המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעה של הגן SOX5 על המורכבות של נוירונים arborization דנדריטי במהלך ההתפתחות העצבית ב Drosophila. שיטה זו יכולה לעזור ללמוד מורפוגנזה של נוירו-דנדריטים, ואת תפקוד הגנים בהתפתחות מערכת העצבים, כדי להבין טוב יותר גנים של מחלות נוירודגנרטיביות. בסופו של דבר טכניקה זו מספקת ניתוח כמותי של מורכבות דנדריטים, אשר ניתן להשתמש בהם בסוגים רבים ושונים של נוירו-דנדריטים.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון מנגנון גנטי של מחלה נוירו-ניוונית, משום שהמוטציה מחזיקה במפתח להבנת תפקוד הגנים. צלבים מוגדרים של UAS-GFP;ppk-GAL4 עם זבובי זן UAS-Sox102F-RNAi או פקדי W118. תרבות הזבובים בתנאים סטנדרטיים ב 25 מעלות צלזיוס.
בעוד חמישה עד שישה ימים, השתמש במטסים כדי לאסוף בזהירות את הזחלים השלישיים של instar לצורך ניתוח. מניחים זחל בצלחת ניתוח עשוי בסיס אלסטומר סיליקון, וצלחת פטרי רקמות תרבות. לאחר מכן מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח.
עכשיו תצמיד את זנב הזחל כדי לחשוף את קו האמצע. ואז להצמיד את הזחלים הפה ווים כך הצד הגבי של הזחל הוא למעלה. עכשיו להוסיף 200 microliters של PBS לצלחת כדי לטבול את הזחל בתסרון.
לאחר מכן, חותכים את הזנב והפה של הזחל עם חתכים קטנים. ואז לחתוך את הזחל פתוח לאורך קו האמצע הגבי ובין שתי קנה, הולך מן caudal כדי rostral. ואז למקם סיכה בכל אחת מארבע הפינות של הגוף כך הגוף שוכב שטוח.
עכשיו לתקן את קיר גוף הזחל בארבעה אחוזים PFA במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את הזחל עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה, להסיר את הפינים ולהעביר את הרקמה על מגלשת זכוכית.
ואז לטבול את הרקמה במדיום הרכבה antifade, ולהוות אותו עם להחליק כיסוי. אפשר לרקמה המותקנת להתייבש במשך שעה לפני האיטום על החלקת המכסה עם לק ציפורניים. אחסן את השקופיות האלה בחושך בארבע מעלות צלזיוס.
לכוד תמונות מסדרת z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל באמצעות מטרה של פי 20. ראשית, להגדיר את הטווח של z-צעדים לכלול את כל הנוירונים DA בקיר גוף הזחל, ולהגדיר את גודל הצעד לחצי מיקרומטר. לאחר מכן אחסן את התמונות כקבצי TIF או ND2 לעיבוד.
לאחר מכן, להעריך את המספר והמורפולוגיה של הדנדריטים על הנוירונים DA. התחל בהערכת אורכיהם. ראשית, בפיג'י ImageJ, לפצל את התמונות לערוצים נפרדים במידת הצורך.
יש להעריך רק את ערוץ GFP. לאחר מכן, לעשות z-הקרנה. בחלון החדש, בחרו בעוצמה מרבית לסוג ההקרנה ובחרו בפרוסות ההתחלה והעצור.
לאחר מכן לחצו על הלחצן 'אשר' להפקת תמונת z-projection עם הקרנות דנדריט ברורות. עכשיו תאתר את הניריטים באמצעות כלי התוסף. ראשית, ללכת לסומה של הנוירון של עניין ולחץ שבו דנדריט אחד יוצא מגוף התא.
לאחר מכן לחץ בקצה של דנדריט זה. אם הקו הכחול המחבר בין שתי הנקודות פועל לאורך הנויריט, הקש Y עבור כן. לאחר מכן, אם קו זה מתאים לנתיב המלא של הנויריט, לחץ על נתיב שלם.
אם הקו אינו מתאים לנתיב, לחץ על נקודות בהמשך נויריט זה כדי לכופף את הנתיב למקטעי קו מרובים שיתאימו לאורך הנויריט. לאחר מכן, לחץ על נתיב שלם והמשך בסימון הנתיב עבור הנויריט הבא. לאחר השלמת כל נתיבי העקיבה, בחרו באפשרות 'ניתוח', 'מדוד נתיבים' לייצוא הנתיבים לקובץ CSV.
השתמש בנתונים אלה כדי לחשב ערך ממוצע של אורכי נתיב לניתוח. לאחר מכן, לחשב את שטח הפנים של הנוירון. ראשית, בחר את כלי ציור היד החופשית מחלון פיג'י ImageJ.
לאחר מכן, לחבר את נקודות הקצה של הנוירון של עניין. לאחר מכן, בחרו באפשרות 'מדידה' מהחלון 'נתח'. התוצאה מופיעה בתיבה חדשה עם הערך עבור האזור שנבחר.
העתק ערך זה לתוכנה לניתוח נתונים. לבסוף, לחשב את המספר הכולל של ענפים באמצעות תוסף ניתוח נתיבים שלדים. הדנדריטים של נוירונים DA תויגו על ידי שיתוף overexpressing GFP שלהם סומא דנדריט ארבורים לניתוח הדמיה פלורסנס GFP.
המורפולוגיה של דנדריטים תצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל הפוך. הדנדריטים של תאי העצב של התובע המחוזי אותרו כמתואר. הקובץ שימש להערכת אורך הנדריט.
השתק של Sox102F בנוירונים DA בזחל instar השלישי הוביל לירידה משמעותית במספר הכולל של דנדריטים עם כמחצית אורך הענף עם מבנה פשוט יותר, מראה רק מחצית ממספר הענפים. מבחינה הגיונית, זה הוביל לירידה בשטח הפנים של הארבור. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה להערכת התפתחות של נוירונים חושיים DA.
בעת ניסיון הליך זה, הקפד לקחת מספר רב של תמונות של כל קבוצה של נוירונים DA כדי לקבל כיסוי טוב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח דנדריט על מנת לענות על שאלות נוספות על התפתחות דנדריט. מאז התפתחותה, טכניקה זו סייעה לחוקרים בתחום מדעי המוח להסיק מסקנות למחלות ניווניות כגון אלצהיימר באמצעות מערכות מודל.
