Este trabalho foi financiado pelo Canadian Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97774) e Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC, concessão nr: 480619). KS é um receptor de um Investigator Award KRESCENT Novo (um prêmio de conjunto da Kidney Foundation of Canada, Canadian Society Nephrology e Canadian Institute of Health Research) e um Prêmio Pesquisador precoce do Ministério de Ontário de Investigação e Inovação. FW é suportado por uma bolsa de Li Ka Shing.

1. Transformação de E. coli com o pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Preparar LB-Agar por dissolução de 2,5 g LB e 1,5 g Ágar em 100 ml dH 2 O. Autoclave e fresco para uma estimativa de 50-55 ° C, que, como regra geral, é quando o balão pode ser realizada confortavelmente. </li><li> Preparar Ampicilina stock (Amp) por dissolução de 50 mg / ml em dH 2 O. Filtro de seringa e congelar alíquotas não utilizadas. Adicionar 100 ul de estoque Amp (concentração final 50 ug / ml) à LB-Agar a partir de 1,1. Agite para misturar e despeje em pratos de 10 cm bacterianas (15-20 ml / prato). Permitir que a solidificar (15-30 min.) E armazenar as placas não utilizados invertida a 4 ° C durante 2-3 semanas. </li><li> Para transformar E. Coli, rapidamente descongelar uma aliquota de DH5a competentes em um banho de gelo. Adicionar 1 ul de DNA pGEXRhoA (G17A) diluída a 25-50 ng / uL. Flick o tubo para misturar e incubar em gelo durante 30 minutos. Choque térmico a 42 ° C durante 45 segundos e volte a colocar em gelo durante 2 minutos. Adicionar 900 e mu; L meio SOC e crescer durante uma hora a 37 ° C com agitação. </li><li> Espalhe 50-100 uL das bactérias transformadas numa placa de LB-Agar-Amp usando uma pipeta de Pasteur estéril dobrada. Incubar a placa lado direito para cima numa incubadora a 37 ° C durante 5 minutos e, em seguida, inverter e crescer durante a noite. </li><li> Uma única colónia irá ser escolhido a partir da placa para a preparação da proteína GST-tag (passo 2.1). Para uso futuro, as placas do envoltório e armazenar invertido a 4 ° C durante cerca de 3 semanas. Além disso, as unidades de bactérias podem ser preparadas para armazenamento mais prolongado por crescentes colónias individuais em 2 ml estéril LB Amp-durante a noite a 37 ° C com agitação. Misturar uma aliquota com glicerol a 80% estéril numa proporção de 1:1 e congelamento a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparação de contas (G17A) GST-RhoA <ol><li> Preparar LB pela adição de 25 g LB a 1 L dH 2 0 e da autoclavagem. Quando esfriar, adicione 50 Amp ul do estoque para 50 LB ml (50 mcg / ml concentração final). Inocular com uma col bem isoladoony de bactérias transformadas e crescer durante a noite a 37 ° C com agitação. Quando a densidade total (OD 600&gt; 1,0) diluir com 450 ml LB Amp e crescer durante mais 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Preparar uma solução-mãe 100 mM de isopropil BD-tiogalactopiranósido (IPTG) por dissolução de 0,238 g em 10 ml dH 2 O. Armazenar em alíquotas a -20 ° C. Induzir bactérias para produzir proteína Rho por adição de 500 ul de 100 mM IPTG a 500 cultura ml (uma concentração final de 100 uM). Reduzir a temperatura para 22-24 ° C e crescer durante ~ 16 horas h. </li><li> Girar cultura a 3600 g durante 10 minutos a 4 ° C. Se necessário, a 500 ml de cultura pode ser dividida em tubos de 50 ml de centrifugação. Congelar pelete (s) durante pelo menos 1 hora (ou, de preferência durante a noite) a -80 ° C. </li><li> Preparar tampão de lise 200 ml contendo 20 mM de HEPES (0,95 g) / pH 7,5; 150 mM de NaCl (1,75 g); 5 mM de MgCl2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Prepare soluções estoque de 1M DTT (1,542 g em 10 ml de dH2O) E 100 mM de PMSF (0,174 g/10 ml de EtOH). Para preparar + tampão de lise, suplemento de 10 ml com 1 mM de DTT (10 ul de estoque) e 1 mM de PMSF (100 uL de stock) e uma completa Mini comprimido inibidor da protease. </li><li> Trabalhando em gelo, adicionar 10 ml de tampão de lise + para os peletes a partir do passo 2.3. Ressuspender bem em vórtice suave e pipetagem. Evite a formação de espuma. Sonicar em gelo durante 1 minuto a configuração 4 com o pulso de 50%. Girar o lisado sonicada a 15.000-20.000 g durante 15 minutos a 4 ° C, e remover o sonicado clarificado (sobrenadante) a um tubo ml estéril tapado 15. </li><li> Preparar a Sepharose Glutationa suavemente a mistura do tubo original contendo uma lama de 75% e 335 uL de transferência para um tubo de 15 ml. Use uma ponta larga furo para pipetar contas. Adicionar 10 ml PBS frio, e gira a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de tampão de lise + às pérolas e girar como para lavagem anterior. Descartar o sobrenadante e + tampão de lise suplemento para fazer uma suspensão de 50%. </li><li> Adicionar 250 ul de equilibrated suspensão do grânulo para o sobrenadante do passo 2.5. Rodar a 4 ° C durante 45 minutos. </li><li> Preparar 500 ml HBS contendo 20 mM de HEPES (2,38 g) / pH 7,5 e NaCl 150 mM (4,38 g) em dH 2 O. Prepare soluções de reserva de MgCl 1M 2 (0,952 g em 10 ml de dH2O) e DTT 1 M (1,542 g em 10 ml de dH2O). Para preparar HBS +, complementar 100 ml imediatamente antes da utilização com 5 mM de MgCl2 (50 ul de estoque) e 1 mM de DTT (100 uL de stock). </li><li> Girar os grânulos a partir do passo 2,7 a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e grânulos de lavagem 2x com 10 ml de tampão de lise +, e 2x com 10 ml HBS +. Após a lavagem final, fazer uma suspensão de 50% por ressuspensão das pérolas em HBs + suplementadas com BD BaculoGold inibidor de protease (20 uL de 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Diluir 10 ul da preparação final com pérolas de 2x tampão de amostra Laemmli contendo β-mercaptoetanol. Faça albumina bovina (BSA) padrões. Use de 2 mg / ml de caldo de (0,02 g de BSA em 10 ml de dH2O). Misturar 10 ul de estoque com 10 uL Laemmli (20 ug final); 5 ul de estoque com 5 uL de dH2O e 10 uL Laemmli (10 ug final); e 2,5 ul estoque com 7,5 uL de dH2O e 10 uL Laemmli (5 ug final). Ferver as amostras (5 min). Girar a amostra do grânulo e executar o sobrenadante com padrões de BSA e marcadores de peso molecular em um 10% de gel de SDS-poliacrilamida. </li><li> Preparar o Comassie mancha azul (0,1 g em 10 ml de ácido acético, 40 ml de metanol e 50 ml de dH2O) ea solução destain (500 ml de dH2O, 400 ml de metanol e 100 ml de ácido acético). Armazene à temperatura ambiente. Manchar o gel por 20-30 minutos, retire o corante (pode ser reutilizada várias vezes) e lavagem com solução destain duas vezes. Continuar a destain com agitação suave durante várias horas até que as bandas são claramente visíveis. </li><li> Estimar a concentração de GST-RhoA (G17A), acoplado às esferas utilizando os padrões de BSA como referência (Fig. 2). Aliquot por um volume igual de esferas contendo ~ proteína ug 10-15 em 1,5 ml de tubos de centrifugação de micro. Loja contas a 4 ° C para uso dentro de um dia. Congelar a -80 ° C em HBS + glicerol / na proporção de 3:1 para utilizar dentro de poucos dias. </li></ol> 3. GEF Ensaio Pulldown com nucleotídeos livres RhoA (G17A) Beads <ol><li> Crescer as células em 10 pratos cm a confluência. Soro privar durante pelo menos 3 horas e tratar como requerido. </li><li> Preparar tampão de lise + como no passo 2.4. Preparar tampão de lise suficiente para 700 ul / prato mais alguma quantidade extra para permitir pipetagem erros. Adicionar os inibidores de protease imediatamente antes da utilização. </li><li> Trabalhando em gelo, remover o meio de cultura a partir dos pratos e lava-se com gelada HBS. Remova todo o HBS e adicionar 700 + tampão ul lise para cada prato. Redemoinho placas para cobrir todas as áreas, raspar e coletar lisados ​​em numeradas tubos de 1,5 ml. Girar a 15.000 g durante 1 min a 4 ° C. O sobrenadante será utilizado para o ensaio. </li><li> Se o seu número de celular é equivalente em todos ospratos a serem testados, você pode omitir a fazer um ensaio de proteína, e passar para o passo 3.5. Caso contrário medir a concentração de proteína de cada sobrenadante utilizando o Bio-Rad ensaio de proteína rápida e equalizar o sobrenadante para o volume e concentração. A quantidade de proteína total depende dos tipos de células utilizados (tipicamente 1-1,5 mg de proteína para as células LLC-PK1). </li><li> Remover 30 ul de cada sobrenadante e misture com 30 2x ul redução amostra Laemmli tampão ferver e reserve para o passo 3.7. Adicionar sobrenadantes restantes para as alíquotas de GST-RhoA (G17A) grânulos a partir do passo 2,12. Girar durante 45 minutos a 4 ° C. </li><li> Girar grânulos em 6800 g durante 10 segundos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se os grânulos 3x com tampão de lise, a fiação da mesma maneira entre as lavagens. Remover completamente a lavagem final utilizando uma seringa cc 1 equipada com uma agulha 30 G e adicionar 20 uL 2x reduzindo tampão de amostra Laemmli. Ferver durante 5 min. Rodar para contas de pelotização e quer executar o sobrenadante imediatamente (preferível) ou armazená-lo umt -80 ° C para posterior análise. </li><li> Executar 20 uL lisados ​​de células totais e de todas as amostras de proteína precipitados sobre o apropriado percentagem de gel de SDS-poliacrilamida para o tamanho de GEF está a estudar. Detectar a sua GEF da escolha por Western blotting utilizando um anticorpo específico. </li></ol> 4. Os resultados representativos Parte 1 e 2 do protocolo descreve a preparação de GST-RhoA (G17A) acoplado a GSH-sepharose grânulos e seus testes por SDS-PAGE (ver descrição do protocolo na Fig. 1). Um gel corado com Coomassie típico é mostrado na Fig. 2. A amostra com a proteína eluída deve conter uma única banda a aproximadamente 50 kDa (Fig. 2, pista 6). A concentração da proteína pode ser estimada utilizando as amostras de referência de BSA. No exemplo na Fig. 2, a concentração de RhoA (G17A) é estimada em 15 uL μg/10. Assim, alíquotas de 10 uL / ​​tubo foram preparados. O rendimento típico<html> na nossa mão é 15-20 mg de proteína de 10 ml de lise bacteriana. Parte 3 do protocolo descreve o ensaio de precipitação afinidade (ver sinopse na Figura 1). Um ensaio de GEF bem sucedida detectar a activação do factor de troca GEF-H1 é mostrado na Fig. 3. O RhoA proteína (G17A) capturado alguns GEF-H1 a partir do controle (não tratado) lisados ​​celulares, sugerindo que o GEF-H1 tem actividade basal. A quantidade precipitado no entanto o aumento nas células tratadas com a necrose inflamatória citocina tumoral-α (TNF-α), consistentes com a noção de que o TNF-α activa GEF-H1 5,7. Importante, os lisados ​​de células totais mostram quantidades similares de GEF-H1 no controlo e da amostra tratada, sugerindo que o tratamento não alterou GEF-H1 níveis ea entrada usada no ensaio é de igual. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral do protocolo. ove_content &quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figura 2. Resultado representativo do protocolo de preparação do grânulo. Um gel corado com Coomassie com sucesso GST-RhoA preparação do grânulo (G17A) é mostrado. Amostra do grânulo e padrões proteicos de BSA foram separadas por SDS-PAGE utilizando um gel de acrilamida a 10%. Para testar os grânulos, 10 uL da suspensão final talão contendo GST-RhoA (G17A) é diluída 1:01 com tampão de amostra Laemmli redução e fervida durante 5 minutos. As pérolas foram centrifugadas eo sobrenadante brevemente carregado no gel. As seguintes amostras foram carregadas: Pista 1: marcador de peso molecular (MW) (FroggaBio BLUeye prestained escada de proteína); Lanes 2-4: 5, 10 e 20 ug de albumina sérica bovina (BSA); Pista 5 está vazia; pista 6: 10 ul dos preparados na hora RhoA (G17A) contas. Após a separação é completada, o gel é corado usando azul de Coomassie e, subsequentemente, descorados para revelar as proteínas. O peso molecular do GST-RhoA proteína (G17A) é aproximadamente 50<html> kDa e corre em volta do nível do marcador kDa 48. A concentração da proteína GST-Rho nesta amostra particular é estimado em cerca de 15 lama μg/10 uL. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figura 3. Representativas ensaio de activação GEF mostrando TNF-α induzida por activação de GEF-H1. Confluentes LLC-PK1 células foram tratadas com 10 ng / ml de TNF-α durante 5 minutos. Após o tratamento, as células foram lisadas e GEFs activas foram capturadas utilizando GST-RhoA (G17A) grânulos ligados. A presença de GEF-H1 nas proteínas precipitadas (blot topo) e amostras de células totais Lysate (blot inferior) foi detectada utilizando Western blotting com um anticorpo anti-GEF-H1 (sinalização celular). Note que o aumento da quantidade de precipitado GEF-H1 em TNF-α-tratados versus não-tratados com células relativos às entradas equivalentes, indicando um bom resultado. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Um &quot;mau resultado&quot;. Embora o ensaio de pulldown GEF mostrado aqui resultou em alguns GEF-H1 capturado pelos grânulos, os montantes precipitado a partir de controlo e TNF-α células tratadas são os mesmos. TNF-α Assim, um ativador de know GEF-H1, neste caso, não induziu a ativação. Neste solução de problemas experiência particular subsequente sugerido que o TNF-α utilizado não era fresco suficiente e, provavelmente, degradada.

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Os autores não têm nada a revelar.

O método aqui apresentado é o ensaio de ativação só está disponível para não-radioativo GEFs que pode seguir a piscina activa de GEFs nas células. O ensaio é semelhante para os ensaios de precipitação utilizados para a activação seguinte de GTPases pequenas, bem como contra GEFs Rac e Cdc42. Esses ensaios de usar diferentes proteínas GST-etiquetados e têm ligeiras diferenças de a descrita aqui, no entanto os passos básicos são os mesmos. Assim, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros GTPase pequeno e ensaios de activação do GEF. O ensaio apresentado GEF foi recentemente modificado para pedido de frações nucleares 9,10. Com alterações posteriores, os testes de ativação GEF em outros compartimentos celulares também poderia ser possível. Nós utilizamos o método apresentado para estudar a activação de GEFs em linhas de células epiteliais 5,6,7. Com algum optimização, neste ensaio devem ser adequados para detectar GEFs a partir de qualquer linha de células. Quando adapting a um tipo específico de célula, localizar o número de células óptima, o volume de tampão de lise, e método de detecção para o GEF a ser testado (um anticorpo bom para Western blotting é importante). Para a configuração inicial do ensaio, é aconselhável utilizar um estímulo que é conhecido para activar o GEF de interesse. Ao usar um estímulo desconhecido, sempre usar um controle positivo para verificar se o ensaio está funcionando. Este ensaio pode ser usado para detectar a activação de GEFs conhecidos por Western blotting. No entanto, também é adequado para identificar GEFs desconhecidos. Para isso, GEFs capturados de controlo e as amostras estimuladas devem ser analisados ​​num gel de Coomassie-coradas. Bandas que aparecem apenas em amostras estimuladas pode conter GEFs ativados e podem ser enviados para identificação por espectrometria de massa (por exemplo, 5). Finalmente, uma nota de advertência. O ensaio é baseado na suposição de que as modificações pós-tradução que tornam GEFs activas são preservadas após lise celular. Na verdade, este é claramente o caSE para um número de GEFs, e desde que os seus estabelecimentos, este ensaio foi utilizada por vários grupos para detectar a activação de GEFs diferentes, incluindo GEF-H1, p115RhoGEF e XPLN (por exemplo, 5,11,12,13). Preservação do estado ativo, contudo, não pode acontecer no caso de todos os GEFs e, portanto, é concebível que este teste não vai funcionar para todos os GEFs. Tem também a ser observado, que muitos GEFs exercer atividade para mais de um GTPases pequenas. Assim, quando um GEF específica é estudada, é recomendado para complementar este ensaio com os ensaios de precipitação GEF para outros GTPases pequenas, bem como estudos funcionais examinando RhoA, Rac1 e Cdc42. Etapas críticas do protocolo: Colônias de bactérias transformadas devem ser colhidos a partir frescas, pratos preparados adequadamente para garantir a adequada seleção de Amp, crescimento bom e produção. Condições de transformação de células competentes obtidos de outras fontes pode variar e deve ser consultado. </p&gt; Todos os passos do protocolo de preparação de proteína (a partir do passo 2.3) eo ensaio (a partir do passo 3.2) deve ser realizado a 4 ° C com soluções arrefecidas e centrífugas. A lise bacteriana (passo 2,5) deve ser minuciosa e completa, a fim de obter uma suspensão homogénea. Quando a lise bactérias vórtice, e pipetar o lisado alternadamente, mantendo ao mesmo tempo que a 4 ° C e assegurar sonicação é feito em gelo para evitar a desnaturação da proteína. Se estiver usando um modelo diferente de sonicador, as condições podem ter de ser ajustada. A incubação de sonicado com as esferas devem sempre ser feito a 4 ° C num rotor de ligação para assegurar suficiente, e deve ser tomado cuidado para manter a temporização consistente. GST-Rho mutantes são um pouco instável quando expresso em bactérias, por isso o melhor é usar contas preparadas imediatamente ou dentro de poucos dias. O ensaio de precipitação (Parte 3) é o tempo e sensível a temperatura, umaGEFs s activas podem ser facilmente perdido a partir do lisado celular, de modo que os passos deve ser realizado tão rapidamente quanto possível. A seção seguinte contém algumas dicas de resolução de problemas. Não ou quantidade muito baixa de proteína mutante Rho na preparação final do grânulo: Isto pode ser causado por indução ineficiente, a lise das bactérias insuficiente, ou uma perda da proteína durante o processo de preparação ou de armazenamento. Para ajudar a resolver algumas dessas possibilidades, as amostras de bactérias podem ser analisada antes e após a indução. Se houver indução pobre da proteína repetir o processo usando uma colónia de uma placa de recém-listradas ou a partir de re-transformadas células competentes. As concentrações IPTG diferentes e tempos de indução também devem ser testados. Se a lise é insuficiente (isto é, a proteína permanece no pelete em vez do sobrenadante) variando de sal e de detergente concentrações no tampão de lise pode ser tentado. Alternados vezes sonicação econfigurações devem ser considerados, e as amostras antes e depois de sonicação pode ser verificada por microscopia para determinar a eficiência de lise. N precipitado GEF, mesmo que a proteína GST-, está presente nas pérolas: Isto pode ser devido a problemas técnicos durante o ensaio de precipitação, ou por uma ausência real de activação do GEF estudada utilizando o estímulo aplicado. Usar sempre um estímulo conhecido como um controlo positivo para verificar que o seu ensaio funciona. Use as esferas preparadas dentro de poucos dias. Se o ensaio de precipitação captura quantidades indetectáveis ​​de o GEF estudados em todas as condições, verificar que o seu GEF está presente e é bem detectável no sobrenadante após a centrifugação que está a ser utilizado para o ensaio (passo 3.3). Certifique-se de todos os tampões e os inibidores da protease são frescos, e realizar todos os passos sobre o gelo o mais rápido possível. Aumentar a quantidade de proteína de entrada (por exemplo, utilizando lisados ​​a partir de 2 placas / amostra). Se o ensaio de precipitação mostra precipitação basalção do seu GEF, mas nenhuma diferença é observada entre o controle e amostras estimuladas (fig. 4), começar a solucionar por meio da verificação de que o estímulo aplicado funcionou usando outros efeitos conhecidos (por exemplo, detectar a ativação de outras vias de sinalização). Considere alterar as condições de tratamento e / ou concentrações. Conte com os dados do relatório da literatura como o seu estímulo ativa Rho ou sinalização outras vezes para prever prováveis ​​e concentrações. Quando optimizar o tempo de tratamento, utilizar ambos os pontos de tempo curto e longo, tal como a activação GEF pode ser melhor detectável a um ponto de tempo antes da activação bem detectável Rho. Finalmente, o mesmo estímulo pode resultar em um grau variável de activação devido a uma mudança na capacidade de resposta de células causada por número de passagens, a célula de confluência, etc

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Estará disponível em breve </td><td> Gerado no laboratório do Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Loja -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC médio </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Mantenha estéril </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Estoque armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropil BD-thiogalacto-piranósido) </td><td> Calbio bioquímica </td><td> 420322 </td><td> Solução estoque da loja a -20 ° C </td></tr><tr><td> Esferas de glutationa Sepharose </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Inibidor da protease 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr&gt; <td> Completa Mini, EDTA livre 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Amostra tampão Laemmli 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Azul Brilhante de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Escada BLUeye </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Reagentes Tabela 1. Utilizado. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> RC-5B centrífuga </td><td> Sorvall </td><td> Rotor SS-34 </td><td> Use a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Use a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrífuga de micro </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Use a 4 ° C </td></tr><tr><td> Shaker bacteriano </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Use a 37 ° C ou a 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicador </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Use à RT </td></tr><tr><td> Rotor </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Use a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Equipamentos específicos utilizados.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

As proteínas da família Rho de GTPases pequenas são reguladores centrais do citoesqueleto, e controlar uma grande variedade de processos celulares, incluindo a migração de células, a expressão do gene, a progressão do ciclo celular e adesão celular 1. Proteínas Rho são interruptores moleculares que estão ativos no GTP-bound e inativos do PIB-bound estado. A sua activação é mediada por uma família de guanina-nucleotídicas de Câmbio Fator (GEF) proteínas. Rho-GEFs constituem uma grande família, com sobreposição de especificidades 2. Embora muito progresso tem sido feito na identificação dos GEFs ativados por sinais específicos, existem ainda muitas questões pendentes relativas ao regulação da via específica dessas proteínas. O número de Rho-GEFs excede 70, e cada célula expressa mais do que uma proteína GEF. Além disso, muitas destas proteínas activar não só Rho, mas outros membros da família, contribuindo ainda mais a complexidade das redes de regulação. Importante, explorandocomo GEFs são regulados requer um método de seguir a piscina activa de GEFs individuais em células activadas por estímulos diferentes. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo para um método utilizado para avaliar e quantificar as disponíveis activas Rho-específicos GEFs usando um ensaio de precipitação de afinidade. Este ensaio foi desenvolvido há alguns anos no laboratório Burridge 3,4 e nós tê-lo usado em linhas de células renais tubulares 5,6,7. O ensaio de tira proveito de um &quot;nucleótido livre&quot; mutante RhoA, com uma elevada afinidade para GEFs activas. A mutação (G17A) torna a proteína incapaz de se ligar PIB ou GTP e este estado imita o estado intermediário que é ligado ao GEF. Uma versão GST-etiquetados desta proteína mutante é expressa e purificada a partir de E. coli, ligada a esferas de glutationa Sepharose e usado para precipitar GEFs activas a partir de lisados ​​de células não tratadas e estimulada. Como a maioria dos GEFs são ativados através de modificações pós-tradução ou versão de ligações inibitórias, seu estado ativoé preservada em lisados ​​de células, e eles podem ser detectadas por este ensaio 8. Proteínas capturados podem ser sondado para GEFs conhecidos pela detecção de anticorpos específicos utilizando Western blot, ou analisados ​​por espectrometria de massa para identificar GEFs desconhecidos ativados por estímulos certos.

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Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

O método aqui apresentado descreve um ensaio para seguir a activação de factores específicos RhoA GDP / GTP Câmbio (GEFs) em células de cultura, fazendo uso de uma proteína de fusão GST mutante RhoA que tem elevada afinidade para GEFs activados. GEFs são precipitados a partir de lisados ​​celulares, detectadas por Western blotting e quantificada por densitometria.

Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliais

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K visualizações.  St. Michael's Hospital. O método aqui apresentado descreve um ensaio para seguir a activação de factores específicos RhoA GDP / GTP Câmbio (GEFs) em células de cultura, fazendo uso de uma proteína de fusão GST mutante RhoA que tem elevada afinidade para GEFs activados. GEFs são precipitados a partir de lisados ​​celulares, detectadas por Western blotting e quantificada por densitometria.

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Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biologia

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliais

Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados de células epiteliais