Ringraziamo Anthony K. L. Leung del dipartimento di biochimica e biologia molecolare, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University per la sua tecnica aiutare con la progettazione del costrutto di miR-181-spugna. Ringraziamo anche Polina Sysa-Shah e Kathleen Gabrielson del dipartimento di molecolare e comparativa Pathobiology, Johns Hopkins Medical istituzioni per la loro assistenza tecnica per l'imaging in vivo della consegna miRNA-spugna.
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH, HL39752 (di Charles Steenbergen) e da una sovvenzione scienziato sviluppo l'American Heart Association 14SDG18890049 (a Samarjit Das). Il promotore di cardio-specifico del ratto è stato generosamente fornito da Jeffery D. Molkentin all'ospedale pediatrico di Cincinnati.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Johns Hopkins University.
1. spugna Design
<ol><li>
MicroRNA associazione 3' UTR Nota: A miRNA funzioni attraverso specifiche interazioni accoppiamento base con siti parzialmente complementari nella regione 3' non tradotta (UTR) del suo mRNA bersaglio (per una rassegna completa, vedere Bartel)15.<ol>
<li>Progettare gli inibitori dell'espressione dei miRNA come oligonucleotidi contenenti significative complementarità alla sequenza di miRNA. Sequestrare un miRNA a un oligonucleotide complesso mediante appaiamento vasto di bloccare la funzione di miRNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Progettazione di una spugna di miRNA
	<ol>
<li>Progettazione schierati tandemly sequenze miRNA parzialmente complementari per includere un rigonfiamento nella posizione normalmente spaccati di Argonaute 2. Il rigonfiamento è posizionato a nucleotidi 9-12 della sequenza miRNA maturo per prevenire qualsiasi RNA interferenza tipo fenditura e la degradazione della spugna.</li>
		<li>Se lo si desidera, è possibile progettare alla sequenza di destinazione esca da associare a tutti i membri della famiglia miR-181. Al momento di un esame e il confronto delle sequenze famiglia miRNA miR-181, trovare una sequenza comune sul lato 5' del rigonfiamento contenente 8 nucleotidi consecutivi, o trovare una sequenza comune a tutti i membri della famiglia miR-181 4 sul lato 3' del rigonfiamento di un ulteriore 8 nucleotidi consecutivi. Queste 2 sequenze rappresentano i siti di legame di metà sinistra e destra, rispettivamente. Nota: La sequenza di esca è una matrice di tandem delle sedi del legame di metà di destro e sinistro separati da un distanziatore GGA. Collegare insieme la sequenza 5'-fine e la sequenza di 3'-lato (descritto al punto 1.2.2) con un distanziatore GGA progettato per creare il rigonfiamento quando ricotto per un miRNA (come descritto al punto 1.2.1). Ripetere questo 1 sito di legame di miRNA 10 x nel costrutto finale miR-spugna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Altre considerazioni di spugna di miRNA Nota: Al fine di clonare la sequenza di spugna nel vettore di espressione destinatario, siti di riconoscimento nucleasi di restrizione devono essere inclusi a ciascuna estremità della sequenza. Un'analisi in silico digestione dovrebbe essere utilizzata per confermare la scissione non specifici della sequenza spugna dagli enzimi di restrizione selezionati e altri enzimi di restrizione utilizzati in applicazioni di clonazione a valle.<ol>
<li>Aggiungere un codone di arresto doppia (TAA TAA) all'estremità 5' del sintetico 3' UTR, tale che la sequenza di miR-181-spugna non è parte della sequenza codificante per una proteina fluorescente verde avanzata (EGFP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sintesi della spugna del DNA per la clonazione
	<ol>
<li>Utilizzare un sintetizzatore di DNA o impiegare una fonte disponibile in commercio per sintetizzare la sequenza di spugna finale miRNA con siti di riconoscimento di nucleasi di restrizione in luogo per la clonazione. La spugna viene spedita su un plasmide che può contenere indicatori selezionabili per un'amplificazione nei batteri. Ulteriormente, la spugna può essere amplificata da una reazione a catena della polimerasi (PCR) per la clonazione o semplicemente caduta fuori il vettore di donatore utilizzando i siti di restrizione descritti al punto 1.3 (vedere anche punto 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. clonazione il vettore destinatario per includere un promotore tessuto-specifici
Nota: Utilizzare il vettore pEGFP-C1 come il vettore destinatario per la cassetta di espressione della spugna miRNA. Il vettore pEGFP-C1 contiene una cornice di lettura per un EGFP guidato da un promotore del citomegalovirus (CMV). Il promotore di CMV è costitutivamente attivo in cellule di mammifero. Se un promotore tessuto-specifica è necessario, il promotore CMV può essere rimosso tramite digestione degli enzimi di AseI e NheI (Vedi punto 2.1). Il plasmide contiene un vasto polylinker (MCS), kanamicina (Kan) e marcatori di neomicina (G418) per una selezione in batteri e un'espressione stabile in cellule di mammifero, rispettivamente.
<ol><li>
Rimozione del promotore CMV da pEGFP-C1
	<ol>
<li>Fare 50 μL di reazione di digestione contenente tampone digest commercialmente disponibili suggerito dalla fabbricazione degli enzimi di restrizione usato 1x, 5 μg di plasmide DNA (in acqua) e 5 µ l di AseI e NheI enzimi. Aggiungere tutti i componenti di un tubo del microcentrifuge e mescolarle delicatamente da sfogliando. Girare il tubo per 10 s in una microcentrifuga per raccogliere la reazione nella parte inferiore. Incubare la reazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.</li>
		<li>Purificare il plasmide linearizzato digerito. Aggiungere 5 x il volume di reazione di buffer di colonna obbligatorio (un mix di proprietà del buffer associazione adatta per la fabbricazione delle colonne di purificazione di DNA utilizzate) e purificare la reazione con una colonna di purificazione del DNA come descritto dal produttore. Eluire con 25 μL di tampone di eluizione (acqua) aggiunto attentamente al centro della colonna.</li>
		<li>Gel di purificare il plasmide digerito su gel di agarosio 0,5% come segue: aggiungere 5 μL di tampone di caricamento (50% glicerolo-3 x caricamento tintura) per il plasmide eluito. Caricare l'intero esempio in 1 bene su gel di agarosio di 0,5%. Includere una corsia separata con 500 ng di vettore uncut. Eseguirlo per 30-40 minuti fino ad ottenere un'adeguata separazione dei plasmidi di taglio e non tagliati.</li>
		<li>Purificare il plasmide linearizzato come segue: visualizzare il DNA in gel di agarosio su una scatola di luce UV. Con una lama di rasoio pulita, attentamente accise alla fascia corrispondente al plasmide lineare. Nota: Il plasmide lineare dovrebbe eseguire inferiore il plasmide non tagliato e verrà visualizzato come una singola banda a circa 4,2 kb. Il promotore CMV asportato apparirà come una banda di luce a circa 500 nucleotidi (nt).</li>
		<li>Estrarre il DNA dal gel slice usando un kit disponibile in commercio ed eluire il DNA dalla colonna con 25 µ l di acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Clonazione di un promotore di cuore-specifico in pEGFP-C1 Nota: Il promotore di catene pesanti alfa-miosina (α-MHC) ha stato precedentemente caratterizzato e dimostrato per dirigere robusti livelli di espressione cardiaco-limitati come descritto nel seguente Molkentin, Jobe e Markham16. Le sezioni successive descrivono come amplificare il promotore del vettore per la clonazione.<ol>
<li>Clonare il promotore di α-MHC tra elementi + 420 a-2934 relativo al sito di inizio della trascrizione nel plasmide p4016 di prima progettazione degli iniettori PCR che fiancheggiano questa regione e quindi il plasmide come modello per la PCR. Amplificare la regione del promotore mediante PCR primer precedentemente descritti5. Forward e reverse primer PCR contengono sequenze di sovrapposizione fino agli estremi confini digeriti del pEGFP-C1 (punto 2.1) per consentire la clonazione diretto In Fusion. Consultare il manuale di In-fusione per un'esauriente spiegazione del disegno primer per clonazione In-Fusion. Sequenze dell'iniettore si trovano nella tabella 1.</li>
		<li>Preparare una reazione di PCR 50 μL, che contiene 1 μM di ogni primer e 10 ng di DNA campione. Aggiungere una quantità appropriata di enzima PCR e dNTP a seconda la fabbricazione dei reagenti PCR scelto. Eseguire PCR su un blocco di ciclismo del DNA standard. Eseguire un 3 min 98 ° C denaturazione passaggio, seguito da 35 cicli di denaturazione, ricottura ed estensione per 5, 30 e 120 s ciascuno, rispettivamente. Include un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.</li>
		<li>Ripulire l'estrazione PCR e gel. Al completamento del ciclo di PCR, aggiungere 5 x il volume di reazione di buffer di associazione di colonna per la reazione di PCR e purificarla con una colonna di purificazione di DNA, come descritto dal produttore. Eluire la miscela con 25 μL di tampone di eluizione (acqua) aggiunto attentamente al centro della colonna.<ol>
<li>Aggiungere 5 µ l di tampone di caricamento [50% glicerolo (3x) tintura di caricamento] a eluiti plasmide. Caricare l'intero esempio in 1 bene su gel di agarosio 1%. Eseguirlo per 30-40 min; visualizzare e asportare il prodotto PCR come descritto in precedenza (punto 2.1.5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legare il promotore di α-MHC con pEGFP-C1 come segue: aggiungere la reazione di legatura 10 μL contenente 1x buffer di legatura commercialmente disponibili, 2 μL di PCR purificato e 1 μL di vettore linearizzato. Eseguire la legatura a 50 ° C per 15 min e poi raffreddarlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Eseguire una trasformazione batterica come segue: transfect 50 μL di cellule competenti con 2,5 µ l di miscela di legatura In Fusion aggiungendo i componenti. Riposare la Eppendorf tube sul ghiaccio per 20 min, metterlo a bagnomaria a 42 ° C per 40 s e quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 2 min.<ol>
<li>A seguito della trasformazione, aggiungere 350 μL di media SOC e far crescere cellule a 37 ° C per 45 min. piastra 200 μL di soluzione di escrescenza su piastre LB con Kan eseguire una PCR per identificare cellule resistenti Kan che contengono la legatura del promotore di α-MHC della Colonia. Nota: Gli iniettori di Screening sono stati progettati per PCR attraverso la giunzione di legatura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Espandere i cloni positivi di PCR in brodo LB-Kan e in plasmidi purificati mediante protocolli di purificazione del plasmide standard mini-prep come descritto dal produttore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. clonazione la spugna
<ol><li>
Digerire il vettore destinatario
	<ol>
<li>Rendere il plasmide pEGFP-MHC-α lineare per la clonazione con EcoRI e KpnI e purificare il gel come descritto in precedenza (punto 2.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR amplificano e digerire la spugna del DNA
	<ol>
<li>Utilizzare la storyline di 284-nt-lungo miR-181-spugna e corrispondente vettori di spedizione come il modello per la PCR. Amplificare la regione di spugna utilizzando precedentemente descritti PCR primer5. Si noti che gli iniettori di PCR di forward e reverse contengono sequenze di enzima di restrizione per consentire legatura in α-MHC-pEGFP-C1. Eseguire PCR come descritto in precedenza (punto 2.2.2). Purificare i prodotti di PCR prima digestione descritti (punto 2.2.3) e li eluiti con acqua per la digestione. Per sequenze dell'iniettore, vedere nella tabella 1.
</li>
		<li>Digerire la spugna del DNA per la legatura. Una reazione di digestione 50 μL contiene 1x buffer di digest, la reazione di PCR gel-purificato dal punto 3.2.1 e 5 μL di enzimi EcoRI sia KpnI. Aggiungere tutti i componenti di un tubo del microcentrifuge e mescolarle delicatamente da sfogliando. Girare il tubo per 10 s in una microcentrifuga per raccogliere la reazione nella parte inferiore. Incubare la reazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.</li>
		<li>Purificare la spugna PCR digerita utilizzando una colonna di pulizia PCR come descritto in precedenza (punto 2.2.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Legare la miR-181-spugna in vettore α-MHC-pEGFP-C1
	<ol>
<li>Impostare una reazione di legatura μL 21 che contiene 1 x legatura buffer, 3 μL di digerito e purificato PCR miR-181-spugna, 1 μL di vettore linearizzato α-MHC-pEGFP-C1, tampone DNA 1x e 1 μL di DNA ligasi. Eseguire la legatura a temperatura ambiente per 5 min e poi metterlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Trasformare 50 μL di cellule competenti XL1-blu con 2 μL di miscela di legatura. Utilizzare la trasformazione e la placcatura protocolli come descritto in precedenza (punto 2.2.5). Eseguire una PCR per identificare batteri resistenti Kan che contengono la sequenza corretta di α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge della Colonia. Progettazione degli iniettori di PCR di screening attraverso la giunzione di legatura. Vedere la tabella 1 per sequenze dell'iniettore.</li>
		<li>Amplificare e il vettore di sequenza. Espandere i cloni positivi di PCR in brodo LB-Kan e in plasmidi purificati mediante protocolli di purificazione del plasmide standard mini-prep. Eseguire un sequenziamento del DNA per verificare il plasmide esprimente le sequenze di DNA desiderate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. generazione di cellule che esprimono miR-181-spugna di H9c2 stabile
<ol><li>
Crescita e il mantenimento delle cellule H9c2
	<ol>
<li>Cellule di cultura il H9c2 dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale di 10%. Sub-cultura le celle utilizzando protocolli standard e farle crescere a 37 ° C in 5% di anidride carbonica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfezione e selezione di α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge che esprimono le cellule H9c2
	<ol>
<li>Eseguire un elettroporazione delle cellule H9c2 per ottenere risultati ottimali. Transfect ratto mioblasti (H9c2) con una spugna di scramble (una sequenza di scramble 284-nt-lungo che sostituisce la miR-181-spugna-sequenza) o il costrutto α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge con un electroporator.<ol>
<li>Brevemente, transfect 4 x 10-5 cellule con 2 μg di DNA del plasmide (in 5 µ l di H2O) e 100 µ l di una soluzione compatibile con il dispositivo di elettroporazione. Utilizzare un programma di elettroporazione di DS-120 a transfect le cellule H9c2.</li>
			<li>Incubare le cellule transfettate in cuvetta per 10 min a temperatura ambiente. Aggiungere 500 µ l di DMEM direttamente la cuvetta. Trasferire delicatamente il contenuto di cuvetta totale in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selezionare per cellule positive GFP dopo post-trasfezione 48 h di FACs. Piastra solo le cellule GFP-espressi in una piastra a 6 pozzetti con un'aggiunta di neomicina (G418) (400ng/mL) per i media di crescita completa. Nota: Prima della selezione di G418, una curva di uccidere dovrebbe essere stabilita per determinare la quantità di neomicina richiesto per la selezione. Per le cellule H9c2, 400 ng/mL di G418 ha provocato un tasso di mortalità di circa l'80% del non-plasmide transfected le cellule H9c2 dopo 24 h ed è stato considerato come la concentrazione di lavoro desiderata di G418 per queste cellule. La linea cellulare era considerata stabile dopo la crescita è stata mantenuta in G418 per 16 giorni.</li>
		<li>Eseguire l'ordinamento di FACs delle cellule stabili G418 usando l'espressione della GFP come indicatore per una selezione positiva di spugna. Semi di 5-10 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da flusso di ordinamento. Espandere le cellule monoclonali dalla piastra a 96 pozzetti a 24 pozzetti sopra diversi passaggi. Uso congelatore scorte delle cellule dal passaggio 3 (P3) cellule come punto di partenza per successivi esperimenti.</li>
		<li>Eseguire tutti gli esperimenti basati su linee cellulari con cellule di basso-passaggio tra P5 e P10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sintesi e purificazione di spugna-nanoparticelle (miR-181-spugna nanoparticelle)
<ol><li>Preparate le nanoparticelle liposomiale sciogliendo amphiphile cationici (DOTAP) e co-lipidi, colesterolo e DSPE-PEG-OMe, in un rapporto di mM 5:5:0.1, rispettivamente, in una miscela di cloroformio e metanolo in un flaconcino di vetro.</li>
	<li>Rimuovere il solvente organico a 44-45 ° C, sotto vuoto mediante un evaporatore rotante, seguito da un delicato flusso di azoto privo di umidità. Tenere il restante film secchi del lipido sotto alto vuoto per 8 h.</li>
	<li>Preparare una miscela con l'aggiunta di glucosio 5% per il film lipidico Essicato sottovuoto. Lasciare durante la notte per consentire questa miscela idratare il film. Vortice del flacone per 2 a 3 min a temperatura ambiente per produrre vescicole multilamellari con un'agitazione occasionale in bagnomaria a 45 ° C.<ol>
<li>Sonicare le vescicole multilamellari per preparare le vescicole unilamellari piccole in un bagno di ghiaccio per 3-4 minuti fino a quando la chiarezza può essere osservato, a un 100% duty cycle e 25 W di potenza di uscita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mescolare una sequenza di scramble o una sequenza di miR-181-spugna clonati nel vettore pEGFP(α-MHC) e liposoma su una base di rapporto 1:3 carica per formare la nanovector4. Nota: Un complesso elettrostatico di nanoparticelle liposomiale caricati positivamente e negativamente DNA plasmidico è noto come un nanovector.</li>
</ol>6. consegna sistemica di spugna-nanoparticelle e convalida degli effetti In Vivo
<ol><li>
Somministrazione sistemica di spugna-nanoparticelle in ratti
	<ol>
<li>Utilizzare ratti Sprague-Dawley (deviazione standard). Iniettare per via endovenosa i ratti con il miR-181-spugna nanovector o scramble nanovector attraverso la vena caudale. Utilizzare ratti maschii di SD, che sono circa 200 g di peso corporeo.</li>
		<li>Eseguire l'iniezione della vena della coda utilizzando una dose di 4 mg di nanovector/kg di peso corporeo e ripetere l'operazione usando un regime di 6 iniezioni di vena di coda oltre 2 settimane. A seguito della pronuncia di nanovector ripetuti, consentire un periodo di 1 settimana (giorni 15-21) per l'espressione del vettore in vivo.</li>
		<li>Confermare l'ottimizzazione da imaging il segnale GFP, prima, durante e dopo la consegna di nanovector. Analizzare il segnale GFP di software di imaging tomografico, che genera dati semi-quantitativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Convalida di in vivo miR-181 inibizione da miR-181-spugna
	<ol>
<li>Eseguire macchia occidentale al fine di dimostrare l'espressione di miR-181-spugna funzionale nel tessuto del cuore. Nota: Per questo studio, espressione di mt-COX1 è stata esaminata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Conseguenze funzionali dell'espressione di miR-181-spugna in vivo nel cuore
	<ol>
<li>Eseguire un'ecocardiografia bidimensionale, M-mode e Doppler durante e dopo la consegna di nanovector per analizzare la funzione cardiaca ed i cambiamenti morfologici. Per una migliore scansione capacità nei cuori del roditore, utilizzare un sistema a ultrasuoni dotato di un trasduttore ad array lineare 15 MHz.</li>
		<li>L'anestesia può influenzare la contrattilità cardiaca; Pertanto, effettuare la consegna della nanovector miR-181-spugna o scramble nanovector agli animali che sono cosciente e senza qualsiasi reagente anestetico durante il processo di ecocardiografia. Si prega di consultare Das, et al. 4 per ulteriori chiarimenti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+detection+comes+of+age.">microRNA detection comes of age.</a> Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).</li><li>van Rooij, E., Olson, E. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+with+antisense+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides.</a> Methods. 44 (1), 55-60 (2008).</li><li>Stenvang, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+targets+for+antisense-based+therapeutics.">MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics+for+cardiovascular+disease:+opportunities+and+obstacles.">MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).</li><li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3 (1), 1 (2012).</li><li>Levin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+issues+in+the+pharmacokinetics+and+toxicology+of+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides.">A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).</li><li>Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+miR-214+modulates+Hedgehog+signaling+to+specify+muscle+cell+fate.">Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate.</a> Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inhibition+of+miRNA+maturation+with+morpholinos+reveals+a+role+for+miR-375+in+pancreatic+islet+development.">Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development.</a> PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).</li><li>Martello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+of+Nodal+signalling.">MicroRNA control of Nodal signalling.</a> Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).</li><li>Fabani, M. M., Gait, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+targeting+with+LNA/2'-O-methyl+oligonucleotide+mixmers,+peptide+nucleic+acids+(PNA),+and+PNA-peptide+conjugates.">miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates.</a> RNA. 14 (2), 336-346 (2008).</li><li>Fabani, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+miR-155+function+in+vivo+by+peptide+nucleic+acids.">Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).</li><li>Babar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+therapy+in+an+in+vivo+microRNA-155+(miR-155)-dependent+mouse+model+of+lymphoma.">Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).</li><li>Torres, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+requirements+and+cellular+targeting+of+microRNA-122+by+peptide+nucleic+acids+anti-miRs.">Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs.</a> Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).</li><li>Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+miR-143/145:+the+importance+of+cell-type+localization+of+miRNAs.">Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo descritta la progettazione e la sintesi di una miRNA-spugna e ha dimostrato come l'espressione tessuto-specifica della spugna è un potente strumento per inibire l'espressione famiglia tessuto-specifici miRNA.
Abbiamo dimostrato che una famiglia di miR-181 spugna di targeting può essere clonata in un plasmide di espressione con un promotore specifico. Il plasmide può essere confezionato in modo efficiente in una particella di nanovector per la consegna sia in vitro</em...

Negli ultimi due decenni, ci sono stati numerosi studi che hanno messo in evidenza il ruolo significativo dei miRNA nella malattia umana. Risultati da un grande corpo di letteratura dimostrano l'importanza innegabile dei miRNA nella fisiopatologia di malattie quali cancro1 e malattia cardiovascolare2,3,4,5. Ad esempio, miR-21 è aumentata in molti cancri, conseguente a un'aumentata proliferazione ciclo cellulare e6. Nelle infezioni di epatite C, miR-122 svolge un ruolo importante nella replicazione del virus7, ed è stato dimostrato che l'inibizione di miR-122 diminuisce il carico virale8. Nell'ipertrofia cardiaca, miR-212/132 è upregulated nel cuore ed è coinvolto nel fenotipo patologico9. L'evidente importanza del downregulation o inibizione funzionale di un miRNA sovraregolati suggerisce opportunità per sfruttare terapeuticamente la biologia di miRNA in quasi tutte le malattie.
I quattro membri della famiglia miR-181, miR-181 a/b/c/d, si trovano in tre luoghi genomic nel genoma umano. La regione intronic di un gene di host RNA non codificanti (MIR181A1-HG) codifica il cluster miR-181-a/b-1. La regione intronic del gene NR6A1 codifica il miR-181-a/b-2. Il cluster miR-181-c/d si trova in una trascrizione atipico sul cromosoma 19. Tutti i membri della famiglia di miR-181 condividono la stessa sequenza di "seme" e tutti i quattro membri della famiglia miR-181 potenzialmente possono regolare i medesimi obiettivi di mRNA.
Abbiamo3,4 e altri10 hanno sottolineato l'importanza di miR-181 membri della famiglia durante l'infarto di stadio finale. Abbiamo anche riconosciuto che un upregulation di miR - 181 quater si verifica in presenza di condizioni patologiche associate con un rischio aumentato di malattia cardiaca, quale il diabete di tipo II, obesità e invecchiamento3,4,5. È stato postulato che la sovraespressione di miR - 181c causa lo sforzo ossidativo che conduce a una disfunzione cardiaca4.
Parecchi gruppi hanno suggerito che esiste di miRNA in mitocondri11,12,13,14, ma siamo stati i primi a dimostrare che miR - 181 c è derivato dal genoma nucleare, elaborato, e successivamente spostato ai mitocondri in RISC3. Inoltre, abbiamo rilevato una bassa espressione di miR-181a e miR-181b nel compartimento mitocondriale del cuore5. D'importanza, abbiamo trovato che miR - 181c reprime l'espressione di mRNA di mt-COX1, dimostrando in tal modo che i miRNA partecipano alla regolazione del gene mitocondriale e alterano la funzione mitocondriale3,4.
Questo articolo discute la metodologia necessaria per progettare una miRNA-spugna per abbattere l'intera famiglia di miR-181 in cardiomiociti. Inoltre, abbiamo delineare un protocollo per l'applicazione in vivo della miR-181-spugna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-fusion</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Miniprep</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-181-sponge synthesis</td>
			<td>Introgen GeneArt</td>
			<td>custome made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI enzymes</td>
			<td>New Endland Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI enzymes</td>
			<td>New Endland Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11635379001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418, Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 sonifier</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EDP 100-214-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MTCO1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequoia C256 ultrasound system</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge

MicroRNA (miRNA) è piccolo non-codificanti RNA che inibisce l'espressione post-trascrizionale RNA messaggero (mRNA). Malattie umane, come cancro e malattie cardiovascolari, sono stati indicati per attivare il tessuto e/o espressione di miRNA cellula-specifico associato a progressione della malattia. L'inibizione dell'espressione dei miRNA offre il potenziale per un intervento terapeutico. Tuttavia, gli approcci tradizionali per inibire Mirna, impiegando oligonucleotidi ipotesi, influisce sulle funzioni di miRNA specifici al momento della consegna globale. Qui, presentiamo un protocollo per l'inibizione in vivo cardio-specifico della famiglia miR-181 in un modello del ratto. Un costrutto di miRNA-spugna è progettato per includere 10 sequenze di associazione anti-miR-181 ripetuta. Il promotore di cardio specifiche α-MHC è clonato nel backbone del pEGFP per guidare l'espressione di miR-181 cardio specifici miRNA-spugna. Per creare una cella stabile linea esprimendo il miR-181-spugna, dei mioblasti H9c2 cellule è trasfettata con il costrutto α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e filtrata per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACs) in cellule H9c2 positive GFP che sono coltivate con neomicina (G418). A seguito di una crescita stabile a neomicina, popolazioni di cellule monoclonali vengono stabilite mediante ulteriori FACs e clonazione di singola cellula. Cellule risultanti dei mioblasti H9c2-miR-181-spugna-GFP presentano una perdita di funzione dei membri della famiglia miR-181 come valutato attraverso l'aumentata espressione di proteine bersaglio miR-181 e confrontato alle cellule H9c2 esprimendo una spugna non funzionali di scramble. Inoltre, sviluppiamo un nanovector per la consegna sistematica del costrutto miR-181-spugna complessandosi liposomiale nanoparticelle caricato positivamente e negativamente miR-181-spugna plasmidi. In vivo imaging di GFP rivela che coda vena le iniezioni multiple di un nanovector su un periodo di tre settimane sono in grado di promuovere un'espressione significativa della miR-181-spugna in modo specifico per cardio. Cosa importante, una perdita di funzione di miR-181 è osservata nel tessuto del cuore ma non nel rene o del fegato. La spugna di miRNA è un potente metodo per inibire l'espressione di miRNA specifici del tessuto. L'espressione di miRNA-spugna di guida da un promotore tessuto-specifica fornisce specificità per l'inibizione di miRNA, che possa essere limitata a una mirata organo o tessuto. Inoltre, combinando tecnologie nanovector e miRNA-spugna consente un'erogazione efficace e tessuto-specifici miRNA inibizione in vivo.

In stabile pEGFP-miR-181-spugna-esprimendo H9c2 cellule transfected (dalla fase 4.2), l'espressione di miR-181 tutta la famiglia (miR-181a, miR-181b, miR - 181c e miR - 181d) è stata diminuita moderatamente relativo pEGFP-uova strapazzate-esprimendo le cellule H9c2. MiR-181-spugna serve come un inibitore competitivo dell'intera famiglia miR-181, così abbiamo anticipato che l'espressione del miR - 181c mitocondriale target gene, mt-COX1, aumenterebbe. Macchia occidentale dati suggeriscon...

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In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

In Vivo Nanovector consegna di una cuore specifici MicroRNA-spugna

Inibizione di tessuto-specifici microRNA è una tecnologia che è sottosviluppata nel campo dei microRNA. Qui, descriviamo un protocollo per inibire la famiglia di microRNA miR-181 in cellule dei mioblasti dal cuore. Nanovector tecnologia viene usata per fornire un microRNA spugna che dimostra significativa in vivo cardio-miR-181 famiglia inibizione specifica.

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

in-vivo-nanovector-delivery-of-a-heart-specific-microrna-sponge

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

7.3K Views.  University of Toronto. Inibizione di tessuto-specifici microRNA è una tecnologia che è sottosviluppata nel campo dei microRNA. Qui, descriviamo un protocollo per inibire la famiglia di microRNA miR-181 in cellule dei mioblasti dal cuore. Nanovector tecnologia viene usata per fornire un microRNA spugna che dimostra significativa in vivo cardio-miR-181 famiglia inibizione specifica.

Video: In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologia

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Un modello di cultura del tessuto Ex Vivo di Cartilage Rimodellamento in Esplants bovina del ginocchio

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

Elettrocarcardio in superficie in vivo per il pesce zebra adulto

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving immunization coverage worldwide. Here, a novel injectable, ultraviolet- curable and delayed burst release- enabling vaccine delivery platform called polybubbles is introduced. Cargo was injected into polyester-based polybubbles that were formed in 10% carboxymethycellulose -based aqueous solution. This paper includes protocols to maintain spherical shape of the polybubbles and optimize cargo placement and retention to maximize the amount of cargo within the polybubbles. To ensure safety, chlorinated solvent content within the polybubbles were analyzed using neutron activation analysis. Release studies were conducted with small molecules as cargo within the polybubble to confirm delayed burst release. To further show the potential for on-demand delivery of the cargo, gold nanorods were mixed within the polymer shell to enable near-infrared laser activation.

This article describes the protocols used to produce a novel vaccine delivery platform, &#34;polybubbles,&#34; to enable delayed burst release. Polyesters including poly(lactic-co-glycolic acid) and polycaprolactone were used to form the polybubbles and small molecules and antigen were used as cargo.

Produzione di una piattaforma di distribuzione di vaccini sensibile al vicino all'infrarosso e Core-Shell

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...