O objetivo geral deste procedimento é rotular os vasos sanguíneos no cérebro e a hipófise de peixes teleost, e usamos perfusão cardíaca com um DiI fixador contendo II na espécie modelo medaka. Assim, essa técnica simples e eficiente ajudará a responder questões importantes sobre a anatomia vascular no cérebro e a hipófise de peixes teleost, bem como a relação entre neurônios ou células endócrinas e vasos sanguíneos. Algumas vantagens desta técnica incluem uma preparação rápida e fácil e simples, e sua adaptabilidade às espécies de peixes teleost.
Para preparar um suporte de peixe, corte um pedaço de poliestireno a um comprimento de cinco centímetros, uma largura de três centímetros e uma espessura de dois centímetros, e cole o poliestireno a uma antena plástica de nove centímetros de diâmetro. Em seguida, use um bisturi para fazer um buraco em forma de barco de três centímetros no poliestireno. Para preparar o sistema de perfusão, adicione uma cânula de plástico de 30 a 50 centímetros de comprimento na extremidade da agulha do sistema de perfusão.
Para preparar pipetas de vidro de cinco centímetros, use uma puxadora de pipeta para esticar capilares individuais de vidro de acordo com as instruções do fabricante. Antes de iniciar a dissecção, carregue uma seringa de 10 mililitros com a solução dii-fixativa preparada e coloque uma agulha com uma cânula na extremidade da seringa. Em seguida, use várias peças de fita colocadas em diferentes orientações para fixar a seringa no banco, e ajustar a posição do microscópio e do assento para obter uma boa posição para dissecção e para pressionar o pistão de seringa com o cotovelo.
Em seguida, coloque um peixe eutanizado no lado do abdômen do portador do peixe para cima e fixe a cabeça e a cauda com pinos. Use a tesoura para cortar horizontalmente a camada superficial da pele para abrir o abdômen anterior, e use fórceps para remover a pele acima do coração até que um acesso claro ao ventrículo e o bulbo arteriosus seja alcançado. Adicione um tubo de vidro na extremidade do capilar e quebre a ponta da pipeta.
Leve o tubo de vidro para perto do ventrículo e adicione pressão do cotovelo ao pistão de seringa para forçar o líquido para fora enquanto prende o ventrículo cardíaco com a pipeta. Em seguida, perfure imediatamente o seio venoso com fórceps para liberar o sangue de circulação. A partir do ventrículo, ajuste o ângulo da pipeta de vidro para localizar a entrada do bulbo arteriosus, e mova a pipeta abrindo dentro do bulbo arteriosus.
Em seguida, adicione pressão à seringa por mais 30 a 60 segundos, mantendo a pipeta dentro do bulbo arteriosus. Para uma rotulagem ideal de todos os vasos sanguíneos é fundamental perfumar no bulbo arteriosus tempo suficiente para substituir todo o sangue pela solução dii-fixativa. Após cerca de 60 segundos de perfusão, quando não for observado mais vazamento de sangue, remova a pipeta de vidro e agulhas do peixe, e colde o cérebro e a pituitária em um fresco 4% de paraformaldeído por duas horas à temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, enxágüe os tecidos duas vezes em PBS fresco por 10 minutos por lavagem antes de preparar as amostras para a imagem. Após a injeção cardíaca de uma solução fixa que contenha DI, como demonstrado, os vasos sanguíneos rotulados podem ser observados em fatias de tecido por microscopia estéreo fluorescente ou em tecido inteiro por microscopia confocal. Observe que se a solução for injetada no ventrículo cardíaco em vez do bulbo arteriosus ou se a solução for injetada com uma pressão muito baixa e/ou por um período muito curto, será observada uma rotulagem inadequada dos vasos.
Além disso, ao fotografar o mesmo tecido com os mesmos parâmetros de imagem, uma diminuição na intensidade de rotulagem pode ser observada após vários dias, com o sinal aparecendo mais espalhado dentro da amostra de tecido. Fatias de tecido de linhas transgênicas dentro das quais as células de interesse expressam proteínas fluorescentes podem ser rotuladas para proteínas específicas de interesse usando protocolos padrão de imunofluorescência que permitem a investigação de interações entre vasos sanguíneos e outros tipos de células. É importante alcançar o bulbo arteriosus.
Quando isso for alcançado, a pressão adicional ao pistão de seringa deve induzir uma expansão do bulbo confirmando um procedimento bem sucedido. Essa técnica pode ser usada para investigar a interação entre células endócrinas e vasos sanguíneos na hipófise teleost em geral, mas talvez mais especificamente para investigar possíveis diferenças ou semelhanças entre os sistemas de portal em teleost e mamíferos. Como esse uso político de compostos tóxicos e voláteis, como o uso de uma máscara de gás e uma sala ventilada, devem ser sempre tomadas na realização desses procedimentos.
