Usando nosso protocolo, podemos visualizar e avaliar quantitativamente a dinâmica de sinalização de endossomos e mitocôndrias dentro de axônios de neurônios motores e sensoriais de camundongos anesthetizados vivos. Este método que pode ser usado para entender a fisiologia basal dos axônios in vivo e revelar importante mecanismo patho-mechanism que conduz a neurodegeneração periférica no modelo de doença do camundongo. Nossa técnica pode ser usada para avaliar o efeito de tratamentos potenciais, como agentes farmacológicos e terapias genéticas no transporte axonal em neurônios motores e sensoriais vivos.
Esta técnica pode ser usada para imagem simultânea de diferentes organelas em um axônio periférico específico e retransmitir o estudo de modelos de doenças motoras, bem como o envelhecimento. Inicie as preparações puxando uma micropipette de vidro de grau para injeções intramusculares ideais em músculos menores. Para a cirurgia, fixe uma cortina cirúrgica estéril em um tapete de calor a 37 graus Celsius e posicione e concentre o microscópio operacional.
Em seguida, desempacote todas as ferramentas cirúrgicas e instrumentos necessários, conforme descrito no manuscrito. Quando as preparações forem feitas, transfira o rato anestesiado para o porta-voz localizado em uma área separada do espaço cirúrgico e certifique-se de que os reflexos de retirada da córnea e do pedal estejam ausentes antes de raspar a pele da área cirúrgica. Em seguida, remova a pele raspada do mouse usando o lado pegajoso da fita cirúrgica.
Em seguida, coloque o mouse em balanças de pesagem para registrar o peso pré-cirúrgico. Em seguida, use um cotonete para aplicar lubrificante ocular e transfira o mouse e o porta-voz para a área cirúrgica. Para injetar o músculo tibialis anterior, ou TA, coloque o rato nas costas e estique o membro traseiro a 10 graus da linha média.
Quando o membro traseiro estiver na posição correta, coloque uma fita cirúrgica no pé. Esterilize a área raspada utilizando um etanol de 70% ou solução equivalente. Desenhe o fragmento atóxico de trabalho da solução de tétano, neurotoxina ou HcT em uma micropipette de vidro puxada.
Em seguida, faça uma pequena incisão sobre o músculo de interesse na área que corresponde às regiões motoras e de placas. Então. furar a fáscia externa no músculo para injetar o HcT. Deixe a micropipette em posição por cinco a 10 segundos antes de se retirar lentamente.
Poste a injeção, feche as incisões com um a dois pontos. Em seguida, transfira o mouse para uma gaiola de recuperação isolada em observação por 30 minutos. Prepare-se para expor o nervo ciático organizando as ferramentas cirúrgicas e instrumentos ao redor da área cirúrgica.
Crie uma cunha cortando o parafilme em um retângulo estreito de largura de um centímetro com uma ponta angular para ajudar no processo de imagem. Uma vez que os preparativos sejam feitos, transfira o mouse para o porta-voz na área cirúrgica e use fita cirúrgica para fixar a cabeça ao porta-voz. Estenda e proteja o membro traseiro direcionado a 45 graus da linha média com fita cirúrgica.
Se os reflexos de retirada de córneas e pedal estiverem ausentes, corte a pele sobreocioso do nervo ciático usando uma tesoura. Em seguida, remova o músculo bíceps femoral e musculatura ou tecido conjuntivo sem danificar o nervo ciático e os vasos sanguíneos. Quando o nervo ciático intacto estiver suficientemente exposto, aplique soro fisiológico pré-aquecido na área ao redor do nervo ciático para evitar a proficação.
Em seguida, use fórceps curvos para interromper o tecido conjuntivo profundo e coloque a cunha pré-preparada sob o nervo. Coloque a lã de algodão encharcada de soro na área exposta antes de mover o rato em cima do tapete de calor para a câmara de indução cheia de isoflurano e oxigênio. Para a imagem, coloque um vidro de cobertura de 22 por 64 milímetros no estágio de microscópio personalizado e fixe a posição do vidro de cobertura com uma fita.
Depois de aplicar óleo de imersão ao objetivo, conecte o estágio do microscópio ao microscópio invertido e levante lentamente o objetivo imerso em óleo de entrar em contato com o vidro de cobertura. Quando a configuração estiver pronta, fixe o bocal anestésico no estágio do microscópio usando fita. Em seguida, remova a lã de algodão do nervo ciático e transfira o rato da câmara de indução para o bocal com o nervo exposto voltado para o vidro da tampa.
Fixar a cabeça do mouse no bocal e, mantendo o nível mais baixo e adequado de anestesia, levante suavemente o rato pela cauda para adicionar soro fisiológico estéril ao deslizamento da tampa perto do nervo ciático exposto. Com a ajuda dos oculares, localize o nervo ciático para determinar o ponto focal ideal e selecione uma área de interesse contendo organelas axonais motile. Em seguida, mude para o software do computador clicando no botão Aquisição e selecionando uma área de interesse.
Use o zoom digital para obter uma ampliação 80 vezes e gire a área selecionada para visualizar os axônios horizontalmente Clique na caixa Regiões e selecione uma região retangular de interesse. No Modo de Aquisição, defina o tamanho do quadro para um mínimo de 1024 por 1024 pixels e inicie a aquisição de lapso de tempo de 100 a 1.000 quadros. Capture um mínimo de 10 cargas motile dos três axônios por mouse.
No estudo, a rotulagem in vivo motor axon-specifc foi alcançada utilizando camundongos transgênicos. A proteína de floresnce verde aprimorada, ou expressão eGFP, em axônios motores colinérgicos foi observada a partir de um ChAT vivo, anestesiado. mouse eGFP.
Com o método alternativo, expressão tdTomato em um nervo recém-extirpado de um ChAT. O rato tdTomato foi atingido sem processamento adicional de tecidos. Além disso, os axônios foram identificados por rastreadores ou marcadores injetáveis, como HcT ou adenovírus codificando eGFP em músculos esqueléticos.
A análise representativa demonstra uma série de imagens de lapso de tempo representando o transporte axonal in vivo de endossóis de sinalização em neurônios motores vivos de um HB9. Mouse GFP. O GFP tinha um padrão mais granular no HB9.
Axônios GFP. A criação de Mito. Ratos CFP com ChAT.
os camundongos tdTomato permitiram a visualização de mitocôndrias nos axônios motores. Além disso, o Nó de Ranvier também poderia ser identificado. A injeção de HCT nos músculos do Mito.
Os camundongos CFP permitiram visualização simultânea de endosários de sinalização e mitocôndrias dentro dos mesmos axônios in vivo. Organelas em movimento anterograde e retrógradamente, bem como organelas paradas, foram observadas. A redução da anestesia durante o processo de imagem é vantajosa porque pode limitar o impacto de grandes artefatos respiratórios e, assim, simplificar o rastreamento e a análise do transporte axonal.
Os nervos ciáticos podem ser instrutivos para a análise de RNA e proteína para correlacionar a dinâmica organela com componentes-chave do maquinário de transporte axonal, como proteínas motoras e adaptadores específicos de carga.
