Agradecemos a Anthony K. L. Leung do departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Bloomberg School of Public Health, Universidade de Johns Hopkins para seu técnico ajuda com projeto de construção de miR-181-esponja. Agradecemos também Polina Sysa-Sousa e Kathleen Gabrielson do departamento de Molecular e Patobiológico comparativo, Johns Hopkins Medical instituições para sua assistência técnica pela imagem no vivo da entrega miRNA-esponja.
Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH, HL39752 (para Charles Steenbergen) e por uma concessão de desenvolvimento de cientista do 14SDG18890049 a associação americana do coração (para Samarjit Das). O promotor de cardio-específico do rato foi generosamente fornecido por Jeffery D. Molkentin no Hospital infantil de Cincinnati.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Universidade Johns Hopkins.
1. esponja Design
<ol><li>
MicroRNA ligação 3' UTR Nota: A miRNA funções através de interações de emparelhamento base específicas com sites parcialmente complementares da região 3' untranslated (UTR) dos seus mRNAs de destino (para uma revisão abrangente, consulte Bartel)15.<ol>
<li>Desenha os inibidores de miRNA expressão como oligonucleotides que contêm significativa complementaridade à sequência de miRNA. Sequestrar um miRNA em do oligonucleotide complexo através de extensa base de emparelhamento para bloquear a função de miRNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desenho de uma esponja de miRNA
	<ol>
<li>Projeto tandemly vestiu as sequências de miRNA parcialmente complementares para incluir uma protuberância na posição normalmente clivada por Argonaute 2. O bojo é posicionado no 9-12 de nucleotídeos da sequência de miRNA maduro para impedir qualquer RNA interferência tipo segmentação e a degradação da esponja.</li>
		<li>Se desejar, projetar a sequência de destino de chamariz para ligar a todos os membros da família miR-181. Após um exame e comparação das sequências miRNA família miR-181, encontrar uma sequência comum em 5' lado da protuberância contendo 8 nucleotídeos consecutivos, ou uma sequência comum para todos os 4 membros da família miR-181 no 3' lado da protuberância de um adicional de 8 nucleotídeos consecutivos. Estes 2 sequências representam os locais de ligação de meia esquerda e direita, respectivamente. Nota: A sequência de isca é uma matriz em tandem dos sites separados por um espaçador GGA vinculação de meia esquerda e direita. Interligar a sequência 5'-final e a sequência 3'-lado (descrito na etapa 1.2.2) com um espaçador GGA projetado para criar o bojo quando recozida para uma miRNA (conforme descrito na etapa 1.2.1). Repita este 1 sítio de ligação de miRNA 10 x na construção final miR-esponja.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Outras considerações de esponja de miRNA Nota: Para clonar a sequência de esponja para o vetor de expressão destinatário, sites de reconhecimento de nucleases de restrição devem ser incluídos em cada extremidade da sequência. Uma análise em silico digestão deve ser usada para confirmar a clivagem não-específica da sequência de esponja pelas enzimas de restrição escolhidas e outras enzimas de restrição, utilizadas em aplicações a jusante de clonagem.<ol>
<li>Adicione um codão stop duplo (TAA TAA) 5'-na extremidade do sintético 3' UTR, tal que a sequência de miR-181-esponja não é parte da sequência de codificação para uma proteína verde fluorescente melhorada (EGFP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Síntese da esponja DNA para clonagem
	<ol>
<li>Usar um sintetizador de DNA ou empregar uma fonte disponível comercialmente para sintetizar a sequência de esponja de miRNA final com locais de reconhecimento de nuclease limitação no lugar de clonagem. A esponja é enviada em um plasmídeo que pode conter marcadores selecionáveis para uma amplificação em bactérias. Além disso, a esponja pode ser amplificada por uma reação em cadeia do polymerase (PCR) para clonagem ou simplesmente retirou-se do vetor de doador usando os sites de restrição descritos na etapa 1.3 (consulte também passo 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. clonagem do vetor do destinatário para incluir um promotor de tecido-específica
Nota: Use o vetor pEGFP-C1 como o vetor de destinatário para a gaveta de expressão da esponja miRNA. O vetor pEGFP-C1 contém um quadro de leitura para um EGFP impulsionado por um promotor de citomegalovírus (CMV). O promotor CMV é constitutivamente ativo em células de mamíferos. Se um promotor de tecido-específica é necessário, o promotor CMV pode ser removido pela digestão das enzimas AseI e NheI (consulte a etapa 2.1). O plasmídeo contém um extenso local de clonagem múltipla (MCS) bem como canamicina (Kan) e neomicina (G418) marcadores para uma seleção em bactérias e um expressao em células de mamíferos, respectivamente.
<ol><li>
Removendo o promotor CMV de pEGFP-C1
	<ol>
<li>Fazer 50 μL de reação de digestão contendo tampão de digerir comercialmente disponível sugerida pelo fabrico das enzimas de restrição usada 1x, 5 μg de plasmídeo (em água) e 5 μL de enzimas AseI e NheI. Adicionar todos os componentes para um tubo de microcentrifugadora e delicadamente, misture-os por agredi-lo. Girar o tubo para 10 s em um microcentrifuge para coletar a reação na parte inferior. Incube a reação em banho-maria 37 ° C por 15 min.</li>
		<li>Purifica o plasmídeo linear digerido. Adicionar 5 vezes o volume de reação de tampão de ligação de coluna (uma mistura proprietária do buffer de ligação apropriado para a fabricação das colunas de purificação de DNA usada) e purificar a reação com uma coluna de purificação de DNA, conforme descrito pelo fabricante. Eluir com 25 μL de tampão de eluição (água) adicionado com cuidado para o centro da coluna.</li>
		<li>Gel de purificar o plasmídeo digerido em gel de agarose de 0,5% da seguinte forma: Adicionar 5 μL de tampão (50% de glicerol-3 x tintura de carregamento) a carregar para o plasmídeo eluted. Carrega a amostra inteira em 1 bem em gel de agarose de 0,5%. Incluir uma pista separada com 500 ng do vetor sem cortes. Executá-lo por 30-40 min, até que seja alcançada uma separação adequada de plasmídeos de corte e sem cortes.</li>
		<li>Purificar o plasmídeo linear da seguinte forma: Visualizar o DNA no gel do agarose em uma caixa de luz UV. Com uma lâmina de barbear limpa, cuidadosamente excisar a banda correspondente para o plasmídeo linear. Nota: O plasmídeo linear deve executar mais baixo do que o plasmídeo sem cortes e aparecerá como uma única banda em aproximadamente 4,2 kb. O promotor CMV extirpado aparecerá como uma banda de luz em aproximadamente 500 nucleotídeos (nt).</li>
		<li>Extrair o DNA da fatia gel usando um kit disponível comercialmente e eluir o DNA da coluna com 25 μL de água.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Clonagem de um promotor específico coração em pEGFP-C1 Nota: O promotor de cadeia pesada de miosina-alfa (α-MHC) foi anteriormente caracterizado e demonstrado para direcionar robustos níveis de expressão de restrição cardíaca, conforme descrito no seguinte Molkentin, Jobe e Markham16. As próximas seções descrevem como amplificar o promotor do vetor de clonagem.<ol>
<li>Clonar o promotor α-MHC entre elementos 420 para-2934 relativo para o site de início de transcrição para o plasmídeo de p4016 pelo primeiro projetar primers PCR que ladeiam a esta região e, em seguida, o plasmídeo, como um modelo para o PCR. Amplifica a região promotora usando PCR primers descrito anteriormente5. Iniciadores de PCR para diante e reversos contêm sequências de sobreposição aos fins digeridos da pEGFP-C1 (passo 2.1) para permitir a clonagem dirigido em fusão. Consulte o manual de In-fusão para uma explicação abrangente sobre o projeto da primeira demão de clonagem de In-fusão. Sequências da primeira demão são encontradas na tabela 1.</li>
		<li>Preparar uma reação de PCR de 50 μL, que contém 1 μM de cada primer e 10 ng de DNA de modelo. Adicione uma quantidade adequada de enzima PCR e dNTPs dependendo o fabrico dos reagentes PCR escolhido. Realize PCR em um bloco padrão de ciclismo DNA. Executar um 3 min 98 ° C desnaturação passo, seguido por 35 ciclos de desnaturação, recozimento e extensão de 5, 30 e 120 s cada, respectivamente. Incluem uma extensão final de 10 min a 72 ° C.</li>
		<li>Limpe a extração do PCR e gel. Após a conclusão do ciclo de PCR, adicione 5 x o volume de reação de tampão de ligação a coluna para a reação de PCR e purificá-la com uma coluna de purificação de DNA, conforme descrito pelo fabricante. Eluir a mistura com 25 μL de tampão de eluição (água) adicionado com cuidado para o centro da coluna.<ol>
<li>Adicione 5 μL de carregando buffer [50% glicerol (3x) carregando o corante] a eluted do plasmídeo. Carrega a amostra inteira em 1 bem em gel de agarose 1%. Executá-lo por 30-40 min; Visualizar e retirar o produto do PCR como descrito acima (passo 2.1.5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligam o promotor α-MHC com o pEGFP-C1 da seguinte forma: adicionar a reação da ligadura de 10 μL contendo 1 x 1 μL de vetor tornado linear, 2 μL do PCR purificado e buffer de ligadura comercialmente disponível. Realizar a ligadura a 50 ° C por 15 min e depois resfriá-lo no gelo.</li>
		<li>Executar uma transformação bacteriana como segue: transfect 50 μL de células competentes com 2,5 μL de mistura de ligadura no Fusion, adicionando os componentes. Descansar a Eppendorf tubo no gelo por 20 min, colocá-lo em um banho de água de 42 ° C durante 40 s e depois lugar o tubo no gelo por 2 min.<ol>
<li>Após a transformação, adicionar 350 μL da mídia SOC e desenvolvem-se células a 37 ° C por 45 min. placa 200 μL de solução de consequência em placas LB com Kan. realizar uma colônia PCR para identificar Kan resistentes células que contêm a ligadura de promotor de α-MHC. Nota: Triagem primers foram projetados para PCR através da junção de ligadura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Expanda os clones PCR positivos em caldo LB-Kan e em plasmídeos purificados usando protocolos de purificação de plasmídeo prep mini padrão conforme descrito pelo fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. clonagem a esponja
<ol><li>
Digerir o vetor de destinatário
	<ol>
<li>Fazer o plasmídeo de α-MHC-pEGFP linear para clonagem com EcoRI e KpnI e purificar o gel como descrito acima (passo 2.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR amplificar e digerir a DNA de esponja
	<ol>
<li>Use o scramble 284-nt-long miR-181-esponja e correspondente transporte vetores como o modelo para o PCR. Amplifica a região de esponja usando descrito anteriormente PCR primers5. Observe que para diante e reversos iniciadores de PCR contêm sequências de enzima de restrição, para permitir a ligadura em α-MHC-pEGFP-C1. Realize o PCR como descrito acima (passo 2.2.2). Purifica os produtos PCR antes da digestão como descrito (etapa 2.2.3) e eluída-los com água para a digestão. Para sequências da primeira demão, consulte tabela 1.
</li>
		<li>Digeri a DNA de esponja para ligadura. Uma reação de digestão de 50 μL contém 1 x buffer de digerir, a reação de PCR gel-purificado da etapa 3.2.1 e 5 μL de enzimas EcoRI tanto KpnI. Adicionar todos os componentes para um tubo de microcentrifugadora e delicadamente, misture-os por agredi-lo. Girar o tubo para 10 s em um microcentrifuge para coletar a reação na parte inferior. Incube a reação em banho-maria 37 ° C por 15 min.</li>
		<li>Purifica a esponja PCR digerida usando uma coluna de limpar PCR conforme descrito anteriormente (etapa 2.2.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ligate a miR-181-esponja em vetor α-MHC-pEGFP-C1
	<ol>
<li>Configurar uma reação de ligadura μL 21 que contém 1 x buffer de ligadura, 3 μL de digerido e purificado PCR miR-181-esponja, 1 μL de vetor tornado linear de α-MHC-pEGFP-C1, buffer de DNA 1 x e 1 μL de DNA ligase. Realizar a ligadura em temperatura ambiente por 5 min e em seguida, coloque-o no gelo.</li>
		<li>Transforme 50 μL de células competentes XL1-azul com 2 μL de mistura de ligadura. Use a transformação e chapeamento protocolos como descrito acima (passo 2.2.5). Realize uma colônia PCR para identificar bactérias resistentes Kan, que contêm a sequência correta de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge. Desenho de primers para PCR de triagem através da junção de ligadura. Consulte a tabela 1 para sequências da primeira demão.</li>
		<li>Amplificar e sequenciar o vetor. Expanda os clones PCR positivos em caldo LB-Kan e em plasmídeos purificados usando protocolos de purificação de plasmídeo prep mini padrão. Execute um sequenciamento de DNA para verificar se o plasmídeo expressando as sequências de DNA desejadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. geração de células de expressar miR-181-esponja H9c2 estável
<ol><li>
Crescimento e manutenção das células H9c2
	<ol>
<li>Células de cultura de H9c2 em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo soro fetal bovino (FBS) a uma concentração final de 10%. Subcultura as células usando protocolos padrão e cultivá-las a 37 ° C 5% de dióxido de carbono.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection e seleção de H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge expressando as células
	<ol>
<li>Execute uma poração de células H9c2 para os melhores resultados. Transfect rato mioblastos (H9c2) com uma esponja scramble (uma sequência de 284-nt-long scramble que substitui a miR-181-esponja-sequência) ou a construção de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge com um electroporator.<ol>
<li>Brevemente, transfect 4 x 10-5 células com 2 μg de DNA de plasmídeo (em 5 µ l de H2O) e 100 µ l de uma solução compatível com o aparelho de eletroporação. Use um programa de eletroporação de DS-120 para transfect as células H9c2.</li>
			<li>Incube as celulas transfectadas na cubeta para 10 min à temperatura ambiente. Adicione 500 µ l de DMEM diretamente para a cubeta. Delicadamente, transferi o conteúdo de cubeta total para um poço de uma placa de 6.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selecione para células positivas de GFP depois do pós-transfection 48 h, pela FACs. Apenas as células GFP-expresso da placa em uma placa de 6 com uma adição de neomicina (G418) (400ng/mL) para a mídia de crescimento completo. Nota: Antes da seleção G418, uma curva de morte deve ser estabelecida para determinar a quantidade de neomicina, necessária para a seleção. Para as células H9c2, 400 ng/mL de G418 resultou em uma cerca 80% taxa de morte de não-plasmídeo transfected H9c2 células após 24h e foi considerada a concentração desejada de trabalho de G418 para estas células. A linha celular foi considerada estável depois de crescimento foi mantido em G418 16 dias.</li>
		<li>Execute a classificação de FACs das células G418 estáveis usando a expressão da GFP como marcador para uma seleção positiva de esponja. Sementes de 5-10 pilhas em cada poço de uma placa de 96 poços, classificando o fluxo. Expanda as células monoclonais da placa de 96 poços para placas de 24 poços com várias passagens. Estoques de congelador do uso de células de passagem 3 células (P3) como ponto de partida para experiências posteriores.</li>
		<li>Execute todos os experimentos baseados em células-linha com células de baixo-passagem entre P5 e P10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. síntese e purificação de esponja-nanopartículas (miR-181-esponja nanopartículas)
<ol><li>Prepare as nanopartículas lipossomas dissolvendo amphiphile catiônica (DOTAP) e co de lipídios, colesterol e DSPE-PEG-OMe, em uma relação de 5:5:0.1 mM, respectivamente, em uma mistura de clorofórmio e metanol em um frasco de vidro.</li>
	<li>Remova o solvente orgânico em 44-45 ° C, sob vácuo, usando um evaporador rotativo, seguido de um fluxo suave de nitrogênio livre de humidade. Manter o filme seco restante de lipídios de vácuo elevado para 8 h.</li>
	<li>Prepare uma mistura adicionando 5% de glicose para o filme lipídico vácuo secas. Deixá-lo durante a noite para permitir que esta mistura hidratar o filme. Vórtice do frasco para 2 a 3 min à temperatura ambiente para produzir vesículas multilamellar com uma agitação ocasional em um banho de água de 45 ° C.<ol>
<li>Proceda à sonicação as vesículas multilamellar para preparar unilamellar pequenas vesículas em um banho de gelo para 3-4 min até clareza pode ser observada, em um ciclo de trabalho 100% e 25 W de potência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misture uma sequência codificada ou uma sequência de miR-181-esponja clonado em vetores pEGFP(α-MHC) e lipossomas em uma base de proporção 1:3 carga para formar o nanovector4. Nota: Um complexo eletrostático de nanopartículas lipossomas carga positiva e carga negativa plasmídeo é conhecido como um nanovector.</li>
</ol>6. sistêmica entrega de esponja-nanopartículas e validação dos efeitos In Vivo
<ol><li>
Entrega sistêmica de esponja-nanopartículas em ratos
	<ol>
<li>Use ratos Sprague-Dawley (SD). Injete por via intravenosa os ratos com o nanovector miR-181-esponja ou nanovector scramble na veia da cauda. Use ratos machos SD, que são cerca de 200 g de peso.</li>
		<li>Realizar a injeção de veia de cauda usando uma dose de 4 mg de nanovector/kg de peso corporal e repita isso usando um regime de 6 injeções de veia de cauda durante 2 semanas. Após a entrega de nanovector repetidas, prever um período de 1 semana (dias 15-21) para a expressão do vetor em vivo.</li>
		<li>Confirme a otimização de imagem o sinal GFP, antes, durante e após a entrega de nanovector. Analise o sinal GFP por software de imagens tomográfica, que gera dados semi-quantitativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Validação de na vivo miR-181 inibição pela miR-181-esponja
	<ol>
<li>Execute o borrão ocidental para demonstrar a expressão de uma funcional miR-181-esponja no tecido do coração. Nota: Para este estudo, mt-COX1 expressão foi examinado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Consequências funcionais de na vivo expressão miR-181-esponja no coração
	<ol>
<li>Realize uma ecocardiograma bidimensional, modo M e Doppler durante e após a entrega de nanovector para analisar a função cardíaca e alterações morfológicas. Para uma melhor verificação capacidade nos corações roedores, use um sistema de ultra-som, equipado com um transdutor de matriz linear de 15 MHz.</li>
		<li>Anestesia pode influenciar a contratilidade cardíaca; Portanto, realize a entrega da nanovector miR-181-esponja ou scramble nanovector aos animais que são conscientes e sem qualquer reagente anestésica durante o processo de ecocardiografia. Por favor, ver Souza, et al. 4 para mais esclarecimentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+detection+comes+of+age.">microRNA detection comes of age.</a> Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).</li><li>van Rooij, E., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+powerful+new+regulators+of+heart+disease+and+provocative+therapeutic+targets.">MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+miRNA+regulates+the+mitochondrial+genome+in+the+heart.">Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart.</a> Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181c+regulates+the+mitochondrial+genome,+bioenergetics,+and+propensity+for+heart+failure+in+vivo.">miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo.</a> PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+effects+of+miR-181+family+members+on+myocardial+function+through+protective+cytosolic+and+detrimental+mitochondrial+microRNA+targets.">Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).</li><li>Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+miR-21+for+the+therapy+of+pancreatic+cancer.">Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).</li><li>Jopling, C. 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C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181+and+metabolic+regulation+in+the+immune+system.">miR-181 and metabolic regulation in the immune system.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).</li><li>Hori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+regulates+vascular+stiffness+age+dependently+in+part+by+regulating+TGF-beta+signaling.">miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling.</a> PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+with+antisense+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides.</a> Methods. 44 (1), 55-60 (2008).</li><li>Stenvang, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+targets+for+antisense-based+therapeutics.">MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+comparison+of+anti-microRNA+oligonucleotide+potency.">A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency.</a> Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+and+design+of+anti-miRNA+oligonucleotides.">Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides.</a> Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).</li><li>van Rooij, E., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics+for+cardiovascular+disease:+opportunities+and+obstacles.">MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).</li><li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3 (1), 1 (2012).</li><li>Levin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+issues+in+the+pharmacokinetics+and+toxicology+of+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides.">A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).</li><li>Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+miR-214+modulates+Hedgehog+signaling+to+specify+muscle+cell+fate.">Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate.</a> Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inhibition+of+miRNA+maturation+with+morpholinos+reveals+a+role+for+miR-375+in+pancreatic+islet+development.">Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development.</a> PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).</li><li>Martello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+of+Nodal+signalling.">MicroRNA control of Nodal signalling.</a> Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).</li><li>Fabani, M. M., Gait, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+targeting+with+LNA/2'-O-methyl+oligonucleotide+mixmers,+peptide+nucleic+acids+(PNA),+and+PNA-peptide+conjugates.">miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates.</a> RNA. 14 (2), 336-346 (2008).</li><li>Fabani, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+miR-155+function+in+vivo+by+peptide+nucleic+acids.">Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).</li><li>Babar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+therapy+in+an+in+vivo+microRNA-155+(miR-155)-dependent+mouse+model+of+lymphoma.">Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).</li><li>Torres, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+requirements+and+cellular+targeting+of+microRNA-122+by+peptide+nucleic+acids+anti-miRs.">Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs.</a> Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).</li><li>Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+miR-143/145:+the+importance+of+cell-type+localization+of+miRNAs.">Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este artigo descreveu o projeto e a síntese de uma esponja-miRNA e demonstrou como a expressão tecido-específica da esponja é uma poderosa ferramenta para inibir a expressão família miRNA tecido-específica.
Temos demonstrado que uma família de miR-181 visando a esponja pode ser clonada em um plasmídeo de expressão com um promotor específico cardíaco. O plasmídeo pode ser eficientemente empacotado em uma partícula de nanovector para entrega tanto in vitro e em vivo</e...

Nas últimas duas décadas, tem havido inúmeros estudos que apontam para o papel significativo dos miRNAs em doenças humanas. Resultados de um vasto corpo de literatura demonstram a importância inegável de miRNAs na fisiopatologia de doenças como o câncer1 e doença cardiovascular2,3,4,5. Por exemplo, miR-21 é upregulated em muitos tipos de câncer, resultando em um aumento ciclo celular e celular proliferação6. Em infecções de hepatite C, miR-122 desempenha um papel importante na replicação do vírus7, e tem sido demonstrado que a inibição da miR-122 diminui a carga viral8. Na hipertrofia cardíaca, miR-212/132 é upregulated no coração e está envolvido com o fenótipo patológica9. A importância óbvia da downregulation ou inibição funcional de uma miRNA upregulated sugere oportunidades para explorar terapeuticamente a biologia de miRNA em quase todas as doenças.
Os quatro membros da família 181-miR, miR-181/b/c/d, encontram-se em três locais genoma no genoma humano. A região intrônicas de um gene de anfitrião de RNA não-codificante (MIR181A1-HG) codifica o cluster de miR-181-a/b-1. A região intrônicas do gene NR6A1 codifica a miR-181-a/b-2. O cluster miR-181-c/d está localizado em uma transcrição descaracterizada no cromossomo 19. Todos os membros da família miR-181 compartilham a mesma sequência de "semente" e todos os quatro membros da família miR-181 potencialmente podem regular os mesmos objectivos de mRNA.
Nós3,4 e outros10 já destacou a importância da miR-181 membros da família durante a insuficiência cardíaca estágio final. Também reconhecemos que uma upregulation de miR - 181c ocorre sob condições patológicas associadas com um risco aumentado de doença cardíaca, tais como diabetes tipo II, obesidade e envelhecimento3,4,5. Foi postulado que a superexpressão de miR - 181c provoca estresse oxidativo, que leva a uma disfunção cardíaca4.
Vários grupos têm sugerido que miRNA existem mitocôndrias11,12,13,14, mas nós fomos os primeiros a demonstrar que miR - 181 c é derivado do genoma nuclear, processado, e posteriormente translocada para a mitocôndria no RISC3. Além disso, detectamos uma baixa expressão de miR-181 e miR-181b no compartimento mitocondrial do coração5. Importante, nós encontramos que miR - 181c reprime a expressão de RNAm de mt-COX1, mostrando assim que os miRNAs participar no Regulamento do gene mitocondrial e alterar a função mitocondrial3,4.
Este artigo discute a metodologia necessária para projetar uma miRNA-esponja para derrubar toda a família em cardiomyocytes miR-181. Além disso, nós esboçamos um protocolo para o aplicativo na vivo da miR-181-esponja.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-fusion</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Miniprep</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-181-sponge synthesis</td>
			<td>Introgen GeneArt</td>
			<td>custome made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI enzymes</td>
			<td>New Endland Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI enzymes</td>
			<td>New Endland Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11635379001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418, Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 sonifier</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EDP 100-214-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MTCO1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequoia C256 ultrasound system</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge

MicroRNA (miRNA) é pequeno não-codificantes do RNA que inibe a expressão pós-transcricional RNA mensageiro (mRNA). Doenças humanas, tais como câncer e doenças cardiovasculares, foram mostradas para ativar o tecido e/ou expressão de miRNA célula específicos associados com a progressão da doença. A inibição da expressão de miRNA oferece a possibilidade de uma intervenção terapêutica. No entanto, as abordagens tradicionais para inibir os miRNAs, empregando antagomir oligonucleotides, afetam funções específicas de miRNA na entrega global. Neste documento, apresentamos um protocolo para a inibição de cardio-específicas na vivo da família miR-181 em um modelo do rato. Uma construção de miRNA-esponja é projetada para incluir 10 sequências repetidas de miR-181 de vinculação. O promotor específico cardio α-MHC é clonado para a determinação de pEGFP para dirigir a expressão específica cardio miR-181 miRNA-esponja. Para criar uma célula estável linha expressando a miR-181-esponja, myoblast H9c2 células é transfected com construção de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e classificada por fluorescência-ativado da pilha (FACs) de classificação em células GFP positivas H9c2 que são cultivadas com neomicina (G418). Após um crescimento estável em neomicina, populações de células monoclonais são estabelecidas pela FACs adicionais e clonagem de célula única. As células de H9c2-miR-181-esponja-GFP resultantes myoblast exibem uma perda da função dos membros da família miR-181, avaliadas através do aumento da expressão de proteínas do alvo miR-181 e em comparação com células H9c2, expressando uma esponja não-funcional scramble. Além disso, nós desenvolvemos um nanovector para a entrega sistêmica da construção de miR-181-esponja por complexantes carregados positivamente lipossomas nanopartículas e miR-181-esponja plasmídeos com carga negativa. Na vivo por imagens do GFP revela que múltiplas injeções de veia cauda de um nanovector durante um período de três semanas são capazes de promover uma expressão significativa da miR-181-esponja de forma cardio-específica. Importante, uma perda da função de miR-181 é observada no tecido do coração, mas não no rim ou fígado. A miRNA-esponja é um método poderoso para inibir a expressão tecido-específica miRNA. A expressão de miRNA-esponja de condução de um promotor de tecido-específica fornece especificidade para a inibição de miRNA, que pode ser confinada a um alvo de órgão ou tecido. Além disso, combinando tecnologias nanovector e miRNA-esponja permite uma entrega eficaz e miRNA tecido-específica inibição na vivo.

Nas estàvel transfectadas pEGFP-miR-181-esponja-expressando H9c2 células (da etapa 4.2), a expressão da família inteira de miR-181 (miR-181, 181b-miR, miR - 181c e miR - 181d) moderadamente foi diminuída em relação pEGFP-ovos mexidos-expressando H9c2 células. MiR-181-esponja serve como um inibidor competitivo de toda a família de miR-181, então nós antecipamos que a expressão da miR - 181c mitocondrial alvo gene, mt-COX1, aumentaria. Borrão ocidental dados sugerem que a expre...

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In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Na Vivo Entrega de nanovector de uma coração-específicas do MicroRNA-esponja

Inibição de microRNA tecido-específica é uma tecnologia que é subdesenvolvida no campo do microRNA. Aqui, descrevemos um protocolo para inibir com sucesso a família miR-181 microRNA nas células myoblast do coração. Nanovector tecnologia é usada para entregar um microRNA esponja que demonstra significativa na vivo cardio-específicos miR-181 família inibição.

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

in-vivo-nanovector-delivery-of-a-heart-specific-microrna-sponge

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

7.3K visualizações.  University of Toronto. Inibição de microRNA tecido-específica é uma tecnologia que é subdesenvolvida no campo do microRNA. Aqui, descrevemos um protocolo para inibir com sucesso a família miR-181 microRNA nas células myoblast do coração. Nanovector tecnologia é usada para entregar um microRNA esponja que demonstra significativa na vivo cardio-específicos miR-181 família inibição.

Vídeo: In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction.  (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns.

Construção e Implantação de um Sistema de Microinfusion para entrega Sustentada de Agentes neuroativos.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Um modelo ex vivo da cultura do tecido da cartilagem que remodela em explants bovinos do joelho

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

Eletrocardiografia de superfície vivo para zebrafish adulto

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Na Vivo Entrega de nanovector de uma coração-específicas do MicroRNA-esponja

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