Nossa pesquisa se concentra no tratamento de metástases de câncer de mama usando terapêutica guiada por imagem em uma plataforma de nanopartículas de óxido de ferro. O objetivo é desenvolver terapias eficazes direcionadas especificamente aos tecidos metastáticos, que são as principais causas de morte relacionada ao câncer. Pode ser um desafio determinar se a terapêutica sistêmica atingiu o tecido desejado sem sacrificar animais.
Nossa nanopartícula pode ser visualizada usando as modalidades de ressonância magnética e imagem óptica, permitindo-nos monitorar a administração e o acúmulo de medicamentos em animais vivos. As terapias atuais para câncer de mama metastático não são específicas para metástases, têm eficácia variável e causam efeitos colaterais indesejáveis. Nossa plataforma de nanopartículas visa especificamente o nicho metastático e permite o monitoramento não invasivo de sua entrega sem evidências de efeitos adversos.
Anteriormente, usamos nossa plataforma de nanopartículas para direcionar um condutor de metástase, miR-10b, e fomos capazes de interromper a metástase e o crescimento de metástases. De olho na tradução clínica, estamos investigando a farmacodinâmica desta formulação para otimizar o regime de tratamento e maximizar a eficácia. Para começar, coloque o Matrigel congelado a 4 graus Celsius por 24 horas para permitir que o extrato da matriz se liquefaça.
Depois de determinar o número total de células necessárias para o estudo, tripsinize as células e lave com PBS. Centrifugue as células a 200 G durante 5 minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS resfriado para criar o estoque de células.
Agora, dilua o número total de células para 40 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro. Em seguida, adicione um volume igual do extrato de matriz resfriada para atingir uma concentração final de 1 vezes 10 elevado à potência de 6 células por 50 microlitros. Mantenha a mistura no gelo para evitar que o extrato solidifique antes da implantação.
Transfira o mouse anestesiado para um cone de nariz em uma almofada de aquecimento. Depois de confirmar o plano cirúrgico da anestesia, aplique pomada oftalmática para proteger os olhos do ressecamento da córnea. Em seguida, limpe a pele perto do local da injeção com um lenço umedecido com álcool e deixe secar por alguns segundos.
Induza na glândula mamária número quatro para minimizar a sobreposição de sinal entre o tumor primário e os locais comuns de metástase. Agora, pipete o estoque de células para cima e para baixo para ressuspender as células. Retire 50 microlitros da suspensão de células geladas em uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29.
Insira o bisel da agulha diretamente abaixo do mamilo da glândula mamária desejada, paralelamente ao corpo do camundongo, e injete as células em um ritmo constante e lento. Deixe a agulha na pele por pelo menos 5 segundos após completar a injeção para permitir que o Matrigel solidifique e evite vazamentos. Depois, mova o mouse para uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento para recuperação e supervisione até que esteja totalmente ambulatorial e possa manter a decúbito esternal.
Para monitorar o crescimento do tumor e o desenvolvimento de metástases, injete 150 miligramas por quilograma de peso corporal de luciferina intraperitonealmente no modelo de camundongo com câncer de mama metastático anestesiado. Retorne os camundongos à gaiola em uma almofada de aquecimento para permitir que eles despertem e metabolizem a luciferina. Em seguida, faça a imagem dos camundongos usando o scanner do sistema de imagem, começando aproximadamente 10 minutos após a injeção com luciferina.
Visualize até 5 camundongos juntos em decúbito dorsal, garantindo que todo o corpo esteja incluído nas marcações do guia do campo de visão e orientado o mais reto possível. Use fita adesiva transparente para prender os braços e visualizar melhor os gânglios linfáticos axilares. Agora, no software do sistema de imagem, defina a Exposição como Automática, Binning como Médio, FStop como 1, Excitação como Bloquear, Emissão como Aberto, FOV como D e Altura como 1,50 para imagens de bioluminescência.
Ao obter imagens do tumor primário, que normalmente produz um sinal forte devido à sua localização superficial, defina a exposição como automática. Se estiver monitorando metástases, cubra cuidadosamente o tumor primário com fita isolante preta e defina manualmente a exposição para 300 segundos para capturar quaisquer sinais fracos. Para começar, pese os camundongos com câncer de mama metastático, pois a dosagem do Nanodrug é baseada no peso corporal.
Prepare uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29 cheia de 10 miligramas de ferro Nanodrug por quilograma de peso corporal do camundongo. Em seguida, mergulhe a cauda do animal anestesiado em água morna a 30 a 35 graus Celsius por 30 segundos para dilatar as veias da cauda. Depois disso, limpe o excesso de água da cauda e limpe o local da injeção com um lenço umedecido com álcool 70%.
Agora, insira o chanfro da agulha na veia lateral da cauda aproximadamente na metade da cauda. Puxe o êmbolo ligeiramente para trás para confirmar a colocação com o flashback de sangue na agulha. Após a inserção bem-sucedida, injete o Nanodrug de forma constante a uma taxa lenta de aproximadamente 5 a 10 segundos para uma injeção de 40 microlitros.
Confirme a injeção bem-sucedida pela falta de acúmulo de solução sob a pele da cauda perto do local da injeção e pelo escurecimento da veia da solução de nanopartículas escuras. Mantenha a pressão sobre o local da injeção com gaze e remova a agulha. Mantenha a pressão por aproximadamente 30 segundos até que o sangramento pare.
Para coletar amostras de metástase, comece por imagens dos camundongos usando imagens de bioluminescência. Após a coleta das metástases, coloque os tecidos coletados em uma placa de Petri. No software do sistema de imagem, defina a Exposição como Automática, Binning como Médio, FStop como 1, Excitação como Bloquear, Emissão como Aberto, FOV como D e Altura como 1,50 para imagens de bioluminescência.
Para imagens de fluorescência, defina Exposição como Automático, Binning como Médio, FStop como 1, Excitação como 675, Emissão como 720, Nível da lâmpada como Alto, FOV como D, Altura como 1,50. Em seguida, imagine a carcaça do camundongo com BLI para determinar se há algum tecido cancerígeno remanescente que valha a pena coletar. Em seguida, enxágue os tecidos cancerígenos coletados em PBS.
Para coletar tecidos para microscopia ou reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa, incorpore-os em um composto de temperatura de corte ideal e armazene-os a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para processamento. Para coletar tecidos para espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado, tarar uma escala usando um tubo vazio de 1,7 mililitro. Coloque o tecido no tubo e registre seu peso.
Depois de congelar o tecido, armazene-o a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para o processamento. Criosecção: a temperatura ideal de corte incorporou amostras frescas congeladas em lâminas de microscopia com 10 micrômetros de espessura. Ajuste as temperaturas da câmara e do suporte de amostra entre 20 graus Celsius negativos e 15 graus Celsius negativos, dependendo do tipo de tecido.
Fixe as seções de tecido nas lâminas submergindo-as em solução de paraformaldeído a 4% por 15 minutos. Enxágue cuidadosamente as lâminas com PBS. Em seguida, monte as lamínulas nas lâminas usando um meio contendo DAPI para visualizar a arquitetura do tecido.
Use um microscópio de fluorescência para examinar as seções de tecido quanto à fluorescência Cy5.5, que indica a entrega de nanodrogas. Confirmar que o sinal de fluorescência não é ruído de fundo, comparando-o com uma amostra de controlo negativo de um animal não injectado. Os camundongos tratados com Nanodrug mostraram sinais bioluminescentes significativos em metástases pulmonares uma semana após a administração, confirmando a presença de metástases nos tecidos pulmonares.
A imagem de fluorescência confirmou o acúmulo de Cy5.5 do Nanodrug apenas nos tecidos pulmonares metastáticos de camundongos tratados.
