Há mais de 100 modificações distintas de RNA, dois terços das quais são metilações. Este protocolo fornece um método para análise sensível e precisa da atividade do autor da metilação RNA. Esta técnica de fácil utilização nos permite quantificar e visualizar RNA metilado sem o uso de anticorpos, que são comumente propensos a artefatos.
Demonstrando o procedimento será Samantha Shelton, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, configure o ensaio de metiltransferase RNA de 100 microliter em um tubo de 1,5 mililitro no gelo, conforme descrito no protocolo de texto. Vórtice o tubo para misturar completamente, e centrífuga a 200 vezes g por cinco segundos para coletar a solução na parte inferior do tubo.
Incubar o tubo a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, limpe a reação usando a purificação da coluna, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar a contagem de cintilação líquida, configure o rack de contagem de cintilação com um frasco por amostra, um frasco para medição de fundo e um frasco para o teste de deslizamento.
Encha os frascos com cinco mililitros de solução de contagem de cintilação. Adicione 10 microliters de cada amostra de RNA radioativa elucida em um frasco. Aperte a tampa e misture delicadamente.
Para preparar os frascos de teste de deslizamento, esfregue completamente os cotonetes de algodão em todas as superfícies e equipamentos utilizados durante o procedimento. Adicione esses cotonetes aos frascos cheios de solução de cintilação e aperte a tampa. Para executar as amostras no balcão de cintilação, abra o capô do balcão, insira o rack na máquina e feche o capô.
Selecione Contagem de Rack Único. Escolha selecionar programa de usuário. Selecione ou crie um programa que mede o trítio por 60 segundos e bata no Rack de Contagem.
Repita a contagem de cintilação três vezes. Depois disso, prepare e re-execute um gel de poliacrilamida de ureia, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira 20 microliters de material RNA radioativo em um novo tubo de 1,5 mililitro contendo 20 microliters de tampão de carregamento de gel 2X.
Depois de preparar a escada, incubar as amostras a 70 graus Celsius por 15 minutos. Lave os poços do gel mais uma vez imediatamente antes do carregamento da amostra por tampão de tubulação dos tanques de gel para baixo nos poços do gel. Em seguida, carregue 20 microliters da escada preparada, 20 microliters das amostras e 20 microliters de tampão de carregamento de gel 1X nas pistas do gel.
Execute o gel a 100 volts por 60 a 180 minutos, dependendo da porcentagem de poliacrilamida. Uma vez que o gel tenha terminado de funcionar, remova o gel do e coloque-o em uma caixa contendo 50 mililitros de tampão 1X TBE com cinco microliters de mancha de gel de ácido nucleico ultrasensível. Incubar em um roqueiro por cinco minutos para manchar o RNA.
Depois disso, retire cuidadosamente o gel da caixa, e coloque-o no transilluminador UV do sistema de imagem gel com os poços para cima e a escada à esquerda. Concentre a câmera no gel, ligue a luz UV e tire uma imagem do gel. Em seguida, desligue a exposição uv e salve a imagem como um arquivo TIFF.
Coloque o gel de volta na caixa, remova o TBE e fixe o gel com 50 mililitros de solução fixa em um roqueiro em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, mova suavemente o gel para uma caixa preta fresca contendo 25 mililitros da solução de melhoria autoradiografia. Incubar no roqueiro à temperatura ambiente por 30 minutos.
Levante suavemente o gel, e coloque-o de brumão sobre uma folha de plástico com os poços para cima e a escada do lado direito. Coloque duas folhas de papel cromatografia na parte de trás do gel, e vire toda a pilha. Pré-aqueça o secador de gel a 80 graus Celsius.
Mova a tampa de plástico na secadora de gel para trás. Insira toda a pilha sob a tampa de plástico e mova a tampa de plástico de volta para baixo para criar uma vedação. Seque o gel a 80 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, desligue o secador de gel e retire suavemente a pilha. Remova o envoltório e o segundo papel cromatógrafo. Grave o papel cromatógrafo restante com o gel seco em um autordiograma.
Em uma sala escura, adicione uma folha de filme autordiografia. Armazene o a 80 graus Celsius negativos, e desenvolva o filme no momento apropriado, dependendo da intensidade do sinal. Uma vez que o filme é desenvolvido, coloque-o em cima do e use um marcador de laboratório para marcar cuidadosamente as quatro bordas do gel, cada poço, e a posição dos corantes XC e BB.
Escaneie o filme com uma resolução de 300 ou 600 pixels por polegada e salve a imagem como um arquivo TIFF. Neste estudo, demonstra-se um ensaio sem anticorpos para analisar a atividade de metiltransferase de RNA. Uma corrida típica de uma reação de transcrição in vitro com a polimerase T7 RNA do RNA nuclear 7SK mostra RNA relativamente curto e altamente estruturado.
Existem várias bandas indesejadas, mais curtas e maiores que 7SK, provavelmente resultantes de eventos aleatórios de iniciação transcricional ou término. Por causa disso, a purificação de gel após a reação de transcrição in vitro é importante para obter uma amostra de RNA limpa. Neste ponto, o RNA de interesse pode ser identificado por sua localização em relação à escada e purificado por purificação de gel.
Um ensaio representativo de metiltransferase de RNA utilizando o limite inferior das concentrações recomendadas de RNA e proteínas é mostrado aqui. Este ensaio permite tanto os resultados quantitativos das contagens de cintilação, quanto os resultados qualitativos do autordiograma. Aqui, um RNA metiltransferase conhecido pelo metilato 7SK é mostrado ser capaz de também metilar U6. Além disso, como mostrado recentemente para 7SK, a ligação de histone H4 ao MePCE também inibe a metilação U6.
Isso pode ser observado tanto na contagem de cintilação quanto no autordiograma, mostrando a robustez deste protocolo. O RNA é suscetível à degradação, por isso, certifique-se de usar reagentes livres de RNase e limpar completamente todas as superfícies e equipamentos. O RNA radioativo obtido a partir deste ensaio de metiltransferase pode ser usado diretamente para avaliar a atividade de demetilase RNA ou atividade de ligação de RNA por ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, por exemplo.
Este método permite que os pesquisadores testem o efeito de diferentes fatores sobre a atividade de metiltransferase de RNA, incluindo mutações pontuais e tratamentos inibidores de pequenas moléculas. Este método utiliza material radioativo, por isso certifique-se de usar o EPI apropriado, e tenha cuidado durante o manuseio e descarte de materiais radioativos.
