Name: in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge
Uploaded: 2018-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge at JoVE.com

우리 학과의 생화학 및 분자 생물학의 안토니 K. L. 렁 감사, 블룸버그 공중 보건의, 존스 홉킨스 대학 그의 기술에 대 한 미르-181-스폰지 구조 설계 도움. 우리는 또한 한국 Sysa-샤와 부의 분자와 비교 Pathobiology, 미르-스폰지 배달의 vivo에서 화상 진 찰에 의해 그들의 기술 지원에 대 한 존스 홉킨스 의료 기관의 캐슬 린 Gabrielson 감사합니다.
이 작품은 NIH, (찰스 스 틴 버 켄)를 HL39752에서에서 교부 금에 의해 그리고 과학자 개발에서에서 교부 금 미국 심장 협회 14SDG18890049 (Samarjit Das)에 의해 지원 되었다. 쥐 심장 관련 발기인 아낌없이 제프리 D. Molkentin 신시내티 아동 병원에 의해 제공 되었다.

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었다.
1. 스폰지 디자인
<ol><li>
바인딩 3' UTR 예측에 관한 참고: 특정 기본 쌍 상호 작용을 통해 3' 되지 않은 지역 (UTR)에 부분적으로 무료 사이트와 그것의 표적 mRNAs의 A 미르 기능 (종합적인 검토에 대 한 참조 Bartel)15.<ol>
<li>MiRNA 식 oligonucleotides 상당한 complementarity 미르 시퀀스에 포함 된로 억제제를 디자인 합니다. 미르는 oligonucleotide 미르 기능을 차단 하는 광범위 한 기본 쌍을 통해 복잡 한에 격리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiRNA 스폰지의 디자인
	<ol>
<li>Tandemly 기준점과 부분적으로 보완 미르 시퀀스 Argonaute 2에 의해 일반적으로 죽 습 위치에 돌출을 포함 하도록 디자인. 돌출은 RNA 간섭 유형 분열 및 스폰지의 저하를 방지 하기 위해 성숙한 미르 순서의 뉴클레오티드 9-12에 배치 됩니다.</li>
		<li>원하는 경우 모든 미르-181 가족 구성원에 바인딩할 미끼 대상 시퀀스 디자인. 심사와 미르-181 가족 미르 시퀀스의 비교, 5'-측면에 8 연속 뉴클레오티드를 포함 하는 돌출의 일반적인 시퀀스 찾기 또는 3'-측면에 추가 8의 돌출의 모든 4 미르-181 가족 구성원에 게 일반적인 시퀀스를 찾을 연속 뉴클레오티드입니다. 이러한 2 시퀀스 각각 왼쪽 및 오른쪽 절반 바인딩 사이트를 나타냅니다. 참고: 미끼 시퀀스 GGA 공백에 의해 구분 된 왼쪽과 오른쪽 절반 바인딩 사이트의 직렬 식 배열입니다. 함께 5'-끝 순서 및 3'-사이드 시퀀스 (단계 1.2.2에서에서 설명)을 연결 GGA 스페이서 돌출 (단계 1.2.1에서에서와 같이)는 미르를 단련 하는 때 생성 하도록 합니다. 반복이 1 미르 바인딩 사이트 10 최종 미르-스폰지 구문에서 x.</li>
	</ol>
</li>
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다른 미르 스폰지 고려 사항 참고: 받는 사람 표정 벡터에 스폰지 시퀀스를 복제 하려면 제한 nuclease 인식 사이트 포함 되어야 합니다 시퀀스의 각 끝에. 선택한 제한 효소와 다운스트림 복제 응용 프로그램에 사용 되는 다른 제한 효소에 의해 스폰지 시퀀스의 일반적인 분열을 확인 하 철에서 소화 분석을 사용 해야 합니다.<ol>
<li>미르-181-스폰지 시퀀스는 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 대 한 코딩 시퀀스의 일부가 아니다는 5'-끝에는 합성 3' UTR의 두 배 정지 codon (TAA TAA)를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
복제에 대 한 스펀지 DNA의 합성
	<ol>
<li>DNA 합성기를 사용 하거나 복제에 대 한 장소에서 제한 nuclease 인식 사이트와 최종 미르 스폰지 시퀀스를 합성 하는 상용 소스. 스폰지는 박테리아에 증폭에 대 한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있는 플라스 미드에 제공 됩니다. 또한, 스폰지 복제에 대 한 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 될 수 또는 단순히 기증자 벡터 1.3 단계에서 설명한 제한 사이트를 사용 하 여 퇴 (또한, 단계 3.1 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 복제 조직 특정 발기인을 포함 하도록 받는 사람 벡터
참고: 미르 스폰지의 식 카세트에 대 한 받는 사람 벡터로 pEGFP C1 벡터를 사용 합니다. PEGFP-C1 벡터에는 EGFP 세포 (CMV) 모터에 의해 구동의 독서 프레임을 포함 되어 있습니다. CMV 발기인은 포유류 세포에서 constitutively 활성화 됩니다. 조직의 특정 발기인이 필요한 경우 CMV 발기인 AseI 및 NheI 효소 (단계 2.1 참조)의 소화에 의해 제거할 수 있습니다. 플라스 미드 포함 한 광범위 한 여러 복제 사이트 (MCS) 박테리아에 선택과 포유류 세포에 있는 안정 된 식에 대 한 대 (관)과 네오 마이 신 (G418) 뿐만 아니라 각각 합니다.
<ol><li>
PEGFP-c 1에서 CMV 발기인을 제거
	<ol>
<li>소화 반응 상용 다이제스트 버퍼 사용 제한 효소의 제조에 의해 제안 x 1의 50 μ, 플라스 미드 DNA (물)에서 5 μ g 및 AseI 및 NheI 효소의 5 μ를 각각 확인 합니다. Microcentrifuge 튜브에 모든 구성 요소를 추가 하 고 부드럽게 그것을 터치 하 여 그들을 믹스. 회전 10 튜브 하단에 반응 수집을 microcentrifuge에 s. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 반응을 품 어.</li>
		<li>소화 선형화 플라스 미드 정화. 열 바인딩 버퍼 (사용 되는 DNA 정화 열 제조에 대 한 적절 한 바인딩 버퍼의 독점적인 혼합)의 반응 볼륨 5를 추가 하 고 제조 업체에 의해 설명 된 대로 DNA 정화 열 반응을 정화. 열 중심에 신중 하 게 추가 차입 버퍼 (물)의 25 μ와 elute.</li>
		<li>젤 같이 0.5 %agarose 젤에 소화 플라스 미드 정화: eluted 플라스 미드를 버퍼 (50% 글리세롤-3 배 염료를 로드) 로드의 5 μ를 추가. 1 0.5 %agarose 젤에 잘로 전체 샘플을 로드 합니다. 500와 별도 레인 포함 포경된 벡터의 ng. 자르고 포경 플라스 미드의 적절 한 분리를 달성 될 때까지 30-40 분 동안 그것을 실행 합니다.</li>
		<li>다음과 같이 선형화 플라스 미드 정화: UV 라이트 박스에 agarose 젤에서 DNA를 시각화. 깨끗 한 면도날으로 선형 플라스 미드에 해당 하는 밴드를 삭제할 신중 하 게. 참고: 선형 플라스 미드 포경된 플라스 미드 보다는 더 낮은 실행 해야 하 고 단일 밴드 약 4.2 kb로 표시 됩니다. 삭제 CMV 발기인 약 500 뉴클레오티드 (nt)에 빛 밴드로 표시 됩니다.</li>
		<li>상용 키트를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 하 고 물 25 μ와 열에서 DNA elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심장 관련 발기인 pEGFP c 1로 복제 참고: 알파 myosin 무 겁 사슬 (α-MHC) 발기인은 이전 특징 이었고 다음 Molkentin, Jobe, 그리고 햄16에 설명 된 대로 심장 제한 식의 강력한 레벨을 직접 시연 했다. 다음 섹션에는 복제에 대 한 벡터의 발기인을 증폭 하는 방법을 설명 합니다.<ol>
<li>Α-MHC 발기인 요소 420 p40 플라스 미드16 에 전사 시작 사이트를 기준으로-2934를 처음으로 사이 클론 PCR를 위한 템플렛으로이 지역 그리고 플라스 미드를 측면 PCR 뇌관 설계. 증폭 PCR 뇌관 앞에서 설명한5를 사용 하 여 모터 지역. 앞으로 반전 PCR 뇌관 퓨전 감독 복제 수 있도록 pEGFP C1 (2.1 단계)의 소화 끝에 오버랩의 시퀀스를 포함 합니다. 퓨전 클로닝을 위한 뇌관 디자인의 포괄적인 설명에 퓨전 매뉴얼을 참조 하십시오. 뇌관 순서는 표 1에서 발견 된다.</li>
		<li>각 뇌관 및 10의 1 μ M를 포함 하는 50 μ PCR 반응 준비 템플릿 DNA의 ng. PCR 효소 및 선택한 PCR 시 약의 제조에 따라 dNTPs의 적절 한 금액을 추가 합니다. 표준 DNA 자전거 블록에 PCR을 수행 합니다. 수행 하는 3 분 5, 30, 및 120에 대 한 변성 시키기, 어 닐 링, 그리고 확장의 35 주기 다음 단계를 변성 시키기 98 ° C s 각각, 각각. 72 ° c.에서 10 분의 최종 확장 포함</li>
		<li>PCR 및 젤 추출 정리. 완료 되 면 PCR 주기, PCR 반응에 열 바인딩 버퍼의 반응 볼륨 x 5를 추가 하 고 제조 업체에 의해 설명 된 대로 DNA 정화 열과 그것을 정화 합니다. 열 중심에 신중 하 게 추가 차입 버퍼 (물)의 25 μ와 혼합 elute<ol>
<li>5 μ eluted 플라스 미드를 버퍼 [50% 글리세롤 (3 배) 염료를 로드] 로드를 추가 합니다. 1 %agarose 젤에 1로 전체 샘플을 로드 합니다. 30-40 분;에 대 한 실행 시각화 및 (단계 2.1.5) 위에서 설명한 대로 PCR 제품을 삭제할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음과 같이 pEGFP C1와 α-MHC 발기인 선: 10 μ 결 찰 반응 상용 결 찰 버퍼, 순화 된 PCR의 2 μ 및 선형화 벡터의 1 μ x 1을 추가. 15 분 동안 50 ° C에서 결 찰을 수행 하 고 얼음에 그것을 냉각.</li>
		<li>다음과 같이 세균 변환 수행: 구성 요소를 추가 하 여 2.5 μ-퓨전 결 찰 혼합의와 유능한 세포의 50 μ transfect. 나머지는 Eppendorf 관 40 s, 그리고 다음 장소에 대 한 42 ° C 물 욕조에 그것을 넣어 20 분 동안 얼음에 2 분 동안 얼음에 튜브.<ol>
<li>변환, 다음 SOC 미디어의 350 μ를 추가 하 고 성장 셀 칸 수행 파운드 접시에 파생물 솔루션의 45 분 접시 200 μ에 대 한 37 ° C에서 α-MHC 발기인 결 찰을 포함 하는 저항 하는 칸 셀을 식별 하는 PCR 식민지. 참고: 심사 뇌관 결 찰 교차점에서 PCR 하도록 설계 되었습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>파운드-칸 국물 및 제조 업체에 의해 설명 된 대로 표준 소형 예비 플라스 미드 정화 프로토콜을 사용 하 여 정화 하는 플라스 미드 PCR 긍정적인 클론 확장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 복제 스폰지
<ol><li>
받는 사람 벡터 소화
	<ol>
<li>Α-MHC-pEGFP 플라스 미드 EcoRI와 KpnI, 복제에 대 한 선형 고 (2.1 단계) 위에서 설명한 대로 젤을 정화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 증폭 하 고 스폰지 DNA를 소화
	<ol>
<li>PCR를 위한 서식 파일 벡터 운송 미르-181-스폰지와 해당 284-nt-긴 스크램블을 사용 합니다. 앞에서 설명한 PCR 뇌관5를 사용 하 여 스폰지 영역을 증폭. 참고 앞으로 반전 PCR 뇌관 α-MHC-pEGFP-c 1으로 결 찰을 허용 하도록 제한 효소 시퀀스를 포함 합니다. (단계 2.2.2) 위에서 설명한 대로 PCR을 수행 합니다. (2.2.3 단계)를 설명 하 고 소화를 위한 물으로 그들을 eluted 소화 전에 PCR 제품을 정화. 뇌관 시퀀스 참조 표 1.
</li>
		<li>스폰지 DNA 결 찰에 대 한 다이제스트. 50 μ 소화 반응 다이제스트 버퍼, 단계, 3.2.1에서에서 젤 정화 PCR 반응 및 효소 EcoRI와 KpnI의 5 μ x 1을 포함합니다. Microcentrifuge 튜브에 모든 구성 요소를 추가 하 고 부드럽게 그것을 터치 하 여 그들을 믹스. 회전 10 튜브 하단에 반응 수집을 microcentrifuge에 s. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 반응을 품 어.</li>
		<li>소화 PCR 스펀지 앞에서 설명한 PCR 정리 열을 사용 하 여 (단계 2.2.1) 정화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Α-MHC-pEGFP-C1 벡터에 미르-181-스폰지를 선
	<ol>
<li>21 μ 결 찰 반응 1 x 결 찰 버퍼가 포함 된 설정의 3 μ 소화 하 고 정화 하는 미르-181-스폰지 PCR, 선형화 α-MHC-pEGFP-C1 벡터의 1 μ, 1 x DNA 버퍼, 그리고 DNA 리가의 1 μ. 5 분 동안 실 온에서 결 찰을 수행 하 고 얼음에 배치.</li>
		<li>결 찰 혼합의 2 μ와 XL1 블루 유능한 세포의 50 μ를 변환. 사용 하 여 변환 하 고 (단계 2.2.5) 위에서 설명한 대로 프로토콜을 도금. 식민지 올바른 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 시퀀스를 포함 하는 칸 내성 박테리아를 식별 하는 PCR을 수행 합니다. 디자인에 PCR 뇌관 결 찰 교차점에 걸쳐 상영. 뇌관 순서 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>증폭 하 고 벡터 시퀀스. 파운드-칸 국물 및 표준 소형 예비 플라스 미드 정화 프로토콜을 사용 하 여 정화 하는 플라스 미드 PCR 긍정적인 클론 확장 합니다. 확인 원하는 DNA 시퀀스를 표현 하는 플라스 미드 DNA 시퀀싱을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 안정적인 H9c2 미르-181-스폰지 표현 세포의 생성
<ol><li>
성장 및 H9c2 세포의 유지 보수
	<ol>
<li>문화는 H9c2 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 소 태아 혈 청 (FBS)를 포함 하는 10%의 최종 농도에. 표준 프로토콜을 사용 하 여 셀을 하위 문화 5% 이산화탄소에서 37 ° C에서 그들을 성장 하 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection 그리고 H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge 표현 하는 셀의 선택
	<ol>
<li>최상의 결과 대 한 H9c2 셀의 electroporation를 수행 합니다. 출 격 스폰지 (미르-181-스폰지-시퀀스를 대체 하는 284-nt-긴 출 격 순서) 나는 electroporator와 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 구문 (H9c2) 쥐 myoblasts transfect.<ol>
<li>간단히, transfect 4 x 10-5 셀 (H2O 5 µ L)에서 플라스 미드 DNA의 2 μ g과 100 µ L electroporation 장치와 호환 되는 솔루션의. H9c2 셀 transfect에 DS-120의 electroporation 프로그램을 사용 합니다.</li>
			<li>실 온에서 10 분 동안 베트에 transfected 세포를 품 어. 베트에 직접 DMEM의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 6 잘 플레이트의 총 베트 콘텐츠 전송.</li>
		</ol>
</li>
		<li>FACs에 의해 48 h 후 transfection 후 GFP 긍정적인 셀을 선택 합니다. 네오 마이 신 (G418)의 6 잘 플레이트에 GFP 표현 셀 접시 (400ng/mL) 완전 한 성장 매체에. 참고: G418 선택 전에 죽이기 커브는 네오 마이 신 선택에 필요한 양을 결정 하 설립 되어야 합니다. H9c2 셀 400 ng/mL G418의 결과 비 플라스 미드의 약 80% 사망률 24 시간 후 H9c2 셀 페 하 고 이러한 셀 G418의 농도 원하는 작업으로 간주 되었다. 셀 라인 성장 G418 16 일 유지 했다 후 안정적으로 간주 되었다.</li>
		<li>FACs 정렬 G418 안정적인 셀 스폰지 긍정적인 선택에 대 한 표식으로 GFP의 식을 사용 하 여 수행 합니다. 흐름 정렬 하 여 96 잘 접시의 각 음에 5-10의 세포를 시드하십시오. 몇 구절을 통해 24-잘 접시를 96 잘 접시에서 단일 클로 널 세포를 확장 합니다. 셀의 사용 냉장고 주식 후속 실험에 대 한 시작 점으로 3 (P3) 셀 통로.</li>
		<li>P5 P10 사이 낮은 통로 세포와 모든 세포 라인 기반 실험을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 합성 및 스폰지-나노 입자 (미르-181-스폰지 나노 입자)의 정화
<ol><li>용 해 하 여 양이온 amphiphile (DOTAP)와 공동 지질, 콜레스테롤 및 DSPE-말뚝-오메, 5:5:0.1 m m 비율에서 각각 클로 프롬 및 유리 유리병에 메탄올의 혼합물에서 자주 나노 입자를 준비 합니다.</li>
	<li>습기 없는 질소의 부드러운 흐름에 의해 다음 회전 증발 기를 사용 하 여 진공에서 44-45 ° C에서 유기 용 매를 제거 합니다. 8 h에 대 한 높은 진공 아래 지질의 남은 건된 영화를 계속.</li>
	<li>진공 건조 지질 필름을 5% 포도 당을 추가 하 여 혼합물을 준비 합니다. 영화 화 하기 위한 것이 혼합물 수 있도록 그것을 하룻밤을 둡니다. 소용돌이 45 ° C 물 목욕에는 가끔 떨고와 multilamellar 소포를 생성 하기 위하여 실 온에서 2 ~ 3 분에 대 한 유리병.<ol>
<li>3-4 분 때까지 선명도 관찰할 수 있다, 100% 듀티 사이클 및 25 W 출력 전력에 얼음 목욕에서 작은 unilamellar 소포 준비 하 multilamellar 소포 sonicate</li>
	</ol>
</li>
	<li>출 격 시퀀스 또는 pEGFP(α-MHC) 벡터와 liposome nanovector4를 1:3 충전 비율 기준으로 복제 미르-181-스폰지 시퀀스를 혼합. 참고: 자주 나노 긍정적으로 위탁 하 고 부정 청구 플라스 미드 DNA의 복잡 한 정전기는 nanovector로 알려져 있다.</li>
</ol>6. 조직 배달 스폰지-나노 입자의 생체 내에서 효과의 유효성 검사
<ol><li>
스폰지-나노 쥐에서의 조직 배달
	<ol>
<li>Sprague-Dawley (SD) 쥐를 사용 합니다. 미르-181-스폰지 nanovector 또는 꼬리 정 맥을 통해 출 격 nanovector 쥐를 정 맥 주사. 몸 무게에 약 200 g SD 남성 쥐를 사용 합니다.</li>
		<li>Nanovector/kg 몸 무게의 4 밀리 그램의 복용량을 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입을 수행 하 고 2 주 동안 6 꼬리 정 맥 주사의 처방을 사용 하 여이 반복 합니다. 반복된 nanovector 배달 다음 벡터 비보의 표현을 위한 1 주 동안 (일 15-21)을 허용 합니다.</li>
		<li>전에, 하는 동안, 그리고 nanovector 납품 후 GFP 신호를 이미징 하 여 최적화를 확인 합니다. 단층 이미징 소프트웨어를 반 정량적 데이터를 생성 하 여 GFP 신호를 분석 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미르-181-스폰지에 의해 미르-181 저해 vivo에서 의 유효성 검사
	<ol>
<li>서쪽 오 점 기능 미르-181-스폰지 심장 조직에의 식을 보여 주기 위해 수행 합니다. 참고:이 연구를 위해 몬태나 COX1 식 시험 되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
표현의 vivo에서 미르-181-스폰지에에서 기능적 결과
	<ol>
<li>동안 심장 기능과 형태학 상 변화를 분석 하는 nanovector 납품 후 2 차원, M 모드 및 도플러 심장 초음파를 수행 합니다. 설치류 마음에 더 나은 검색 용량 15 MHz 선형 배열 트랜스듀서를 장착 한 초음파 시스템을 사용 합니다.</li>
		<li>마 취 심장 수축; 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 심장 초음파 과정 의식과 어떤 마 취 시 약 없이 동물 미르-181-스폰지 nanovector 또는 출 격 nanovector의 납품을 수행 합니다. 보십시오 Das, 외 알. 4 더 명확한 설명을 위해입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+therapy+in+an+in+vivo+microRNA-155+(miR-155)-dependent+mouse+model+of+lymphoma.">Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).</li><li>Torres, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+requirements+and+cellular+targeting+of+microRNA-122+by+peptide+nucleic+acids+anti-miRs.">Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs.</a> Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).</li><li>Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. 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저자는 공개 없다.

이 문서 설계 및 합성 미르-스폰지의 설명 하 고 어떻게 조직 전용 스폰지의 식이 조직 관련 미르 가족 식 억제 하는 강력한 도구 설명.
우리 심장 전용 모터와 스폰지를 대상으로 하는 미르-181 가족 식 플라스 미드로 복제 될 수 있습니다 설명 했다. 플라스 미드를 효율적으로 전달에 대 한 nanovector 입자에 포장 될 수 있다 생체 외에서 그리고 vivo에서 각각 electropor...

지난 2 년간 인간의 질병에 miRNAs의 중요 한 역할을 지적 하는 수많은 연구 되었습니다. 문학의 큰 몸 결과 miRNAs 질병, 암1 등 심혈 관 질환2,3,,45의 이상에의 명백한 중요성을 보여 줍니다. 예를 들어, 미르-21는 증가 세포 주기, 세포 확산6결과 많은 암에 upregulated입니다. C 형 간염 감염에서 미르-1227바이러스 복제에 중요 한 역할 하 고 미르-122의 저해 바이러스 부하8감소 표시 되었습니다. 심장 비 대에서 미르-212/132에에서 upregulated 이며 병 적인 표현 형9에 관여. downregulation의 명백한 중요성 또는 upregulated miRNA의 기능 억제 치료로 거의 모든 질병에 미르 생물학을 악용에 대 한 기회를 제안 합니다.
4 미르-181 가족 구성원, 미르-181a/b/c/d, 인간 게놈에 있는 3 개의 genomic 위치에서 찾을 수 있습니다. 비 코딩 RNA 호스트 유전자 (MIR181A1-HG)의 intronic 지역 미르-181-a/b-1의 클러스터를 인코딩합니다. NR6A1 유전자의 intronic 지역 미르-181-a/b-2를 인코딩합니다. 미르-181-c/d 클러스터는 염색체 19에 새롭거나 사본에 있습니다. 모든 미르-181 가족 같은 "씨앗" 시퀀스를 공유 하 고 모든 4 명의 미르-181 가족 구성원 잠재적으로 동일한 mRNA 표적을 통제할 수 있다.
우리3,4 등10 말기 심장 마비 동안 미르-181 가족의 중요성을 강조 했다. 우리는 또한 미르-181 c upregulation는 타입 II 당뇨병 등 심장 질환의 위험 증가, 비만, 노화3,,45와 관련 된 병 적인 조건 하에서 발생 하는 것을 인식 했다. 그것은 overexpression 미르-181 c의 산화 스트레스는 심장 부전4에 이르게 하면 가정 되었습니다.
미토 콘 드리 아11,12,,1314에 존재 하는 miRNA 하지만 우리 미르-181 c 처리, 핵 게놈에서 파생 된 증명을 최초로 여러 그룹 제안 및 그 후 translocated RISC3에서 미토 콘 드리 아에. 또한, 우리 심장5의 미토 콘 드리 아 구획에 181a 미르와 미르-181b 낮은 식을 감지 했습니다. 중요 한 것은, 우리는 발견 그 미르-181 c 누르는 mt COX1 mRNA 식 miRNAs 미토 콘 드리 아 유전자 규칙에 참여 하 고 미토 콘 드리 아 기능3,4를 변경 함으로써 시연.
이 문서는 cardiomyocytes에 미르-181 가족 전체를 허물고 미르-스폰지를 디자인 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다. 또한, 우리 미르-181-스폰지의 비보에 응용 프로그램에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>pEGFP-C1 vector</td><td>Addgene</td><td>6084-1</td><td></td></tr><tr><td>In-fusion</td><td>Clontech</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>miR-181-sponge synthesis</td><td>Introgen GeneArt</td><td>custome made</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custome</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI enzymes</td><td>New Endland Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI enzymes</td><td>New Endland Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>Rapid DNA Ligation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11635379001</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1446</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Device</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)</td><td>Lonza</td><td>VCA-1005</td><td></td></tr><tr><td>G418, Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II Flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Branson 450 sonifier</td><td>Marshall Scientific</td><td>EDP 100-214-239</td><td></td></tr><tr><td>The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-MTCO1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab14705</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab7291</td><td></td></tr><tr><td>Sequoia C256 ultrasound system</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge

예측에 관한 (미르)은 작은 비 코딩 RNA는 post-transcriptional 메신저 RNA (mRNA) 식 억제. 인간의 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 같은 조직 및/또는 질병 진행과 관련 된 셀 전용 미르 식 활성화를 표시 되었습니다. MiRNA 식의 억제 치료 적 개입에 대 한 가능성을 제공합니다. 그러나, miRNAs, antagomir oligonucleotides 채용을 억제 하는 기존의 방법과 글로벌 배달 시 특정 miRNA의 기능에 영향을. 여기, 우리가 쥐 모델에서 미르-181 가족의 비보에 심장 관련 금지에 대 한 프로토콜을 제시. 미르-스폰지 구조는 10 반복된 안티 miR-181 바인딩 시퀀스를 포함 하도록 설계 되었습니다. 심장 관련 α-MHC 발기인은 심장 관련 미르-181 미르-스펀지 식 드라이브를 pEGFP 등뼈에 복제 됩니다. 안정적인 셀을 만들려면 미르-181-스폰지, myoblast H9c2 셀을 표현 하는 라인 α-MHC-EGFP-miR-181-sponge 구조와 페 되 고 형광 활성화 된 세포 (FACs) 네오 마이 신으로 교양 GFP 긍정적인 H9c2 세포로 정렬 하 여 정렬 (G418)입니다. 네오 마이 신에 안정적인 성장, 단일 클로 널 세포 인구 추가 FACs 및 단일 세포 복제에 의해 설립 됩니다. 결과 myoblast H9c2-미르-181-스폰지-GFP 셀 미르-181 대상 단백질의 증가 된 표현을 통해 평가 미르-181 가족 구성원의 기능의 손실을 전시 하 고 출 격 비 기능 스폰지를 표현 하는 H9c2 세포에 비해. 또한, 우리는 complexing 긍정적으로 자주 나노 입자를 충전 하 고 부정적으로 위탁 미르-181-스폰지 플라스 미드에 의해 미르-181-스폰지 구문의 체계적 전달에 대 한 nanovector를 개발 한다. GFP의 이미징 vivo에서 3 주 기간 동안에 nanovector의 여러 꼬리 정 맥 주사는 심장 특정 방식으로 미르-181-스폰지의 중요 한 식 홍보 수 있습니다 밝혀. 중요 한 것은, 미르-181 기능의 상실 심 혼 직물에는 신장 이나 간만 관측 된다. 미르-스폰지 조직 관련 미르 식 억제 하는 강력한 방법입니다. 미르-스폰지 식 조직 특정 발기인에서 운전 대상된 기관 또는 조직에 국한 될 수 미르 저해에 대 한 특이성을 제공 합니다. 또한, nanovector 및 미르-스폰지 기술을 결합 한 효과적인 배달 및 조직 관련 미르 저해에서 vivo에서허용 합니다.

안정적으로 transfected pEGFP-미르-181-스폰지-표현 H9c2 세포에서 (4.2 단계)에서 미르-181 가족 전체 (미르 181a, 미르 181b, 미르-181 c, 그리고 미르-181 d)의 표현 알맞게 H9c2 셀 pEGFP 발진 표현에 상대적으로 감소 했다. 그래서 우리가 예상 전체 미르-181 가족의 경쟁적 억제제로 미르-181-스폰지 역할 mt COX1 증가 식은 미르-181 c의 미토 콘 드리 아 유전자를 대상. 서쪽 오 점 데이터 제안 mt...

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In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

in-vivo-nanovector-delivery-of-a-heart-specific-microrna-sponge

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

7.3K 조회수.  University of Toronto. 조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

비디오: In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

연구

유전학

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

나노-중재 siRNA 유전자 입을 성인 Zebrafish 마음에

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

발생학

<meta charset="utf8"></head><body>전이성 유방암 치료를 위한 발암성 miRNA-10b를 표적으로 하는 나노약물

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

암 연구학

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

신경과학

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

의학

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>In Vivo 유전자 조절을 위한 Lentiviral 벡터 준비

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring tissues. Their functions are dictated by microenvironmental cues; thus, it is essential to investigate their behavior in an in vivo physiological niche. Currently, specific peritoneal macrophage-targeting methodologies employ whole-mouse transgenic models. Here, a protocol for effective in vivo modulation of mRNA and small RNA species (e.g., microRNA) expression in peritoneal macrophages using lentivirus particles is described. Lentivirus preparations were made in HEK293T cells and purified on a single sucrose layer. In vivo validation of lentivirus effectivity following intraperitoneal injection revealed predominant infection of macrophages restricted to local tissue. Targeting of peritoneal macrophages was successful during homeostasis and thioglycolate-induced peritonitis. The limitations of the protocol, including low-level inflammation induced by intraperitoneal delivery of lentivirus and time restrictions for potential experiments, are discussed. Overall, this study presents a quick and accessible protocol for the rapid assessment of gene function in peritoneal macrophages in vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Exploring Macrophage Immunometabolism Through Lentiviral Vector-Mediated Gene Manipulation (렌티바이러스 벡터 매개 유전자 조작을 통한 대식세포 면역대사 탐색)

We demonstrate a step-by-step protocol for the investigation of gene function in peritoneal tissue-resident macrophages in vivo, using lentiviral vectors.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품

나노-중재 siRNA 유전자 입을 성인 Zebrafish 마음에

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

준비 및

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비