O objetivo geral deste protocolo é caracterizar bioquimicamente a atividade de transferência de tRNA-Isopentenyl In Vitro. Este método é útil para a detecção in vitro e caracterização da atividade de transferência tRNA-isopentenyl de enzimas recombinantes purificadas. A principal vantagem desta técnica é que é um ensaio simples e direto usado para detectar uma modificação covalente de RNA.
Embora este método forneça insights sobre a atividade de transferência isoolínica tRNA, ele é potencialmente adaptável para a caracterização bioquímica de enzimas modificadoras de RNA ou RNA. O primeiro passo neste procedimento é limpar completamente as placas de vidro que serão usadas para lançar o gel. Lave as placas com água e sabão, enxágue bem com água desionizada e, em seguida, limpe as placas com isopropanol e lenços sem fiapos.
Em seguida, monte as placas e espaçadores. Misture os seguintes reagentes para fazer um 100 mililitros 20% de acrilamida, 7,5 ureia molar, 1x gel TBE. 80 mililitros de concentrado de gel de ureia, 10 mililitros de diluente de gel de ureia e 10 mililitros de tampão de gel de ureia.
Adicione 40 microliters de T-med e 800 microliters de persulfito de amônio recém-preparado 10% à mistura. Desenhe a solução de gel em uma grande seringa e dispense a solução de gel entre as placas de vidro que batem no vidro enquanto dispensa a solução para evitar a formação de bolhas. Deixe o gel solidificar à temperatura ambiente por 30 minutos.
Depois que o gel se solidificar, plante o gel em um aparelho de gel vertical. Encha as câmaras tampão superior e inferior com 1x TBE. Duas horas antes de carregar o gel, pré-execute o gel a 20 miliamperes por duas horas para permitir que o limite do buffer saia dos menores oligonucleotídeos.
Prepare cada reação para o ensaio de isoocultura de RNA em um volume final de 17 microliters. Adicione a cada tubo 50 mililitros Tris-HCl, pH 7.2, 1,2 mililitro ATP, 5,8 mililitro de magnésio, 0,2 mililitro DMAPP, 10 unidades Inibidor RNase, 40, 000 CPM internamente 32P rotulado RNA, 5.3 micromolar Mod5, e 1,2 milimolar 2-mercaptool. Incubar as reações a 37 graus Celsius por uma hora.
Após uma hora, o etanol precipita o RNase usando 2,5 volume de 100% etanol e 1/10 de volume de 3,5 acetato de sódio molar pH 5,5, e colocá-lo negativo 20 graus Celsius por uma hora durante a noite. Em seguida, centrifugar as amostras de RNA a 15, 400 g's e 4 graus Celsius por 20 minutos. Remova cuidadosamente o supernascer e lave cada pelota de RNA com 500 microliters de 70% de etanol.
Centrifugar as amostras a 15,400 g's e 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernasce e o ar seque as pelotas de RNA por 15 minutos ou até que todo o etanol tenha evaporado. Em seguida, suspenda cada pelota de RNA em 10 microlitres de oito ureias molares.
Adicione 150 unidades de RNase T1 a cada amostra e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione dois microliters de 6x tampão de carga a cada amostra. Carregue 10 microliters de cada amostra de RNA em um pré-executado, 20% poliacrilamida, 7,5 gel de ureia molar.
Execute o gel a 25 miliamperes por duas horas. Depois de duas horas, pare a eletroforese e remova o gel do aparelho. Quebre o selo entre as duas placas de vidro e remova cuidadosamente uma das placas de vidro com o gel restante em qualquer placa.
Coloque uma camada de plástico sobre o gel e exponha em uma tela de fósforo por três horas. Este protocolo detecta de forma confiável a isoocização de resíduos de tRNA canônicos e não triônicos modificados pelo S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. Neste exemplo, o tRNA de tirasina foi rotulado internamente com 32P-adenosina e Mod5 foi incubado com RNase na presença ou ausência de DMAPP.
Os RNAs foram digeridos com RNase T1 e resolvidos em um gel de poliacrilamida desnaturação. Mod5 modifica o resíduo previsto na presença de DMAPP e indicado pelo nucleotídeo deslocado 10, adenosina tripla contendo fragmento nas posições nucleosídeos 36 a 38 contêm fragmento no tRNA de tirasina. A adenosina modificada 37 reside é indicada com um asterisco.
Da mesma forma, quando o tRNA serino é incubado com Mod5 e DMAPP, observa-se uma mudança completa da adenosina tripla de nucleotídeo contendo fragmento na posição nucleosídea 36 a 38. Curiosamente, observa-se uma mudança parcial de um fragmento de sete nucleotídeos que não contém a tríplice adenosina contendo fragmento nas posições nucleosídeos 36 a 38, sugerindo que a adenosina tripla contendo fragmento na posição nucleosídea 36 a 38 sequência e estrutura pode não ser necessária para a atividade in vitro mod5. Uma vez dominada, essa técnica levará de dois, quatro a seis horas por dia, se for realizada corretamente.
Bem, ao tentar este procedimento é importante lembrar de manter e monitorar a integridade do RNA, pois a degradação do RNA pode afetar a modificação do RNA e confundir a interpretação dos dados. Seguindo este procedimento estudos mutacionais usando sua enzima de interesse, poderia ser feito para determinar resíduos ou domínios específicos necessários para a atividade enzimática. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia do RNA, para dizer atividades de transferência de tRNA-isoentnol de enzimas procarióticas e eucarióticas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o protocolo para a detecção da atividade de transferência isoentada da sua enzima de interesse. Não se esqueça que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso e precauções como usar EPI adequado, usar blindagem adequada e descartar a radioatividade adequadamente deve ser sempre tomada durante a realização deste procedimento.
