L'obiettivo generale di questa procedura è quello di osservare l'impatto del gene SOX5 sulla complessità dei neuroni di arborizzazione dendritica durante lo sviluppo neuronale in Drosophila. Questo metodo può aiutare a studiare la morfogenesi dei neuro-dendriti e la funzione genica nello sviluppo del sistema nervoso, per comprendere meglio i geni delle malattie neurodegenerative. In definitiva questa tecnica fornisce un'analisi quantitativa della complessità dei dendriti, che può essere utilizzata in molti tipi diversi di neuro-dendriti.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso il meccanismo genetico della malattia neurodegenerativa, perché la mutazione detiene la chiave per comprendere la funzione genica. Croci di configurazione di UAS-GFP;ppk-GAL4 con i moscerini di deformazione UAS-Sox102F-RNAi o i controlli W118. Cultura le mosche in condizioni standard a 25 gradi Celsius.
In circa cinque o sei giorni, utilizzare le forcep per raccogliere attentamente le terze larve instar per la dissezione. Metti una larva in una piastra di dissezione fatta di base di elastomero di silicio e una piastra di Petri per la coltura tissutale. Quindi posizionare il piatto al microscopio a dissezione.
Ora inchiodare la coda della larva per esporre la linea mediana. Quindi pin la larva ganci bocca in modo che il lato dorsale della larva è in su. Ora aggiungi 200 microlitri di PBS al piatto per immergere la larva in soluzione.
Successivamente, tagliare la coda e la bocca della larva con piccole incisioni. Quindi tagliare la larva aperta lungo la linea mediana dorsale e tra le due trachee, andando dal caudale al rostrale. Quindi posizionare un perno in ciascuno dei quattro angoli del corpo in modo che il corpo giace piatto.
Ora fissare la parete corporea della larva in PFA al quattro% per 25 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare la larva con PBS tre volte per cinque minuti per lavaggio. Dopo i lavaggi, rimuovere i perni e trasferire il tessuto su uno scivolo di vetro.
Quindi immergere il tessuto nel mezzo di montaggio antifade e montarlo con uno scivolo di copertura. Lasciare asciugare ad aria il tessuto montato per un'ora prima di sigillare sul coperchio scivolare con smalto per unghie. Conservare queste diapositive al buio a quattro gradi Celsius.
Cattura immagini della serie Z con un microscopio confocale usando un obiettivo 20X. In primo luogo, impostare l'intervallo dei passaggi z per includere tutti i neuroni DA nella parete del corpo della larva e impostare la dimensione del passo su un mezzo micrometro. Quindi archiviare le immagini come file TIF o ND2 per l'elaborazione.
Quindi, valutare il numero e la morfologia dei dendriti sui neuroni DA. Inizia con la valutazione delle loro lunghezze. In primo luogo, in Fiji ImageJ, dividere le immagini in canali separati, se necessario.
Solo il canale GFP deve essere valutato. Quindi, fai una proiezione z. Nella nuova finestra selezionare intensità massima per il tipo di proiezione e scegliere le sezioni iniziale e di arresto.
Quindi fare clic su OK per produrre un'immagine di proiezione Z con proiezioni di dendrite chiare. Ora traccia i neuriti usando lo strumento plug-in. Per prima cosa, vai al soma del neurone di interesse e fai clic dove emerge una dendrite dal corpo cellulare.
Quindi fare clic sulla punta di questa dendrite. Se la linea blu che collega i due punti corre la lunghezza della neurite, premere Y per sì. Quindi, se questa linea si adatta al percorso completo della neurite, fare clic su percorso completo.
Se la linea non si adatta al tracciato, fate clic su punti più avanti lungo questa neurite per piegare il tracciato in più segmenti di linea che si adatteranno alla lunghezza della neurite. Quindi, fare clic su percorso completo e procedere con la marcatura del percorso per la neurite successiva. Dopo aver completato tutti i percorsi di tracciatura, selezionare l'opzione Analisi, Misura percorsi per esportare i percorsi in un file CSV.
Utilizzare questi dati per calcolare e il valore medio delle lunghezze dei tracciati per l'analisi. Quindi, calcola l'area di superficie del neurone. Per prima cosa, selezionare lo strumento di disegno a mano libera dalla finestra Fiji ImageJ.
Quindi, collegare i punti finali del neurone di interesse. Selezionare quindi l'opzione Misura dalla finestra Analizza. Il risultato viene visualizzato in una nuova casella con il valore dell'area selezionata.
Copiare questo valore nel software di analisi dei dati. Infine, calcola il numero totale di rami utilizzando il plug-in Analizza percorsi scheletrati. I dendriti dei neuroni DA sono stati etichettati da GFP co-sovraespressiva nei loro pergolati soma e dendrite per l'analisi dell'imaging di florescence GFP.
La morfologia dei dendriti è stata immagine usando un microscopio confocale invertito. I dendriti dei neuroni DA sono stati rintracciati come descritto. Il file è stato utilizzato per stimare la lunghezza della dendrite.
Il silenziamento di Sox102F nei neuroni DA nella terza larva instar ha portato a una significativa riduzione del numero totale di dendriti con circa la metà della lunghezza del ramo e con una struttura più semplice, mostrando solo la metà del numero di rami. Logicamente, ciò ha portato a una riduzione della superficie del pergolato. Questo protocollo fornisce un metodo rapido per valutare lo sviluppo dei neuroni sensoriali DA.
Durante il tentativo di questa procedura, assicurati di prendere un ampio numero di immagini di ogni gruppo di neuroni DA per ottenere una buona copertura. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi della dendrite per rispondere a ulteriori domande sullo sviluppo della dendrite. Fin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo delle neuroscienze a fare deduzioni in malattie neurodegenerative come l'Alzheimer usando sistemi modello.
