이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila에 있는 신경 발달 도중 수지상 식소화 신경의 복잡성에 SOX5 유전자의 충격을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신경-모덴트라이트의 형태 발생, 그리고 신경계 의 발달에 있는 유전자 기능을 연구하는 것을 도울 수 있습니다, 신경 퇴행성 질병 유전자를 더 잘 이해하기 위하여. 궁극적으로이 기술은 많은 다른 유형의 신경 모들라이트에서 사용할 수있는 모선반 복잡성의 정량적 분석을 제공합니다.
돌연변이가 유전자 기능을 이해하는 열쇠를 가지고 있기 때문에이 기술의 의미는 신경 퇴행성 질환의 유전 메커니즘으로 확장됩니다. UAS-Sox102F-RNAi 스트레인 플라이 또는 W118 컨트롤을 갖춘 UAS-GFP;ppk-GAL4의 셋업 크로스. 섭씨 25도에서 표준 조건하에서 날아다니는 문화를 배양합니다.
약 5~6일 후에 는 집게를 사용하여 제3의 항성 애벌레를 조심스럽게 수집합니다. 실리콘 엘라스토머 베이스로 만든 해부 접시에 애벌레를 놓고 조직 배양 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다.
이제 유충의 꼬리를 고정하여 중간선을 노출합니다. 그런 다음 유충의 등쪽이 위로 올라가면 애벌레 입 후크를 고정하십시오. 이제 요리에 PBS 200 마이크로리터를 추가하여 애벌레를 용액에 담그게 합니다.
다음으로, 작은 절개로 애벌레의 꼬리와 입을 잘라냅니다. 그런 다음 외중간선을 따라 두 기관 사이에 있는 애벌레를 잘라서 코덜에서 로스트랄로 이동합니다. 그런 다음 몸의 네 모서리 각각에 핀을 배치하여 몸이 평평하게 놓습니다.
이제 실온에서 25 분 동안 4 % PFA로 유충 바디 벽을 수정합니다. 그런 다음 세척당 5분간 PBS로 애벌레를 세 번 씻습니다. 세제 후 핀을 제거하고 조직을 유리 슬라이드로 옮기습니다.
그런 다음 티슈를 페이드 마운팅 배지에 담그고 커버 슬립으로 장착합니다. 장착 된 조직이 손톱 광택으로 덮개 슬립에 밀봉하기 전에 한 시간 동안 공기 건조를 허용합니다. 이 슬라이드를 어둠 속에서 섭씨 4도에 저장합니다.
20X 목표를 사용하여 공초점 현미경으로 z 시리즈 이미지를 캡처합니다. 먼저, 애벌레 바디 월내의 모든 DA 뉴런을 포함하도록 z 단계의 범위를 설정하고 단계 크기를 반 마이크로미터로 설정한다. 그런 다음 처리를 위해 이미지를 TIF 또는 ND2 파일로 저장합니다.
다음으로, DA 뉴런의 원점의 수와 형태를 평가한다. 먼저 길이를 평가합니다. 첫째, 피지 ImageJ에서 필요한 경우 이미지를 별도의 채널로 분할합니다.
GFP 채널만 평가해야 합니다. 다음으로 z 프로젝션을 만듭니다. 새 창에서 프로젝션 유형에 대한 최대 강도를 선택하고 시작 및 중지 조각을 선택합니다.
그런 다음 확인을 클릭하여 선명한 선단 투영 프로젝션이 있는 z 프로젝션 이미지를 생성합니다. 이제 플러그인 도구를 사용하여 중성염을 추적합니다. 첫째, 관심의 뉴런의 소마로 이동하고 한 원더라이트가 세포 체에서 나오는 곳을 클릭합니다.
그런 다음이 수상자의 끝을 클릭합니다. 두 점을 연결하는 파란색 선이 신경의 길이를 실행하면 Y를 눌러 예합니다. 그런 다음 이 선이 중성자의 전체 경로에 맞는 경우 전체 경로를 클릭합니다.
선이 경로에 맞지 않으면 이 중성염을 따라 더 많은 점을 클릭하여 경로를 중성기 길이에 맞는 여러 선 세그먼트로 구부립니다. 그런 다음 전체 경로를 클릭하고 다음 중성기의 경로를 표시합니다. 모든 추적 경로를 완료한 후 해석, 측정 경로 옵션을 선택하여 경로를 CSV 파일로 내보냅니다.
이 데이터를 사용하여 분석을 위해 경로 길이의 평균 값과 계산합니다. 다음으로, 뉴런의 표면적을 계산합니다. 먼저 피지 ImageJ 창에서 무료 핸드 드로잉 도구를 선택합니다.
그런 다음 관심 있는 뉴런의 끝점을 연결합니다. 그런 다음 분석 창에서 측정 옵션을 선택합니다. 결과는 선택한 영역에 대한 값이 있는 새 상자에 나타납니다.
이 값을 데이터 분석 소프트웨어에 복사합니다. 마지막으로, 스켈레톤 경로 분석 플러그인을 사용하여 총 지점 수를 계산합니다. DA 뉴런의 모데라이트는 GFP 플로레스시벤스 이미징 분석을 위해 소마와 선점 식에서 GFP를 공동 발현함으로써 표지되었습니다.
원점의 형태는 반전된 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. DA 뉴런의 수상자는 설명된 대로 추적되었다. 이 파일은 수상자 길이를 추정하는 데 사용되었습니다.
제3항애벌레에서 DA 뉴런에서 Sox102F의 침묵은 가지 길이의 약 절반을 가진 총 원더라이트 의 총 수의 현저한 감소로 이어졌으며, 이는 가지의 절반만을 보여주는 것입니다. 논리적으로, 이것은 식목 표면적감소로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 DA 감각 뉴런의 개발을 평가하는 빠른 방법을 제공합니다.
이 절차를 시도하는 동안, 좋은 범위를 얻기 위해 DA 뉴런의 각 그룹의 이미지의 충분한 수를 가지고해야합니다. 이 절차에 따라, 원회 분석과 같은 다른 방법은 원원지 개발에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 이후, 이 기술은 신경 과학 분야의 연구원들이 모델 시스템을 사용하는 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환으로 추론하는 데 도움이 되었습니다.
