Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar a solução AGC: 1x tampão de acetato, glicerol 10% (vol/vol) e 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CAPS). Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Para gerar solução AGC contendo 2 mM CaCl2, adicione 100 µ l de 1 M CaCl2 por 50 mL da solução AGC. Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Para gerar AGC solução contendo bis de etileno glicol de 3mm (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA), adicione 375 µ l de 0,4 M EGTA (pH 7,5) por 50 mL da solução AGC. Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare o tampão de acetato de 2: 1 x de tampão de lavagem e rachaduras de 0,02% (wt/vol). Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar a solução HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 e 2 mM ditiotreitol (DTT). Armazenar o reagente a-20 ° C. Nota: Solução HMD deve ser renovada pelo menos em três meses.</li>
		<li>Prepare 2 x buffer de Proteinase K: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de EDTA e 1% (wt/vol) Dodecil sulfato de sódio (SDS). Armazenar o reagente a-20 ° C.</li>
		<li>Prepare 2 x tampão de carregamento: 95% (vol/vol) formamida, 20 mM de EDTA e 1% (wt/vol) laranja G. armazenam o reagente a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de células HeLa
Nota: Preparar células HeLa sincronizada na fase mitótica (manipulado) ou dividir de forma assíncrona (unmanipulated). Cultura de células na presença de 5% de CO2 a 37 ° C.
<ol><li>
Sincronização de células HeLa em mitose
	<ol>
<li>Placa 1 x 106 células HeLa com 10 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS em um prato de cultura de 10 cm.</li>
		<li>Dois dias depois de chapeamento, substitua o médio com 10 mL de DMEM contendo timidina 2,5 mM e 10% (vol/vol) FBS. Cultura de células para 24h.</li>
		<li>Lavar as células três vezes com 10ml de soro de tampão fosfato (PBS) (-) e cultura de células com 10 mL de DMEM contendo 10% (vol/vol) FBS para 6 h.</li>
		<li>Substituir o médio com 10 mL de DMEM contendo 0,1 µ g/mL de nocodazole e 10% (vol/vol) FBS e cultura de células para 14 h.</li>
		<li>Agite o prato de cultura e recuperar o sobrenadante contendo as células mitóticas desanexadas. Conte o número de celular para o ensaio de IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 490 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de unmanipulated células HeLa
	<ol>
<li>Placa 1 x 106 células HeLa com 10 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS em um prato de cultura de 10 cm.</li>
		<li>Dois dias depois de chapeamento, substitua o médio com 10 mL de DMEM com 10% (vol/vol) FBS. Cultura de células para 30 h.</li>
		<li>Substituir o médio com 10 mL de DMEM contendo 0,002% (vol/vol) DMSO e 10% (vol/vol) FBS e cultura de células para 14 h.</li>
		<li>Colete as células por tripsinização usando 0,7 mL de tripsina (2,5 g/L), contendo 1 mM EDTA. Conte o número de celular para o ensaio de IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 490 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP ensaio
<ol><li>Preparação de grânulo proteína A-agarose
	<ol>
<li>Transferi 1 mL (cama volume 500 µ l) de resina de afinidade para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugar a 800 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 800 µ l de tampão de Lise aos talões e misture bem o tubo várias vezes por inversão. Centrifugar a 800 x g durante 3 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes (totais três lavagens).</li>
		<li>Adicione a 800 µ l de tampão de Lise aos talões, misture bem o tubo várias vezes por inversão. Gire o tubo durante a noite (ou pelo menos 4 h) a 4 ° C em um agitador rotativo.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 800 x g durante 3 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de tampão de Lise aos talões e misture bem o tubo várias vezes por inversão. Armazenar os grânulos a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de lisado celular
	<ol>
<li>(Opcional) Se as células são congeladas no passo 2, coloque e descongelar as células congeladas no gelo até as células tornam-se solto.</li>
		<li>Lave as células uma vez com 10 mL de PBS (-). Centrifugar a amostra a 1.450 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lise as células com tampão de Lise gelada um (1 mL de tampão de Lise A por 1 x 107 das células) pipetando suave.</li>
		<li>Proceda à sonicação a amostra em um tubo de 1,5 mL com as seguintes condições; conjunto de amplificação do sonicador em 25% e proceda à sonicação durante 10 s.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 20.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Recolha o sobrenadante. Transferi 1 mL do sobrenadante para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunoprecipitação
	<ol>
<li>Pre-Limpe o lisado de passo 3.2.6 adicionando 40 µ l (grânulo volume 20 µ l) de grânulos de agarose-A proteína lavada por 1 mL do lisado. Misture bem o tubo várias vezes por inversão e girar a amostra por 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 13.000 x g por 1 min a 4 ° C e recuperar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 40 µ l (cama volume 20 µ l) de grânulos de proteína lavada A-agarose e 10 µ g de anticorpo TERT anti-humano (clone: 10E9-2)8 para o pre-apuradas lisado. Misture bem o tubo várias vezes por inversão e girar a amostra a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Lave os grânulos com tampão de lavagem 1: adicionar 1 mL de tampão de lavagem 1 aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita mais três vezes.</li>
		<li>Lave os grânulos de uma vez com solução AGC contendo 2 mM CaCl2: adicionar 1 mL de solução AGC contendo 2 mM CaCl2 aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Tratar os grânulos com nuclease Micrococcal (MNase): prepare a mistura de reação MNase descrita na tabela 1. Resuspenda as contas em 60 µ l da mistura de reação MNase pipetando suave. Agite a amostra (20 a 25 rpm) em uma plataforma giratória de um agitador definido em uma incubadora de Peltier-tipo para min 15 a 25 ° C. Nota: É muito importante usar um agitador ondulante e seguir rigorosamente o limite de velocidade nesta etapa. Outro tipo de abanadores, tais como misturadores rotativos, não são recomendados.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Lave os grânulos duas vezes com a solução de AGC 3mm EGTA: adicionar 1 mL de solução AGC contendo 3 mM EGTA aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita este passo uma vez.</li>
		<li>Lave os grânulos uma vez com o tampão de lavagem 2: adicionar 1 mL de tampão de lavagem 2aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Manter os grânulos no gelo durante a criação de reação RdRP. Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Reação de RdRP
	<ol>
<li>Prepare uma mistura de reação de RdRP em um novo tubo conforme descrito na tabela 2.</li>
		<li>Adicione 6 µ l de [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) para a mistura e misture bem por pipetagem. Nota: ATP [α -32P], [α -32P] CTP ou GTP [α -32P] pode ser usado para a reação ao invés de [α -32P] UTP.</li>
		<li>Adicionar 1 µ l do modelo de RNA (1 µ g / µ l) para a mistura e misture bem por pipetagem. Nota: Para estabelecer o RdRP ensaio, o seguinte modelo de RNA é recomendado: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Resuspenda as contas com 20 µ l da mistura de reação de RdRP da etapa 3.4.3 pipetando.</li>
		<li>Agite a amostra (20 a 25 rpm) em uma plataforma giratória de um agitador definido em uma incubadora de peltier-tipo para h 2 a 32 ° C.</li>
		<li>Adicione 5,4 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) e 45,4 µ l de tampão de Proteinase K x 2 a mistura de reacção. Misture por pipetagem e shake (rpm de 20 a 25) a amostra em uma plataforma giratória definida em uma incubadora de Peltier-tipo por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Adicione 109,2 µ l de água livre de RNase para a amostra.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de ácido fenol-clorofórmio para a amostra. Misture bem por vórtice e centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Repita este passo uma vez.</li>
		<li>Adicionar 20 μL de acetato de sódio 3M (pH = 5,2), 4 µ l de transportadora de precipitação e 250 µ l de etanol na fase aquosa. Agitar o tubo bem para misturar e, em seguida, centrifugar a amostra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o pellet com 300 µ l de álcool etílico (vol/vol) 70% frio armazenado a-20 ° C. Centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota. Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase. Nota: A pelota da etapa 3.4.11 pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos 2 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento de RNase
	<ol>
<li>Resuspenda o pellet de passo 3.4.11 em 20 µ l de água livre de RNase.</li>
		<li>Prepare uma mistura de reação de RNase em um novo tubo conforme descrito na tabela 3.</li>
		<li>Adicionar 180 µ l da mistura de reação de RNase para a amostra e incubar o tubo para 2 h a 37 ° C.</li>
		<li>Adicionar 2,3 µ l de SDS 10% (vol/vol) para a amostra e incube por 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Adicionar 2 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) para a amostra e incube por 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Adicione 205 µ l de ácido fenol-clorofórmio para a amostra. Mistura bem pelo vórtice, centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo.</li>
		<li>Adicione 20 μL de acetato de sódio 3M (pH 5.2), 4 µ l da transportadora de precipitação e 250 µ l de etanol na fase aquosa. Agitar o tubo bem para misturar e, em seguida, centrifugar a amostra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o pellet com 300 µ l de álcool etílico (vol/vol) 70% frio armazenado a-20 ° C. Centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota. Nota: A pelota da etapa 3.5.9 pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos 2 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Autoradiografia e eletroforese em gel
	<ol>
<li>Resuspenda a amostra com 20 µ l de água livre de RNase.</li>
		<li>Adicione 20 µ l de 2 x tampão de carregamento.</li>
		<li>Ferva a amostra durante 10 minutos a 95 ° C. Esmaga a amostra no gelo.</li>
		<li>Funcione o gel. No caso o tamanho do modelo 34 nts (ver também passo 3.4.3), gel de poliacrilamida 7 M ureia - 10% é usado na electroforese do gel de desnaturação.</li>
		<li>Seca o gel com um secador de gel.</li>
		<li>Expor o filme com o gel seco dentro de uma gaveta de raio-x com uma intensificação da tela a-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins.">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li><li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human.">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li><li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription.">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).</li><li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+the+nucleus:+roles+for+small+RNAs+in+transcription,+epigenetics+and+beyond.">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li><li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production.">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA.">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance.">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li><li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase.">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li><li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin.">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li><li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization.">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ensaio de RdRP-IP é um método sensível para detectar atividade RdRP de TERT humana. Proteína TERT é altamente expressa em células mitóticas HeLa, no qual TERT constitui a RdRP complexo8,9,10. Isto sugere que células mitóticas HeLa são um material ideal para detectar atividade RdRP. O protocolo descrito acima, as células HeLa mitóticas e não-sincronizadas estão incluídas como um positivo e um exemplo negativo, respectivamente. Como mostrado na figura 1A, produtos de ensaio RdRP desde o modelo recomendado de RNA em células mitóticas HeLa mostram sinais radioativos amplos entre 20 a 30 nt. Além de células HeLa, temos realizado o ensaio com diferentes tipos de linhagens celulares e encontrado que o padrão do sinal pode ser alterado na célula diferentes tipos9: algumas mostram um sinal forte apenas cerca de 30 nt, alguns mostram um padrão similar com as células HeLa. Nós também ter realizado o ensaio com modelos de RNA que não sejam o 34 nt modelo8, curta e longa (~ 300 nt) RNAs com várias sequências e com êxito obtido RdRP produtos desses modelos apesar de haver alguma preferência. Para o primeiro julgamento, no entanto, nós recomendamos usar as células HeLa na fase mitótica e a modelo nt RNA 34. RdRPs pode gerar RNA double-stranded em um primeira demão-dependente e em uma maneira independente da primeira demão de11. Informamos que a TERT preserva esta propriedade como humano RdRP97,; TERT sintetiza dsRNA de um modelo de RNA com 3'-foldback estrutura através de um mecanismo de costas-ferragem7. Para o modelo nt RNA 34, TERT sintetiza costas complementares sem usar primers9. Para detectar especificamente a RdRP produtos sintetizados em uma forma independente de cartilha, ou seja, de novo sintetizada RNA produtos, [α -32P] NTP pode ser substituído com [γ -32P] NTP na reação RdRP9.
MNase tratamento de complexos imunes TERT em grânulos é um passo fundamental para alcançar os resultados desejados. Se o tratamento MNase é executado muito tempo ou com intensa agitação, os produtos RdRP seria reduzidos notavelmente. Para evitar tais problemas, recomendamos fortemente a seguir rigorosamente o protocolo cuidadosamente. Solução HMD é outro fator crítico para o sucesso. Se você encontrar que os sinais são muito fracos, substitua a solução HMD para um recém preparada.
Em todo o protocolo, um deve tomar muito cuidado para evitar a contaminação de RNase. Tratamento de ribonuclease deve ser realizado com equipamento dedicado. Após manipular a Ribonuclease, um deve descartar dicas e tubos com RNase imediatamente, eliminam RNase com solução especializada (por exemplo, RNase quieto) e alterar groves.
TERT interage não só com TERC mas também de muitos tipos de RNAs endógenos, e registramos parte deles7. Modificação no ensaio de IP-RdRP, tais como o ensaio de IP-RdRP sem tratamento MNase, irá fornecer uma lista completa de modelos de RNA endógenas para o guia de atividade e bioinformatic RdRP TERT-associado em suas características de sequência. Nós tem aplicado com sucesso este protocolo ao tecido lisado. Porque TERT é expresso em uma variedade de tecidos normais e tumor, este ensaio pode ser útil para investigar a função enzimática não-canônicos de TERT em humanos.

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) é conhecido como a subunidade catalítica da telomerase, e se alonga o telômero usando o componente de RNA telomerase (TERC), o RNA específico do modelo1. Embora TERT polimeriza DNA oligospermia como um componente da telomerase, as análises filogenéticas e estruturais indicam que TERT está intimamente relacionado com a polimerase de RNA-dependente do RNA viral (RdRPs), bem como viral transcriptase reversa e compartilha os domínios com Estes polymerases2,3,4. RdRP é a enzima que gera a cadeia de RNA complementar para um modelo de RNA. A enzima é codificada não só em vírus, mas também em organismos-modelo, tais como a planta, o fermento e o worm, e síntese de RNA double-stranded por RdRP contribui para transcricional e pós-transcricional silenciamento nestes organismos5,6 . Embora RdRP humano tinha desaparecido há muito tempo, encontramos a RdRP atividade em TERT humana em 20097.
Nós primeiro confirmou a RdRP atividade de TERT com proteína recombinante7, em seguida, estabeleceu um ensaio sensível em vitro para detectar atividade RdRP de endógena TERT8. Aqui, demonstramos o em vitro RdRP ensaio (ensaio de IP-RdRP) para TERT endógena. Este método começa com imunoprecipitação (IP) de TERT endógena e é seguido por em vitro RdRP reação, na qual ribonucleotídeos radioactivos são incorporados em vertentes de RNA nascentes.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin mixed solution</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&amp;bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&amp;bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use fresh RI for the assay</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, deionized</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>EX-135</td><td>For step B)</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., KUBOTA</td><td>3740</td><td>For step 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>MX-305</td><td>For step 6.5</td></tr><tr><td>Cooled incubator</td><td>e.g., Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Set a rotary shaker inside</td></tr><tr><td>Rotary shaker</td><td>e.g., TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Cooled incubator&amp;nbsp;</td><td>e.g., TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>e.g., TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Block incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) é a subunidade catalítica da telomerase, e se alonga o telômero através da atividade da DNA polimerase RNA-dependente. Embora TERT é nomeado como um transcriptase reversa, análises estruturais e filogenéticas de TERT demonstram que TERT é um membro dos polymerases destros e refere-se à polimerase de RNA-dependente do RNA viral (RdRPs) bem como viral transcriptase reversa. Em primeiro lugar identificamos RdRP atividade de TERT humana que gera o RNA complementar suporta um modelo de RNA não-codificante e contribui para RNA silenciar em células cancerosas. Para analisar essa atividade enzimática não-canônicos, nós desenvolvido RdRP ensaio com terc recombinante em 2009, posteriormente, estabelecido em vitro RdRP ensaio para TERT endógena. Este manuscrito, descrevemos o último método. Brevemente, imunocomplexos TERT são isolados de células e incubados com modelo de RNA e rNTPs incluindo rNTP radioativo para reação RdRP. Para eliminar o single-stranded do RNA, produtos de reacção são tratados com RNase I e os produtos finais são analisados com eletroforese em gel de poliacrilamida. Radiolabeled RdRP produtos podem ser detectados por autoradiografia após exposição durante a noite.

Com o modelo recomendado de RNA, radioativo RdRP produtos são observados entre 20 a 30 nucleotídeos (nt), especificamente em células HeLa na fase mitótica após a exposição durante a noite (figura 1A). Normalmente, a intensidade do sinal dos produtos RdRP demonstra dois picos que são posicionados em torno de 25 nt e 30 nt em consonância com a distribuição de tamanho dos produtos confirmado pela próxima geração de sequenciamento9. Em contraste com células mitóticas, células HeLa sem sincronização demonstram quase ausência dos produtos radioactivos nt 20 – 30. Oval de sinais, que são colocados abaixo de 20 nt em todas as amostras, são inespecíficas trações.
No caso de que há apenas um produto nt ~ 30 com sinal fraco em células mitóticas HeLa, indica que a reação de RdRP não correu bem. Por exemplo, se MNase tratamento é realizado aproximadamente e inadequadamente, a intensidade de sinal em HeLa mitótica células diminui significativamente (figura 1B). RdRP reação realizada com solução antiga HMD também reduz os produtos (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Figura 1 : Representante RdRP produtos de TERT endógena em células mitóticas HeLa. (A) três resultados representativos do IP-RdRP ensaio em células HeLa tratadocom com nocodazole (manipulado) ou DMSO (unmanipulated). O 34 quimicamente sintetizado nt RNA foi usado como um modelo. (B) IP-RdRP ensaio em células HeLa mitóticas realizadas com tratamento inadequado de MNase. (C) IP-RdRP ensaio em células HeLa mitóticas realizada com solução HMD fresca ou velha. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U / µ l</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuclease micrococcal Buffer, 10 x</td>
			<td>8 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td>Μ L 51</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: MNase componente de mistura de reação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>CAMARADAS, 0,07% (wt/vol)</td>
			<td>6 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução HMD</td>
			<td>2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80mm</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibidor de RNase, 40 U / µ l</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: RdRP componente de mistura de reação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribonuclease RNase ONE, 10 U / µ l</td>
			<td>0,2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amortecedor da reação, 10 x</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td>159.8 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Componente de mistura de reação Ribonuclease.

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) sintetiza DNA oligospermia, não só mas também double-stranded do RNA através da atividade da RNA polimerase RNA-dependente. Aqui, descrevemos um ensaio recém-criada para detectar atividade de RNA polimerase RNA-dependente de TERT endógena.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K visualizações.  National Cancer Center Research Institute. Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) sintetiza DNA oligospermia, não só mas também double-stranded do RNA através da atividade da RNA polimerase RNA-dependente. Aqui, descrevemos um ensaio recém-criada para detectar atividade de RNA polimerase RNA-dependente de TERT endógena.

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MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Medicina

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Bioquímica

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Pesquisa do câncer

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Ambiente

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Genética

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação precisa do comprimento dos telômeros em estudos populacionais humanos

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: explorando o impacto do trauma no envelhecimento celular

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Medição quantitativa multiplex monocromática do comprimento do telômero do PCR 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Quantificando o comprimento dos telômeros usando detecção de quimioluminescência não radioativa

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Autor em destaque: Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento dos telômeros TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Resumo

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Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

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Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR

Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

Medição quantitativa multiplex monocromática do comprimento do telômero do PCR

Medição quantitativa multiplex monocromática do comprimento do telômero do PCR

Medição quantitativa multiplex monocromática do comprimento do telômero do PCR

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG