Agradecemos Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama seus conselhos sobre as experiências de elAbSca, Charles Yokoyama para edição do manuscrito, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino para sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por fundos de pesquisa de RIKEN T.H. e Grants-in-Aid para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão para T.H. (áreas inovadoras "Neurocircuitos mesoscópica"; 22115004) e S.S. (25890023).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de segurança do RIKEN genética recombinante experimento e RIKEN Wako Animal experimentos Comité e executados de acordo com as orientações institucionais das instalações da RIKEN cérebro ciência animais Instituto.
1. preparação de câmaras de imagem
<ol><li>
Câmara de imagem19
	<ol>
<li>Folhas de borracha de silicone, prepare uma câmara com uma espessura de aproximadamente 5 mm e piso chapas de várias espessuras. Além disso, prepare caixas de Petri com e sem um fundo de vidro (figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Espaçador de fatia
	<ol>
<li>Prepare os espaçadores para manter as amostras, usando folhas de borracha de silicone com uma espessura de 0.5 mm (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tracer injeção
Nota: Fazer injeções no pons (2.1) ou no colículo superior (2.2). Injeção para os neurônios de projeção sub cerebral do rótulo de pons em uma região de cérebro grande, incluindo as áreas visuais e motoras, enquanto a injeção para os neurônios de projeção sub cerebral de rótulos colículo superior na área de visual. Para controle de experimentos, injetar soro, em vez de subunidade de toxina da cólera fluorescente-etiquetadas B. Para a manutenção da condição estéril use equipamento esterilizado e luvas de plástico limpadas com álcool etílico.
<ol><li>
Fazer injecções na ponte de ratos adultos.
	<ol>
<li>Desenhar 1 µ l de subunidade de toxina da cólera fluorescente-etiquetadas B (25 µ g / µ l de PBS) uma seringa Hamilton G 26.</li>
		<li>Coloque uma bomba injetora na seringa.</li>
		<li>Coloque a seringa e a bomba no suporte de um manipulador colocado num instrumento estereotáxica. Incline o manipulador 12° posteriormente de eixo vertical.</li>
		<li>Anestesiar um rato adulto masculino ou feminino (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9) através da injeção de sódio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg de peso corporal) ou através da administração de isoflurano (2-3%). Espere até que o rato faz sem resposta quando a cauda é comprimida com fórceps, indicando que o mouse é totalmente anestesiado.</li>
		<li>Coloque o mouse sobre o instrumento estereotáxica.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o cabelo usando uma lâmina de barbear para prevenir a infecção e cortar 10mm do couro cabeludo, para que o bregma e o lambda são visíveis. Administre 0,1 mL de lidocaína a 1% usando uma pipeta. Defina o ângulo da cabeça, ajustando a posição vertical do bocal do instrumento estereotáxica para que o bregma e o lambda têm o mesmo nível de z.</li>
		<li>Ajuste a posição do manipulator deslizando-o no instrumento estereotáxica para que a ponta da seringa é perto o bregma e gravar a posição do manipulator. Retire a seringa movendo o suporte da ferramenta sobre o manipulador.</li>
		<li>Mover o manipulador 5,4 mm posterior e 0,4 mm lateralmente. Avança a seringa para que a ponta está perto de ponto de entrada no crânio. Retire a seringa e marcar o ponto de entrada.</li>
		<li>Posição do marcado, faça um furo com um diâmetro de aproximadamente 1 mm.</li>
		<li>Inserir a ponta da seringa no orifício para que a profundidade de ponta é 6,9 mm mais do que a que medida no bregma.</li>
		<li>Injete 1 µ l dos marcadores usando a bomba em 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Retire a seringa do cérebro.</li>
		<li>Se necessário, cubra o cérebro exposto com pequenos fragmentos de pinça hemostática microfibrilar e adesivo instantâneo.</li>
		<li>Lave o cérebro exposto utilizando soro fisiológico entregado com uma pipeta para prevenir a infecção e suturar o couro cabeludo.</li>
		<li>Remova o mouse do instrumento estereotáxica. Permitir que o mouse para recuperar da anestesia em uma incubadora a 30 ˚ c, normalmente por 1h. Não deixe o mouse sem vigilância até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Retorne o mouse para a companhia de outros animais depois que ele se recuperou totalmente.</li>
		<li>Manter o mouse por 3 a 7 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer injeções para o colículo superior de ratos adultos.
	<ol>
<li>Prepare uma pipeta de vidro com um diâmetro de ponta de 30 – 50 µm.</li>
		<li>Conectar-se a pipeta de vidro para uma seringa Hamilton através de um tubo de plástico (Figura 2A).</li>
		<li>Encha a pipeta de vidro, tubo de plástico e Hamilton seringa com o líquido de parafina.</li>
		<li>Coloque uma bomba injetora na seringa.</li>
		<li>Coloque a pipeta de vidro sobre o manipulador e incline o manipulador 60° posteriormente de eixo vertical (Figura 2B).</li>
		<li>Execute 2.1.4–2.1.9. A posição do manipulator é 1,4 mm posterior, lateral de 0,5 mm para o lambda.</li>
		<li>Coloque uma película de parafina de plástico pequena no crânio e, em seguida, coloque aproximadamente 1 µ l da solução de rastreamento nele. Rapidamente avançar a pipeta de vidro e encha-o com pelo menos 0,5 µ l da solução de rastreamento.</li>
		<li>Introduza a pipeta de vidro para que a profundidade da ponta é de 3,0 mm da superfície do cérebro.</li>
		<li>Injete 0,5 µ l dos marcadores usando a bomba em 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Retire a pipeta de vidro do cérebro.</li>
		<li>Execute 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fixação e remoção
<ol><li>Injectar intraperitonealmente pentobarbital de sódio (60 mg/kg de peso corporal) por um mouse (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9, com ou sem a injeção do traçador conforme descrito na etapa 2. Espere até que o rato faz sem resposta quando a cauda é comprimida com fórceps, indicando que o mouse é totalmente anestesiado.</li>
	<li>Eutanásia o mouse humanamente pelo perfusing o rato transcardially20 com soro fisiológico a 0,9%.</li>
	<li>Corrigir o rato20 por perfusing paraformaldeído 4% (PFA) em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,5).</li>
	<li>
Corte o couro cabeludo usando um par de tesouras para expor o crânio como descrito20.
	<ol>
<li>Corte a linha média do crânio exposta usando um par de tesouras. Remova o crânio usando fórceps.</li>
		<li>Se marcar a posição do bregma e o lambda é necessário, primeiro remova um hemisfério do crânio. Inserir agulhas de tungstênio fina do cérebro nas posições do bregma e o lambda no crânio que permaneçam no cérebro e, em seguida, remover o restante do crânio. Nota: O cérebro pode ser armazenado em PBS em 4 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para executar a mancha do anticorpo de neurônios inibitórios, corte as amostras de cérebro em fatias.
	<ol>
<li>Coloque a amostra do cérebro em um vibratome.</li>
		<li>Corte as fatias até 500 µm de espessura em PBS na temperatura ambiente e vá para a etapa 5 (AbScale método).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se a mancha do anticorpo é desnecessário, aparar a amostra do cérebro para bloqueia (até 3 mm de espessura) usando uma lâmina de barbear (Figura 3) e avance para o passo 4 (o método de SeeDB). Nota: O cérebro pode ser armazenado em PBS a 4 ° C após cortar ou aparar. O método SeeDB é preferível ao anticorpo coloração não é necessário, porque ele requer menos tempo do que o método de elAbSca.</li>
</ol>4. limpar sem anticorpo que mancha (o método de SeeDB)
<ol><li>Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 80% (p/v) de frutose e incube-lo por 12 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) de frutose e incube-lo por 12 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 80,2% (w/w) frutose e incube-lo por 24 h com agitação suave na temperatura de quarto. Nota: Manipular a amostra cuidadosamente para manter deformações tão pequena quanto possível. Não Incube as amostras mais tempo do que o indicado, como amostras podem rapidamente se tornar opacas.</li>
	<li>Incorpore a amostra em uma câmara de imagem preenchida com solução de frutose a 80,2% (figura 1B). Se necessário, corrigi a amostra, colocando pequenos pedaços de adesivo de borracha ao redor. Se a câmara for muito profunda, coloquei uma placa de piso na câmara antes de colocar as amostras.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri com uma tampa de vidro sobre a câmara de imagem e colocar água no prato e imagem utilizando microscopia confocal ou dois fotões com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância. Comprimentos de onda de excitação e filtros de emissão são descritos na tabela 1. Se necessário, utilize um palco motorizado.</li>
</ol>5. compensação com anticorpo que mancha (o AbScale método)
<ol><li>Prepare reagentes, conforme descrito na tabela 2.</li>
	<li>Transfira as fatias com uma espátula para um tubo de plástico de 5 mL contendo 4 mL de solução de Sca/eS0 e incube-os por 12 h com agitação suave a 37 ° C (Figura 4B).</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eA2 e incubar as fatias para 36 h com agitação suave a 37 ° C.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eB4 e incubar as fatias para 24 h com agitação suave a 37 ° C.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eA2 e incubar as fatias para 12 h com agitação suave a 37 ° C.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de PBS e incubar as fatias para 6 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Retire cuidadosamente as fatias para um tubo plástico de 2 mL, usando uma espátula.</li>
	<li>Incube com anticorpos primários (tabela 3) em 1 mL de solução de AbScale para 48-72 h a 37 ° C (Figura 4), com agitação suave.</li>
	<li>Retire cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de 5 mL com uma espátula.</li>
	<li>Incube em 4 mL de solução de AbScale para 2 h à temperatura ambiente com agitação suave em 2 vezes.</li>
	<li>Retire cuidadosamente as fatias para um tubo plástico de 2 mL, usando uma espátula.</li>
	<li>Incube com fluorescente etiquetado anticorpos secundários (Tabela de materiais, 1: 100) em 1 mL de solução de AbScale por 48 h a 37 ° C, com agitação suave.</li>
	<li>Retire as fatias com uma espátula para um tubo de plástico de 5 mL contendo 4 mL da solução AbScale cuidadosamente e incubar as fatias para 6 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicione 4 mL da solução e AbScale incubar as fatias por 2 h 2 vezes com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de 4% PFA e incubar as fatias para 1 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de PBS e incubar as fatias para 1 h com agitação suave na temperatura de quarto.</li>
	<li>Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL da solução de Sca/eS4 e incubar as fatias para 12 h com agitação suave a 37 ° C.</li>
	<li>Coloque o espaçador sobre uma lâmina de vidro e coloque as fatias no espaçador e mergulhe as fatias com solução Sca/eS4. Sele o espaçador com um tampa de vidro (Figura 1).</li>
	<li>Ponha água no vidro de tampa e imagem utilizando microscopia confocal ou dois fotões com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância. Se necessário, utilize um palco motorizado. Nota: Verifique se as partes profundas da amostra são etiquetadas similarmente às partes superficiais para confirmar a ausência de um significativo viés de rotulagem. Nota: A penetração dos anticorpos testados é descrita na tabela 3.</li>
</ol>6. determinação de posição de célula
<ol><li>Para cada posição em imagens digitalizadas, calcule os valores de correlação usando um filtro de imagem tridimensional14 (Figura 5A-5D).</li>
	<li>Determine as posições dos picos do valor de correlação (Figura 5).</li>
	<li>Investiga imagens em torno dos picos para localizar as células (Figura 5E).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos os procedimentos para obter imagens tridimensionais em grande escala da organização de tipo específico de célula a tipos de grandes células na camada neocortical do rato 5. Em comparação com a coloração da fatia convencional, o método é mais útil na determinação da organização tridimensional do neocórtex. O método permite a aquisição de imagens do mais amplo e as mais profundas regiões do cérebro em comparação com o típico na vivo microscopia 2-fóton ou microscopia confocal...

O neocórtex dos mamíferos é composto por um grande número de tipos de células, cada uma com os padrões de expressão de genes específicos, propriedades bioquímicas e eletrofisiológicas, conexões sinápticas, e na vivo funções1,2 ,3,4,5,6,7. Se estes tipos de células são organizados em estruturas repetidas tem sido pouco claras. Colunas corticais, incluindo colunas de orientação visual e somatossensorial barris, repetiram-se estruturas, mas sua organização celular permanece incerto8,9. Estas estão presentes nas áreas corticais específicas e não são um sistema de todo o cérebro.
Na camada neocortical 5, a grande maioria dos neurônios é classificada em quatro tipos principais. Um tipo importante de neurônios excitatórios, neurônios de projeção sub cerebral, projeta axônios para alvos subcorticais, incluindo o pons, medula espinhal e colículo superior e, portanto, representa a principal saída cortical via10. Neurônios de projeção cortical, um outro tipo importante de neurônios excitatórios, inervam o córtex10. Os neurônios inibitórios também contém duas classes principais: células parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando11.
Análises recentes indicam que os tipos de quatro célula são organizados em estruturas repetidas12,13,14. Tanto os neurônios de projeção cerebral secundário a12,13,14 e de neurônios de projeção cortical14 organizam em célula-tipo específico microcolumns com um diâmetro de 1 – 2 células. Células Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando alinham especificamente com microcolumns de neurônios de projeção sub cerebral, mas não com microcolumns de neurônios de projeção cortical14. Microcolumns se alinhar periodicamente para formar um hexagonal lattice de matriz14 e estão presentes em múltiplas áreas corticais incluindo áreas visuais, somatossensorial e motor em cérebro de rato,12,14 e na língua áreas do cérebro humano13. Neurônios no microcolumn individual apresentam atividade sincronizada e ter respostas sensoriais semelhantes14. Estas observações indicam que tipos de células da camada 5 organizam em uma estrutura de treliça de microcolumn que representa a primeira organização de todo o cérebro conhecida de repetir módulos funcionais.
Microcolumns ter um raio de aproximadamente 10 µm e têm uma periodicidade espacial de aproximadamente 40 µm. Além disso, a orientação do microcolumns é paralela às suas dendrites apicais e alterações dependendo de sua posição no córtex14. Portanto, o sistema microcolumn é difícil de analisar usando fatias corticais convencionais com uma espessura típica de algumas dezenas de micrômetros. Além disso, a análise de periodicidade requer dados tridimensionais de uma vasta gama de áreas do cérebro e, portanto, a área de imagem típica de microscopia confocal ou na vivo imagem 2-fóton é muito estreita.
Recentemente, técnicas têm sido desenvolvidas para limpar tecidos grossos15,16. Aqui descrevemos a aplicação desses métodos para obter imagens tridimensionais, em grande escala os tipos de células principais na camada neocortical do rato 5 que compõem o sistema de microcolumn. Neurônios de projeção subcerebral são rotulados pela rotulagem retrógrada ou a expressão da proteína fluorescente verde reforçada em Crym-egfp ratos transgénicos12e projeção cortical neurônios são rotulados por ambos o retrógrado rotulagem ou pela expressão tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos17. Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando células são rotuladas por imuno-histoquímica. O método de (anticorpo escala S) AbScale18 é usado para o anticorpo que mancha experimentos, enquanto o método de SeeDB (ver profunda do cérebro)19 é usado para outras experiências. Esses métodos de superassem as dificuldades acima referidas dos métodos convencionais de imagem e revelam a organização celular exata da camada 514.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons injection</td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior colliculus injection</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical silk</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Liquid, light</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Inter medical</td><td>&amp;Phi;0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastic tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastic tube</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastic tube</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Tokyo chemical industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Cyclodextrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

O neocórtex dos mamíferos é composto de muitos tipos de neurônios excitatórios e inibitórios, cada um com propriedades específicas eletrofisiológicas e bioquímicas, conexões sinápticas, e na vivo de funções, mas sua basic funcional e anatômica organização de celular para escala de rede é mal compreendida. Aqui nós descrevemos um método para a imagem tridimensional de neurônios fluorescente-etiquetadas em grandes áreas do cérebro para a investigação da organização celular cortical. Tipos específicos de neurônios são rotulados por injeção de traçadores neuronais retrógrados fluorescentes ou expressão de proteínas fluorescentes em ratos transgénicos. Amostras de cérebro de bloco, por exemplo, um hemisfério, são preparadas após a fixação, transparentes com tecido métodos de compensação e submetidas a fluorescente immunolabeling os tipos de células específicas. Grandes áreas são verificadas usando microscópios confocal ou dois fotões equipados com grandes objectivos de distância de trabalho e estágios motorizados. Esse método pode resolver a organização periódica dos módulos funcionais específicas do tipo microcolumn célula no neocórtex do mouse. O procedimento pode ser útil para o estudo da arquitetura celular tridimensional nas áreas diversas do cérebro e outros tecidos complexos.

Nós rotulados de neurônios de projeção cortical pela expressão de tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos transgénicos e visualizado neurônios de projeção sub cerebral através da injeção do traçador retrógrado CTB488 em ponte. O hemisfério esquerdo do cérebro foi submetido ao método SeeDB e digitalizados usando um microscópio de dois fotões equipado com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância (25 X, N.A. 1.1, distância de trabalho 2 mm) e...

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K visualizações.  RIKEN Brain Science Institute. Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Neurociência

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biologia

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Micro-CT cerebral neonatal de camundongo e processamento de imagens

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Autor em destaque: Imagens de alta resolução de cérebros de recém-nascidos de camundongos - um protocolo de micro-CT com agente de contraste de solução de Lugol

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Micro-TC e Análise Morfométrica de Cérebros Neonatais de Camundongos

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...