O objetivo geral deste procedimento é observar o impacto do gene SOX5 na complexidade dos neurônios de arborização dendrítica durante o desenvolvimento neuronal em Drosophila. Este método pode ajudar a estudar a morfogênese de neurodndritos, e a função genética no desenvolvimento do sistema nervoso, para entender melhor os genes da doença neurodegenerativa. Em última análise, esta técnica fornece uma análise quantitativa da complexidade dos dendritos, que pode ser usada em muitos tipos diferentes de neurodíritos.
As implicações dessa técnica se estendem para o mecanismo genético da doença neurodegenerativa, pois a mutação é a chave para entender a função genética. Cruzes de configuração de UAS-GFP;ppk-GAL4 com a cepa UAS-Sox102F-RNAi voa ou controles W118. Cultura as moscas sob condições padrão a 25 graus Celsius.
Em cerca de cinco a seis dias, use fórceps para coletar cuidadosamente a terceira larva instar para dissecção. Coloque uma larva em uma placa de dissecção feita de base de elastômero de silício, e uma placa de Petri de cultura tecidual. Em seguida, coloque o prato sob o microscópio de dissecção.
Agora fixe a cauda da larva para expor a linha média. Em seguida, fixar os ganchos da boca larva para que o lado dorsal da larva esteja para cima. Agora adicione 200 microliters de PBS ao prato para imergir a larva na solução.
Em seguida, corte a cauda e a boca da larva com pequenas incisões. Em seguida, corte a larva aberta ao longo da linha dorsal e entre as duas traqueias, indo de caudal para rostral. Em seguida, coloque um alfinete em cada um dos quatro cantos do corpo para que o corpo fique plano.
Agora conserte a parede do corpo da larva em 4% de PFA por 25 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave a larva com PBS três vezes por cinco minutos por lavagem. Após as lavagens, remova os pinos e transfira o tecido para uma lâmina de vidro.
Em seguida, mergulhe o tecido em meio de montagem antifado e monte-o com um deslizamento de tampa. Deixe o tecido montado secar por uma hora antes de selar o deslizamento da tampa com polimento das unhas. Armazene esses slides no escuro a quatro graus Celsius.
Capture imagens da série Z com um microscópio confocal usando um objetivo de 20X. Primeiro, defina o alcance dos passos z para incluir todos os neurônios da DA na parede do corpo da larva, e defina o tamanho do passo para meio micrômetro. Em seguida, armazene as imagens como arquivos TIF ou ND2 para processamento.
Em seguida, avalie o número e a morfologia dos dendritos nos neurônios da promotoria. Comece avaliando seus comprimentos. Primeiro, em Fiji ImageJ, divida as imagens em canais separados, se necessário.
Apenas o canal GFP precisa ser avaliado. Em seguida, faça uma projeção z. Na nova janela, selecione a intensidade máxima para o tipo de projeção e escolha as fatias de partida e parada.
Em seguida, clique em OK para produzir uma imagem de projeção z com projeções claras de dendrite. Agora rastreie os neurites usando a ferramenta plug-in. Primeiro, vá para a soma do neurônio de interesse e clique onde um dendrite emerge do corpo celular.
Em seguida, clique na ponta deste dendrite. Se a linha azul que liga os dois pontos correr o comprimento do neurite, pressione Y para sim. Em seguida, se esta linha se encaixa no caminho completo do neurite, clique em caminho completo.
Se a linha não se encaixar no caminho, clique em pontos mais ao longo deste neurite para dobrar o caminho em vários segmentos de linha que se encaixarão no comprimento do neurite. Em seguida, clique em caminho completo e proceda com a marcação do caminho para o próximo neurite. Depois de completar todos os caminhos de rastreamento, selecione a opção Analisar caminhos, medir caminhos para exportar os caminhos para um arquivo CSV.
Use esses dados para calcular e o valor médio dos comprimentos do caminho para análise. Em seguida, calcule a área da superfície do neurônio. Primeiro, selecione a ferramenta de desenho manual livre na janela Fiji ImageJ.
Em seguida, conecte os pontos finais do neurônio de interesse. Em seguida, selecione a opção Medir na janela Analisar. O resultado aparece em uma nova caixa com o valor para a área selecionada.
Copie esse valor para o software de análise de dados. Finalmente, calcule o número total de ramos usando o plugin Analyze Skeletonized Paths. Os dendritos dos neurônios da DA foram rotulados por co-superexpressão GFP em suas arbors soma e dendrito para análise de imagens de floresnce GFP.
A morfologia dos dendritos foi imagem usando um microscópio confocal invertido. Os dendritos dos neurônios da promotoria foram rastreados como descrito. O arquivo foi usado para estimar o comprimento do dendrite.
O silenciamento de Sox102F em neurônios da na terceira larva instar levou a uma redução significativa no número total de dendritos com cerca de metade do comprimento do ramo e com uma estrutura mais simples, mostrando apenas metade do número de ramos. Logicamente, isso levou à redução da área da superfície da árvore. Este protocolo fornece um método rápido para avaliar o desenvolvimento de neurônios sensoriais da DA.
Ao tentar este procedimento, certifique-se de tirar um grande número de imagens de cada grupo de neurônios da promotoria para obter uma boa cobertura. Após este procedimento, outros métodos como a análise de dendrite podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre o desenvolvimento dendrite. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica tem ajudado pesquisadores do campo das neurociências a fazer inferências em doenças neurodegenerativas, como o Alzheimer usando sistemas modelo.
