Este método pode ajudar a abordar questões-chave na neurobiologia, como polaridade do neurônio motor, orientação do axônio, tráfico de axônio e mecanismos neurodegenerativos. A principal vantagem desta técnica é obter uma cultura de neurônio motor altamente enriquecida enquanto tomamos para expressar nossa proteína de knockdown por afeto minucioso. Para iniciar este procedimento, coloque um embrião em um prato de mídia de dissecção codificada com silício.
Sob o microscópio, segure o embrião com o abdômen contra o silício com fórceps. Com o segundo par de fórceps, insira uma das pontas no canal central da medula espinhal rostrad. Em seguida, feche os fórceps para rasgar ligeiramente o tecido dorsal.
Repita esta operação para o lado connell até que toda a medula espinhal seja aberta. Em seguida, posicione o embrião de modo que a medula espinhal aberta seja contra o silício. Posteriormente, despreze a parte rostrad da medula espinhal do corpo.
Belisque a parte rostrad da medula espinhal, e puxe o embrião pela cabeça para extrair a medula espinhal. Retire cuidadosamente quaisquer meninges e DRGs restantes ainda ligados à medula espinhal. Achate a medula espinhal no silício e usando um bisturi, remova a metade dorsal da cordel cortando ao longo do meio de cada lado.
Corte a parte do meio em dez pedaços, e transfira-as para um novo tubo. Para preparar a suspensão das células das medulas espinhais, colete as peças da medula espinhal na parte inferior do tubo. Substitua o HBSS por um mililitro de Ham F-10 médio e adicione dez microliters de trippsina.
Incubar o tubo por dez minutos a 37 graus Celsius. Para parar a digestão enzimática, transfira os fragmentos para um novo tubo de 15 mililitros, contendo 800 microliters de meio L-15 completo, 100 microliters de 4%BSA e 100 microliters de DNAs e titulação, duas vezes. Deixe os fragmentos se contentarem por dois minutos antes de coletar o supernatante em um tubo fresco de 15 mililitros.
Adicione suavemente dois mililitros de 4%BSA na parte inferior do tubo supernante. Centro fundir-o em 470 x gravidade por 5 minutos. Após 5 minutos, remova o supernasce e suspenda a paleta celular com 2 mililitros de meio L-15 completo.
Para enriquecimento de motoneuron, divida a suspensão celular em dois tubos de 15 mililitros. Em seguida, adicione dois mililitros de meio L-15 PH a cada tubo. Se começar com seis embriões, use o equivalente a três embriões por tubo, e três mililitros de médio.
Adicione lentamente 2 mililitros de solução de gradiência de densidade, ao fundo de cada tubo para obter uma interface afiada. Em seguida, centro fundi-lo em 830 x gravidade por 15 minutos em temperatura ambiente. Após esta etapa, as pequenas células devem estar na parte inferior do tubo, enquanto as grandes células - como o motoneuron - devem estar na solução de gradiente de densidade/interface média.
Asperae 1 a 2 mililitros das células na interface e transferi-los para um tubo fresco de 15 mililitros. Ajuste o volume para dez mililitros com meio L-15 PH. Posteriormente, adicione dois mililitros da almofada 4%BSA ao fundo dos dois tubos.
E o centro fusível a 470 x gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente. Após 5 minutos, remova o supernasce e suspenda a paleta e 3 mililitros de meio L-15 completo. Repita a centrífuga a 470 x gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, remova o supernatante e suspenda novamente a paleta celular e dois mililitros de meio de cultura completa. Para cultivar neurônios motores, dilui-os para 5.000-10.000 células em 500 microliters de cultura média por poço em uma placa de 24 poços. Em seguida, remova a solução de laminás com a ponta de tubulação P-1.000.
Transfira imediatamente os neurônios motores diluídos em meio de cultura. às placas de codificação para evitar a secagem. Para preparar o DNA, suspenda 1 micrograma de DNA em 50 microliters do meio de cultura neuronal.
E vórtice por 5 segundos. Para preparar o tubo B, suspenda 1,5 microliters de contas em 50 microliters de meio de cultura neuronal. Adicione 50 microliters de solução de contas a 50 microliters de solução de DNA e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.
Durante esta incubação, retire 100 microliters de meio cultural do poço que será transfeinado. Posteriormente, transfira 100 microliters da mistura de contas de DNA para cada poço. E incubar a placa de 24 poços, 20-30 minutos na placa magnética a 37 graus Celsius.
Mostrado aqui, é a morfologia do neurônio modem revelada pela posição de cadeia pesada de neurofilamento não fosfoilado endógeno após quatro dias de cultura. Nestas imagens, mostram a morfologia do neurônio modem após quatro dias in vitro e transfeccionado para o gene trans EGFP por magnetofecção no segundo dia. Os neurônios do lema foram contra-manchados com o marcador SMI-32 ou o marcador pan-neuro TUJ-1 e as setas indicam a soma dos neurônios.
Estas são suas imagens confocais de neurônios motores magneto fected, expressando construções egfp nefh mutantes ou mutantes e manchadas para seu marcador autofágico LC-3B. Setas mostram os agregados mutantes de proteína EGFP NEFH que também são positivos LC-3B Após este procedimento, montoholda curcha pode ser analisada por microscopia de vídeo para visualizar o tráfico de axônio e adicionar alguma orientação. Após seu desenvolvimento inicial para abordar questões fundamentais na biologia neural, essa técnica também se mostra uma poderosa ferramenta para explorar mecanismos fisiopológicos que implicam o espectro de distúrbios motoneuron, como doença da síndrome do choque tóxico, esclerose lateral trófica samuel ou atrofia muscular espinhal.
