Nosso protocolo de isolamento do mesênquima intestinal resulta em alto rendimento de telócitos. Este método oferece uma plataforma inicial para estudar a interação célula-célula envolvendo telócitos na homeostase e doença. Os telócitos são células únicas sensíveis aos protocolos de dissociação tecidual disponíveis.
Portanto, a principal vantagem desta técnica é o isolamento do mesênquima, incluindo telócitos viáveis enriquecidos. Mesenquima, incluindo telocíto, pode servir como uma fonte para moléculas de sinalização e fatores de crescimento necessários para o crescimento organizado ex vivo. Para começar, lave o intestino, separado de um rato eutanasiado, em uma placa de Petri contendo PBS frio e estéril.
Coloque o intestino em uma placa de Petri. E usando uma tesoura de ponta de bola, abra o tubo intestinal longitudinalmente e lave as fezes. Transfira o intestino para um novo prato contendo PBS fresco e frio.
Depois de lavar o intestino mais uma vez, corte o intestino delgado em segmentos de um centímetro de comprimento e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com oito mililitros de PBS. Agite o tubo manualmente a um ou dois ciclos por segundo durante um minuto. Despeje a solução em uma placa de Petri.
E usando pinças, transfira o segmento para um tubo cônico de 50 mililitros preenchido com 20 mililitros de Solução A.Coloque os tubos em uma incubadora de agitador orbital a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, agitar vigorosamente o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos por segundo durante um minuto para dissociar o epitélio. Repita esta etapa mais uma vez.
Depois de cortar e lavar os fragmentos, como demonstrado anteriormente, transfira-os para um novo tubo de 50 mililitros preenchido com 10 mililitros de PBS estéril e inverta o tubo em um ou dois ciclos por segundo durante um minuto. Despeje a solução em uma placa de Petri. Transfira os segmentos para um novo tubo de 15 mililitros preenchido com 10 mililitros de PBS estéril e incline suavemente para cima e para baixo em um ou dois ciclos por segundo durante dois minutos.
Sob um armário de biossegurança, use pinças para colocar os segmentos em um lenço de laboratório estéril para secá-los. Depois de secos, corte os segmentos em pedaços. Transfira as peças cortadas usando pinças para uma placa de seis poços preenchida com quatro mililitros de solução de digestão pré-aquecida por poço.
Incube a placa a 37 graus Celsius por 50 minutos e agite suavemente a placa manualmente a cada 20 minutos. Em seguida, transfira as peças usando uma pipeta de Pasteur para um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com quatro mililitros de DMEM. Agite o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos por segundo durante um minuto para obter uma suspensão de célula única.
Filtre a suspensão através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 700 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Eliminar o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet de células em cinco mililitros de SFB/PBS a 2%.
Após centrifugar a suspensão mais uma vez a 700 g por cinco minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 12 mililitros de meio de cultura. Por fim, semeie a suspensão celular em placas de seis poços. Após a dissociação do mesênquima, os telócitos perdem suas características celulares, apresentando morfologia celular arredondada, e refletem menor número de células positivas para GFP no primeiro dia em comparação com os dias seguintes.
Alguns dias depois, os telócitos exibem uma morfologia celular pequena e esticada com processos celulares curtos. Após sete a 10 dias de semeadura, os telócitos recuperam suas características celulares, apresentando morfologia celular grande e esticada com processos citoplasmáticos longos. A citometria de fluxo revela a composição celular.
No geral, 69% das células isoladas foram viáveis com base na coloração DAPI. Destes, 60,9% representaram contaminação epitelial e células imunes e endoteliais. A fração telocita dispersou-se acima de 100k e 70k FSC e SSC, respectivamente, e representou quase 10% do mesênquima fechado.
A análise da FACS revelou que o subgrupo de telócitos pode ser definido pela coloração positiva para CD201 e GP38. A imunomarcação de mesênquima cultivado em um dia usando esses marcadores mostrou expressão desses marcadores moleculares, apesar de as células não exibirem suas características celulares. Este procedimento resulta em uma suspensão unicelular viável de células estromais, que pode ser usada não apenas para cultura 2D, mas para qualquer outra aplicação, como co-cultura 3D com organoides ou bioimpressão.
