우리 학과의 생화학 및 분자 생물학의 안토니 K. L. 렁 감사, 블룸버그 공중 보건의, 존스 홉킨스 대학 그의 기술에 대 한 미르-181-스폰지 구조 설계 도움. 우리는 또한 한국 Sysa-샤와 부의 분자와 비교 Pathobiology, 미르-스폰지 배달의 vivo에서 화상 진 찰에 의해 그들의 기술 지원에 대 한 존스 홉킨스 의료 기관의 캐슬 린 Gabrielson 감사합니다.
이 작품은 NIH, (찰스 스 틴 버 켄)를 HL39752에서에서 교부 금에 의해 그리고 과학자 개발에서에서 교부 금 미국 심장 협회 14SDG18890049 (Samarjit Das)에 의해 지원 되었다. 쥐 심장 관련 발기인 아낌없이 제프리 D. Molkentin 신시내티 아동 병원에 의해 제공 되었다.

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었다.
1. 스폰지 디자인
<ol><li>
바인딩 3' UTR 예측에 관한 참고: 특정 기본 쌍 상호 작용을 통해 3' 되지 않은 지역 (UTR)에 부분적으로 무료 사이트와 그것의 표적 mRNAs의 A 미르 기능 (종합적인 검토에 대 한 참조 Bartel)15.<ol>
<li>MiRNA 식 oligonucleotides 상당한 complementarity 미르 시퀀스에 포함 된로 억제제를 디자인 합니다. 미르는 oligonucleotide 미르 기능을 차단 하는 광범위 한 기본 쌍을 통해 복잡 한에 격리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiRNA 스폰지의 디자인
	<ol>
<li>Tandemly 기준점과 부분적으로 보완 미르 시퀀스 Argonaute 2에 의해 일반적으로 죽 습 위치에 돌출을 포함 하도록 디자인. 돌출은 RNA 간섭 유형 분열 및 스폰지의 저하를 방지 하기 위해 성숙한 미르 순서의 뉴클레오티드 9-12에 배치 됩니다.</li>
		<li>원하는 경우 모든 미르-181 가족 구성원에 바인딩할 미끼 대상 시퀀스 디자인. 심사와 미르-181 가족 미르 시퀀스의 비교, 5'-측면에 8 연속 뉴클레오티드를 포함 하는 돌출의 일반적인 시퀀스 찾기 또는 3'-측면에 추가 8의 돌출의 모든 4 미르-181 가족 구성원에 게 일반적인 시퀀스를 찾을 연속 뉴클레오티드입니다. 이러한 2 시퀀스 각각 왼쪽 및 오른쪽 절반 바인딩 사이트를 나타냅니다. 참고: 미끼 시퀀스 GGA 공백에 의해 구분 된 왼쪽과 오른쪽 절반 바인딩 사이트의 직렬 식 배열입니다. 함께 5'-끝 순서 및 3'-사이드 시퀀스 (단계 1.2.2에서에서 설명)을 연결 GGA 스페이서 돌출 (단계 1.2.1에서에서와 같이)는 미르를 단련 하는 때 생성 하도록 합니다. 반복이 1 미르 바인딩 사이트 10 최종 미르-스폰지 구문에서 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다른 미르 스폰지 고려 사항 참고: 받는 사람 표정 벡터에 스폰지 시퀀스를 복제 하려면 제한 nuclease 인식 사이트 포함 되어야 합니다 시퀀스의 각 끝에. 선택한 제한 효소와 다운스트림 복제 응용 프로그램에 사용 되는 다른 제한 효소에 의해 스폰지 시퀀스의 일반적인 분열을 확인 하 철에서 소화 분석을 사용 해야 합니다.<ol>
<li>미르-181-스폰지 시퀀스는 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 대 한 코딩 시퀀스의 일부가 아니다는 5'-끝에는 합성 3' UTR의 두 배 정지 codon (TAA TAA)를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
복제에 대 한 스펀지 DNA의 합성
	<ol>
<li>DNA 합성기를 사용 하거나 복제에 대 한 장소에서 제한 nuclease 인식 사이트와 최종 미르 스폰지 시퀀스를 합성 하는 상용 소스. 스폰지는 박테리아에 증폭에 대 한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있는 플라스 미드에 제공 됩니다. 또한, 스폰지 복제에 대 한 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 될 수 또는 단순히 기증자 벡터 1.3 단계에서 설명한 제한 사이트를 사용 하 여 퇴 (또한, 단계 3.1 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 복제 조직 특정 발기인을 포함 하도록 받는 사람 벡터
참고: 미르 스폰지의 식 카세트에 대 한 받는 사람 벡터로 pEGFP C1 벡터를 사용 합니다. PEGFP-C1 벡터에는 EGFP 세포 (CMV) 모터에 의해 구동의 독서 프레임을 포함 되어 있습니다. CMV 발기인은 포유류 세포에서 constitutively 활성화 됩니다. 조직의 특정 발기인이 필요한 경우 CMV 발기인 AseI 및 NheI 효소 (단계 2.1 참조)의 소화에 의해 제거할 수 있습니다. 플라스 미드 포함 한 광범위 한 여러 복제 사이트 (MCS) 박테리아에 선택과 포유류 세포에 있는 안정 된 식에 대 한 대 (관)과 네오 마이 신 (G418) 뿐만 아니라 각각 합니다.
<ol><li>
PEGFP-c 1에서 CMV 발기인을 제거
	<ol>
<li>소화 반응 상용 다이제스트 버퍼 사용 제한 효소의 제조에 의해 제안 x 1의 50 μ, 플라스 미드 DNA (물)에서 5 μ g 및 AseI 및 NheI 효소의 5 μ를 각각 확인 합니다. Microcentrifuge 튜브에 모든 구성 요소를 추가 하 고 부드럽게 그것을 터치 하 여 그들을 믹스. 회전 10 튜브 하단에 반응 수집을 microcentrifuge에 s. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 반응을 품 어.</li>
		<li>소화 선형화 플라스 미드 정화. 열 바인딩 버퍼 (사용 되는 DNA 정화 열 제조에 대 한 적절 한 바인딩 버퍼의 독점적인 혼합)의 반응 볼륨 5를 추가 하 고 제조 업체에 의해 설명 된 대로 DNA 정화 열 반응을 정화. 열 중심에 신중 하 게 추가 차입 버퍼 (물)의 25 μ와 elute.</li>
		<li>젤 같이 0.5 %agarose 젤에 소화 플라스 미드 정화: eluted 플라스 미드를 버퍼 (50% 글리세롤-3 배 염료를 로드) 로드의 5 μ를 추가. 1 0.5 %agarose 젤에 잘로 전체 샘플을 로드 합니다. 500와 별도 레인 포함 포경된 벡터의 ng. 자르고 포경 플라스 미드의 적절 한 분리를 달성 될 때까지 30-40 분 동안 그것을 실행 합니다.</li>
		<li>다음과 같이 선형화 플라스 미드 정화: UV 라이트 박스에 agarose 젤에서 DNA를 시각화. 깨끗 한 면도날으로 선형 플라스 미드에 해당 하는 밴드를 삭제할 신중 하 게. 참고: 선형 플라스 미드 포경된 플라스 미드 보다는 더 낮은 실행 해야 하 고 단일 밴드 약 4.2 kb로 표시 됩니다. 삭제 CMV 발기인 약 500 뉴클레오티드 (nt)에 빛 밴드로 표시 됩니다.</li>
		<li>상용 키트를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 하 고 물 25 μ와 열에서 DNA elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심장 관련 발기인 pEGFP c 1로 복제 참고: 알파 myosin 무 겁 사슬 (α-MHC) 발기인은 이전 특징 이었고 다음 Molkentin, Jobe, 그리고 햄16에 설명 된 대로 심장 제한 식의 강력한 레벨을 직접 시연 했다. 다음 섹션에는 복제에 대 한 벡터의 발기인을 증폭 하는 방법을 설명 합니다.<ol>
<li>Α-MHC 발기인 요소 420 p40 플라스 미드16 에 전사 시작 사이트를 기준으로-2934를 처음으로 사이 클론 PCR를 위한 템플렛으로이 지역 그리고 플라스 미드를 측면 PCR 뇌관 설계. 증폭 PCR 뇌관 앞에서 설명한5를 사용 하 여 모터 지역. 앞으로 반전 PCR 뇌관 퓨전 감독 복제 수 있도록 pEGFP C1 (2.1 단계)의 소화 끝에 오버랩의 시퀀스를 포함 합니다. 퓨전 클로닝을 위한 뇌관 디자인의 포괄적인 설명에 퓨전 매뉴얼을 참조 하십시오. 뇌관 순서는 표 1에서 발견 된다.</li>
		<li>각 뇌관 및 10의 1 μ M를 포함 하는 50 μ PCR 반응 준비 템플릿 DNA의 ng. PCR 효소 및 선택한 PCR 시 약의 제조에 따라 dNTPs의 적절 한 금액을 추가 합니다. 표준 DNA 자전거 블록에 PCR을 수행 합니다. 수행 하는 3 분 5, 30, 및 120에 대 한 변성 시키기, 어 닐 링, 그리고 확장의 35 주기 다음 단계를 변성 시키기 98 ° C s 각각, 각각. 72 ° c.에서 10 분의 최종 확장 포함</li>
		<li>PCR 및 젤 추출 정리. 완료 되 면 PCR 주기, PCR 반응에 열 바인딩 버퍼의 반응 볼륨 x 5를 추가 하 고 제조 업체에 의해 설명 된 대로 DNA 정화 열과 그것을 정화 합니다. 열 중심에 신중 하 게 추가 차입 버퍼 (물)의 25 μ와 혼합 elute<ol>
<li>5 μ eluted 플라스 미드를 버퍼 [50% 글리세롤 (3 배) 염료를 로드] 로드를 추가 합니다. 1 %agarose 젤에 1로 전체 샘플을 로드 합니다. 30-40 분;에 대 한 실행 시각화 및 (단계 2.1.5) 위에서 설명한 대로 PCR 제품을 삭제할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음과 같이 pEGFP C1와 α-MHC 발기인 선: 10 μ 결 찰 반응 상용 결 찰 버퍼, 순화 된 PCR의 2 μ 및 선형화 벡터의 1 μ x 1을 추가. 15 분 동안 50 ° C에서 결 찰을 수행 하 고 얼음에 그것을 냉각.</li>
		<li>다음과 같이 세균 변환 수행: 구성 요소를 추가 하 여 2.5 μ-퓨전 결 찰 혼합의와 유능한 세포의 50 μ transfect. 나머지는 Eppendorf 관 40 s, 그리고 다음 장소에 대 한 42 ° C 물 욕조에 그것을 넣어 20 분 동안 얼음에 2 분 동안 얼음에 튜브.<ol>
<li>변환, 다음 SOC 미디어의 350 μ를 추가 하 고 성장 셀 칸 수행 파운드 접시에 파생물 솔루션의 45 분 접시 200 μ에 대 한 37 ° C에서 α-MHC 발기인 결 찰을 포함 하는 저항 하는 칸 셀을 식별 하는 PCR 식민지. 참고: 심사 뇌관 결 찰 교차점에서 PCR 하도록 설계 되었습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>파운드-칸 국물 및 제조 업체에 의해 설명 된 대로 표준 소형 예비 플라스 미드 정화 프로토콜을 사용 하 여 정화 하는 플라스 미드 PCR 긍정적인 클론 확장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 복제 스폰지
<ol><li>
받는 사람 벡터 소화
	<ol>
<li>Α-MHC-pEGFP 플라스 미드 EcoRI와 KpnI, 복제에 대 한 선형 고 (2.1 단계) 위에서 설명한 대로 젤을 정화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 증폭 하 고 스폰지 DNA를 소화
	<ol>
<li>PCR를 위한 서식 파일 벡터 운송 미르-181-스폰지와 해당 284-nt-긴 스크램블을 사용 합니다. 앞에서 설명한 PCR 뇌관5를 사용 하 여 스폰지 영역을 증폭. 참고 앞으로 반전 PCR 뇌관 α-MHC-pEGFP-c 1으로 결 찰을 허용 하도록 제한 효소 시퀀스를 포함 합니다. (단계 2.2.2) 위에서 설명한 대로 PCR을 수행 합니다. (2.2.3 단계)를 설명 하 고 소화를 위한 물으로 그들을 eluted 소화 전에 PCR 제품을 정화. 뇌관 시퀀스 참조 표 1.
</li>
		<li>스폰지 DNA 결 찰에 대 한 다이제스트. 50 μ 소화 반응 다이제스트 버퍼, 단계, 3.2.1에서에서 젤 정화 PCR 반응 및 효소 EcoRI와 KpnI의 5 μ x 1을 포함합니다. Microcentrifuge 튜브에 모든 구성 요소를 추가 하 고 부드럽게 그것을 터치 하 여 그들을 믹스. 회전 10 튜브 하단에 반응 수집을 microcentrifuge에 s. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 반응을 품 어.</li>
		<li>소화 PCR 스펀지 앞에서 설명한 PCR 정리 열을 사용 하 여 (단계 2.2.1) 정화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Α-MHC-pEGFP-C1 벡터에 미르-181-스폰지를 선
	<ol>
<li>21 μ 결 찰 반응 1 x 결 찰 버퍼가 포함 된 설정의 3 μ 소화 하 고 정화 하는 미르-181-스폰지 PCR, 선형화 α-MHC-pEGFP-C1 벡터의 1 μ, 1 x DNA 버퍼, 그리고 DNA 리가의 1 μ. 5 분 동안 실 온에서 결 찰을 수행 하 고 얼음에 배치.</li>
		<li>결 찰 혼합의 2 μ와 XL1 블루 유능한 세포의 50 μ를 변환. 사용 하 여 변환 하 고 (단계 2.2.5) 위에서 설명한 대로 프로토콜을 도금. 식민지 올바른 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 시퀀스를 포함 하는 칸 내성 박테리아를 식별 하는 PCR을 수행 합니다. 디자인에 PCR 뇌관 결 찰 교차점에 걸쳐 상영. 뇌관 순서 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>증폭 하 고 벡터 시퀀스. 파운드-칸 국물 및 표준 소형 예비 플라스 미드 정화 프로토콜을 사용 하 여 정화 하는 플라스 미드 PCR 긍정적인 클론 확장 합니다. 확인 원하는 DNA 시퀀스를 표현 하는 플라스 미드 DNA 시퀀싱을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 안정적인 H9c2 미르-181-스폰지 표현 세포의 생성
<ol><li>
성장 및 H9c2 세포의 유지 보수
	<ol>
<li>문화는 H9c2 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 소 태아 혈 청 (FBS)를 포함 하는 10%의 최종 농도에. 표준 프로토콜을 사용 하 여 셀을 하위 문화 5% 이산화탄소에서 37 ° C에서 그들을 성장 하 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection 그리고 H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge 표현 하는 셀의 선택
	<ol>
<li>최상의 결과 대 한 H9c2 셀의 electroporation를 수행 합니다. 출 격 스폰지 (미르-181-스폰지-시퀀스를 대체 하는 284-nt-긴 출 격 순서) 나는 electroporator와 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 구문 (H9c2) 쥐 myoblasts transfect.<ol>
<li>간단히, transfect 4 x 10-5 셀 (H2O 5 µ L)에서 플라스 미드 DNA의 2 μ g과 100 µ L electroporation 장치와 호환 되는 솔루션의. H9c2 셀 transfect에 DS-120의 electroporation 프로그램을 사용 합니다.</li>
			<li>실 온에서 10 분 동안 베트에 transfected 세포를 품 어. 베트에 직접 DMEM의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 6 잘 플레이트의 총 베트 콘텐츠 전송.</li>
		</ol>
</li>
		<li>FACs에 의해 48 h 후 transfection 후 GFP 긍정적인 셀을 선택 합니다. 네오 마이 신 (G418)의 6 잘 플레이트에 GFP 표현 셀 접시 (400ng/mL) 완전 한 성장 매체에. 참고: G418 선택 전에 죽이기 커브는 네오 마이 신 선택에 필요한 양을 결정 하 설립 되어야 합니다. H9c2 셀 400 ng/mL G418의 결과 비 플라스 미드의 약 80% 사망률 24 시간 후 H9c2 셀 페 하 고 이러한 셀 G418의 농도 원하는 작업으로 간주 되었다. 셀 라인 성장 G418 16 일 유지 했다 후 안정적으로 간주 되었다.</li>
		<li>FACs 정렬 G418 안정적인 셀 스폰지 긍정적인 선택에 대 한 표식으로 GFP의 식을 사용 하 여 수행 합니다. 흐름 정렬 하 여 96 잘 접시의 각 음에 5-10의 세포를 시드하십시오. 몇 구절을 통해 24-잘 접시를 96 잘 접시에서 단일 클로 널 세포를 확장 합니다. 셀의 사용 냉장고 주식 후속 실험에 대 한 시작 점으로 3 (P3) 셀 통로.</li>
		<li>P5 P10 사이 낮은 통로 세포와 모든 세포 라인 기반 실험을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 합성 및 스폰지-나노 입자 (미르-181-스폰지 나노 입자)의 정화
<ol><li>용 해 하 여 양이온 amphiphile (DOTAP)와 공동 지질, 콜레스테롤 및 DSPE-말뚝-오메, 5:5:0.1 m m 비율에서 각각 클로 프롬 및 유리 유리병에 메탄올의 혼합물에서 자주 나노 입자를 준비 합니다.</li>
	<li>습기 없는 질소의 부드러운 흐름에 의해 다음 회전 증발 기를 사용 하 여 진공에서 44-45 ° C에서 유기 용 매를 제거 합니다. 8 h에 대 한 높은 진공 아래 지질의 남은 건된 영화를 계속.</li>
	<li>진공 건조 지질 필름을 5% 포도 당을 추가 하 여 혼합물을 준비 합니다. 영화 화 하기 위한 것이 혼합물 수 있도록 그것을 하룻밤을 둡니다. 소용돌이 45 ° C 물 목욕에는 가끔 떨고와 multilamellar 소포를 생성 하기 위하여 실 온에서 2 ~ 3 분에 대 한 유리병.<ol>
<li>3-4 분 때까지 선명도 관찰할 수 있다, 100% 듀티 사이클 및 25 W 출력 전력에 얼음 목욕에서 작은 unilamellar 소포 준비 하 multilamellar 소포 sonicate</li>
	</ol>
</li>
	<li>출 격 시퀀스 또는 pEGFP(α-MHC) 벡터와 liposome nanovector4를 1:3 충전 비율 기준으로 복제 미르-181-스폰지 시퀀스를 혼합. 참고: 자주 나노 긍정적으로 위탁 하 고 부정 청구 플라스 미드 DNA의 복잡 한 정전기는 nanovector로 알려져 있다.</li>
</ol>6. 조직 배달 스폰지-나노 입자의 생체 내에서 효과의 유효성 검사
<ol><li>
스폰지-나노 쥐에서의 조직 배달
	<ol>
<li>Sprague-Dawley (SD) 쥐를 사용 합니다. 미르-181-스폰지 nanovector 또는 꼬리 정 맥을 통해 출 격 nanovector 쥐를 정 맥 주사. 몸 무게에 약 200 g SD 남성 쥐를 사용 합니다.</li>
		<li>Nanovector/kg 몸 무게의 4 밀리 그램의 복용량을 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입을 수행 하 고 2 주 동안 6 꼬리 정 맥 주사의 처방을 사용 하 여이 반복 합니다. 반복된 nanovector 배달 다음 벡터 비보의 표현을 위한 1 주 동안 (일 15-21)을 허용 합니다.</li>
		<li>전에, 하는 동안, 그리고 nanovector 납품 후 GFP 신호를 이미징 하 여 최적화를 확인 합니다. 단층 이미징 소프트웨어를 반 정량적 데이터를 생성 하 여 GFP 신호를 분석 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미르-181-스폰지에 의해 미르-181 저해 vivo에서 의 유효성 검사
	<ol>
<li>서쪽 오 점 기능 미르-181-스폰지 심장 조직에의 식을 보여 주기 위해 수행 합니다. 참고:이 연구를 위해 몬태나 COX1 식 시험 되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
표현의 vivo에서 미르-181-스폰지에에서 기능적 결과
	<ol>
<li>동안 심장 기능과 형태학 상 변화를 분석 하는 nanovector 납품 후 2 차원, M 모드 및 도플러 심장 초음파를 수행 합니다. 설치류 마음에 더 나은 검색 용량 15 MHz 선형 배열 트랜스듀서를 장착 한 초음파 시스템을 사용 합니다.</li>
		<li>마 취 심장 수축; 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 심장 초음파 과정 의식과 어떤 마 취 시 약 없이 동물 미르-181-스폰지 nanovector 또는 출 격 nanovector의 납품을 수행 합니다. 보십시오 Das, 외 알. 4 더 명확한 설명을 위해입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181+and+metabolic+regulation+in+the+immune+system.">miR-181 and metabolic regulation in the immune system.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).</li><li>Hori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+regulates+vascular+stiffness+age+dependently+in+part+by+regulating+TGF-beta+signaling.">miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling.</a> PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+with+antisense+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides.</a> Methods. 44 (1), 55-60 (2008).</li><li>Stenvang, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+targets+for+antisense-based+therapeutics.">MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+comparison+of+anti-microRNA+oligonucleotide+potency.">A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency.</a> Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+and+design+of+anti-miRNA+oligonucleotides.">Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides.</a> Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).</li><li>van Rooij, E., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics+for+cardiovascular+disease:+opportunities+and+obstacles.">MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).</li><li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3 (1), 1 (2012).</li><li>Levin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+issues+in+the+pharmacokinetics+and+toxicology+of+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides.">A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).</li><li>Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+miR-214+modulates+Hedgehog+signaling+to+specify+muscle+cell+fate.">Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate.</a> Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inhibition+of+miRNA+maturation+with+morpholinos+reveals+a+role+for+miR-375+in+pancreatic+islet+development.">Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development.</a> PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).</li><li>Martello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+of+Nodal+signalling.">MicroRNA control of Nodal signalling.</a> Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).</li><li>Fabani, M. M., Gait, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+targeting+with+LNA/2'-O-methyl+oligonucleotide+mixmers,+peptide+nucleic+acids+(PNA),+and+PNA-peptide+conjugates.">miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates.</a> RNA. 14 (2), 336-346 (2008).</li><li>Fabani, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+miR-155+function+in+vivo+by+peptide+nucleic+acids.">Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).</li><li>Babar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+therapy+in+an+in+vivo+microRNA-155+(miR-155)-dependent+mouse+model+of+lymphoma.">Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).</li><li>Torres, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+requirements+and+cellular+targeting+of+microRNA-122+by+peptide+nucleic+acids+anti-miRs.">Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs.</a> Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).</li><li>Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+miR-143/145:+the+importance+of+cell-type+localization+of+miRNAs.">Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 문서 설계 및 합성 미르-스폰지의 설명 하 고 어떻게 조직 전용 스폰지의 식이 조직 관련 미르 가족 식 억제 하는 강력한 도구 설명.
우리 심장 전용 모터와 스폰지를 대상으로 하는 미르-181 가족 식 플라스 미드로 복제 될 수 있습니다 설명 했다. 플라스 미드를 효율적으로 전달에 대 한 nanovector 입자에 포장 될 수 있다 생체 외에서 그리고 vivo에서 각각 electropor...

지난 2 년간 인간의 질병에 miRNAs의 중요 한 역할을 지적 하는 수많은 연구 되었습니다. 문학의 큰 몸 결과 miRNAs 질병, 암1 등 심혈 관 질환2,3,,45의 이상에의 명백한 중요성을 보여 줍니다. 예를 들어, 미르-21는 증가 세포 주기, 세포 확산6결과 많은 암에 upregulated입니다. C 형 간염 감염에서 미르-1227바이러스 복제에 중요 한 역할 하 고 미르-122의 저해 바이러스 부하8감소 표시 되었습니다. 심장 비 대에서 미르-212/132에에서 upregulated 이며 병 적인 표현 형9에 관여. downregulation의 명백한 중요성 또는 upregulated miRNA의 기능 억제 치료로 거의 모든 질병에 미르 생물학을 악용에 대 한 기회를 제안 합니다.
4 미르-181 가족 구성원, 미르-181a/b/c/d, 인간 게놈에 있는 3 개의 genomic 위치에서 찾을 수 있습니다. 비 코딩 RNA 호스트 유전자 (MIR181A1-HG)의 intronic 지역 미르-181-a/b-1의 클러스터를 인코딩합니다. NR6A1 유전자의 intronic 지역 미르-181-a/b-2를 인코딩합니다. 미르-181-c/d 클러스터는 염색체 19에 새롭거나 사본에 있습니다. 모든 미르-181 가족 같은 "씨앗" 시퀀스를 공유 하 고 모든 4 명의 미르-181 가족 구성원 잠재적으로 동일한 mRNA 표적을 통제할 수 있다.
우리3,4 등10 말기 심장 마비 동안 미르-181 가족의 중요성을 강조 했다. 우리는 또한 미르-181 c upregulation는 타입 II 당뇨병 등 심장 질환의 위험 증가, 비만, 노화3,,45와 관련 된 병 적인 조건 하에서 발생 하는 것을 인식 했다. 그것은 overexpression 미르-181 c의 산화 스트레스는 심장 부전4에 이르게 하면 가정 되었습니다.
미토 콘 드리 아11,12,,1314에 존재 하는 miRNA 하지만 우리 미르-181 c 처리, 핵 게놈에서 파생 된 증명을 최초로 여러 그룹 제안 및 그 후 translocated RISC3에서 미토 콘 드리 아에. 또한, 우리 심장5의 미토 콘 드리 아 구획에 181a 미르와 미르-181b 낮은 식을 감지 했습니다. 중요 한 것은, 우리는 발견 그 미르-181 c 누르는 mt COX1 mRNA 식 miRNAs 미토 콘 드리 아 유전자 규칙에 참여 하 고 미토 콘 드리 아 기능3,4를 변경 함으로써 시연.
이 문서는 cardiomyocytes에 미르-181 가족 전체를 허물고 미르-스폰지를 디자인 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다. 또한, 우리 미르-181-스폰지의 비보에 응용 프로그램에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-fusion</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Miniprep</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-181-sponge synthesis</td>
			<td>Introgen GeneArt</td>
			<td>custome made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI enzymes</td>
			<td>New Endland Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI enzymes</td>
			<td>New Endland Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11635379001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418, Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 sonifier</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EDP 100-214-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MTCO1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequoia C256 ultrasound system</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge

예측에 관한 (미르)은 작은 비 코딩 RNA는 post-transcriptional 메신저 RNA (mRNA) 식 억제. 인간의 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 같은 조직 및/또는 질병 진행과 관련 된 셀 전용 미르 식 활성화를 표시 되었습니다. MiRNA 식의 억제 치료 적 개입에 대 한 가능성을 제공합니다. 그러나, miRNAs, antagomir oligonucleotides 채용을 억제 하는 기존의 방법과 글로벌 배달 시 특정 miRNA의 기능에 영향을. 여기, 우리가 쥐 모델에서 미르-181 가족의 비보에 심장 관련 금지에 대 한 프로토콜을 제시. 미르-스폰지 구조는 10 반복된 안티 miR-181 바인딩 시퀀스를 포함 하도록 설계 되었습니다. 심장 관련 α-MHC 발기인은 심장 관련 미르-181 미르-스펀지 식 드라이브를 pEGFP 등뼈에 복제 됩니다. 안정적인 셀을 만들려면 미르-181-스폰지, myoblast H9c2 셀을 표현 하는 라인 α-MHC-EGFP-miR-181-sponge 구조와 페 되 고 형광 활성화 된 세포 (FACs) 네오 마이 신으로 교양 GFP 긍정적인 H9c2 세포로 정렬 하 여 정렬 (G418)입니다. 네오 마이 신에 안정적인 성장, 단일 클로 널 세포 인구 추가 FACs 및 단일 세포 복제에 의해 설립 됩니다. 결과 myoblast H9c2-미르-181-스폰지-GFP 셀 미르-181 대상 단백질의 증가 된 표현을 통해 평가 미르-181 가족 구성원의 기능의 손실을 전시 하 고 출 격 비 기능 스폰지를 표현 하는 H9c2 세포에 비해. 또한, 우리는 complexing 긍정적으로 자주 나노 입자를 충전 하 고 부정적으로 위탁 미르-181-스폰지 플라스 미드에 의해 미르-181-스폰지 구문의 체계적 전달에 대 한 nanovector를 개발 한다. GFP의 이미징 vivo에서 3 주 기간 동안에 nanovector의 여러 꼬리 정 맥 주사는 심장 특정 방식으로 미르-181-스폰지의 중요 한 식 홍보 수 있습니다 밝혀. 중요 한 것은, 미르-181 기능의 상실 심 혼 직물에는 신장 이나 간만 관측 된다. 미르-스폰지 조직 관련 미르 식 억제 하는 강력한 방법입니다. 미르-스폰지 식 조직 특정 발기인에서 운전 대상된 기관 또는 조직에 국한 될 수 미르 저해에 대 한 특이성을 제공 합니다. 또한, nanovector 및 미르-스폰지 기술을 결합 한 효과적인 배달 및 조직 관련 미르 저해에서 vivo에서허용 합니다.

안정적으로 transfected pEGFP-미르-181-스폰지-표현 H9c2 세포에서 (4.2 단계)에서 미르-181 가족 전체 (미르 181a, 미르 181b, 미르-181 c, 그리고 미르-181 d)의 표현 알맞게 H9c2 셀 pEGFP 발진 표현에 상대적으로 감소 했다. 그래서 우리가 예상 전체 미르-181 가족의 경쟁적 억제제로 미르-181-스폰지 역할 mt COX1 증가 식은 미르-181 c의 미토 콘 드리 아 유전자를 대상. 서쪽 오 점 데이터 제안 mt...

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In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

in-vivo-nanovector-delivery-of-a-heart-specific-microrna-sponge

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

7.3K 조회수.  University of Toronto. 조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

비디오: In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction.  (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns.

Neuroactive 대리점 지속 배달 Microinfusion 시스템의 구축 및 주입.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

연구

생물학

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

소 무릎 이식에서 연골 리모델링의 전 생체 외 조직 문화 모델

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

성인 얼룩말 피시를위한 생체 내 표면 심전도

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

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