Name: large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
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Ringraziamo Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama per i loro consigli sugli esperimenti elAbSca, Charles Yokoyama per l'editing del manoscritto, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca da RIKEN T.H. e localizzativi per ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone di T.H. (aree Innovative "Mesoscopiche neurocircuiti"; 22115004) e S.S. (25890023).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di esperimenti di RIKEN Wako animale e RIKEN genetico ricombinante esperimento Safety Committee ed eseguite secondo le linee guida istituzionali dell'animale il RIKEN Brain Science: Servizi Istituto.
1. preparazione di Imaging Chambers
<ol><li>
Imaging camera19
	<ol>
<li>Utilizzando lastre di gomma siliconica, preparare una camera con uno spessore di circa 5 mm e piano lamiere di vari spessori. Inoltre, preparare piatti Petri con e senza un fondo di vetro (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distanziale di fetta
	<ol>
<li>Preparare i distanziali per contenere campioni, utilizzando lastre di gomma siliconica con uno spessore di 0,5 mm (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tracer iniezione
Nota: Fare iniezioni nel collicolo superiore (2.2) o pons (2.1). Iniezione nei neuroni di proiezione Sub-cerebrale di etichetta pons in una regione vasta cervello, comprese le aree visive e motorie, mentre l'iniezione nel collicolo superiore etichette neuroni di proiezione Sub-cerebrale nel campo visivo. Per gli esperimenti di controllo, iniettare soluzione fisiologica invece di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B. Per il mantenimento dello stato sterile utilizzare attrezzature sterilizzate e guanti di plastica puliti con etanolo.
<ol><li>
Fare le iniezioni nel ponte di topi adulti.
	<ol>
<li>Disegnare 1 µ l di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B (25 µ g / µ l di PBS) in una siringa Hamilton G 26.</li>
		<li>Posto un iniettore pompa della siringa.</li>
		<li>Posizionare la siringa e la pompa al supporto utensile di un manipolatore posizionato su uno strumento stereotassica. Inclinare il manipolatore 12° posteriormente rispetto all'asse verticale.</li>
		<li>Anestetizzare un topo adulto maschio o femmina (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9) iniettando sodio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg di peso corporeo) o con la somministrazione di isoflurano (2 – 3%). Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.</li>
		<li>Posizionare il mouse sullo strumento stereotassica.</li>
		<li>Rimuovere accuratamente i capelli con una lama di rasoio per prevenire l'infezione e tagliare 10 mm del cuoio capelluto in modo che il bregma e lambda sono visibili. Somministrare 0,1 mL di lidocaina 1% utilizzando una pipetta. Regolando la posizione verticale del boccaglio sullo strumento stereotassica affinché il bregma e lambda hanno lo stesso livello di z, impostare l'angolo della testa.</li>
		<li>Regolare la posizione del manipolatore facendolo sullo strumento stereotassica in modo che la punta della siringa è vicino il bregma e registrare la posizione del manipolatore. Ritrarre la siringa spostando il portautensile sul manipolatore.</li>
		<li>Spostare il manipolatore 5,4 mm posteriormente e 0,4 mm lateralmente. Avanzare la siringa in modo che la punta si trova vicino al punto di entrata sul cranio. Ritrarre la siringa e segnare il punto di ingresso.</li>
		<li>La posizione contrassegnata, praticare un foro con un diametro di circa 1 mm.</li>
		<li>Inserire la punta della siringa nel foro in modo che la profondità della punta è 6,9 mm più di quella misurata presso il bregma.</li>
		<li>Iniettare 1 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Rimuovere la siringa dal cervello.</li>
		<li>Se necessario, coprire il cervello esposto con piccoli frammenti di microfibrillare emostato e adesivo istantaneo.</li>
		<li>Sciacquare il cervello esposto utilizzando soluzione fisiologica consegnato con una pipetta per prevenire l'infezione e suturare il cuoio capelluto.</li>
		<li>Rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Consentire il mouse per recuperare dall'anestesia in un incubatore a 30 ˚ c, in genere per 1 h. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Restituire il mouse per la compagnia di altri animali dopo che completamente ha recuperato.</li>
		<li>Mantenere il mouse per 3 – 7 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare le iniezioni nel collicolo superiore di topi adulti.
	<ol>
<li>Preparare una pipetta di vetro con un diametro di punta di 30 – 50 µm.</li>
		<li>Connettere la pipetta di vetro una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica (Figura 2A).</li>
		<li>Riempire la pipetta di vetro, tubo di plastica e siringa Hamilton con il liquido paraffina.</li>
		<li>Posto un iniettore pompa della siringa.</li>
		<li>Inserire la pipetta di vetro sul manipolatore e inclinare il manipolatore 60° posteriormente rispetto all'asse verticale (Figura 2B).</li>
		<li>Eseguire 2.1.4–2.1.9. La posizione del manipolatore è 1,4 mm posteriore, laterale di 0,5 mm per l'espressione lambda.</li>
		<li>Posizionare una pellicola di plastica piccolo paraffina sul cranio, quindi mettere circa 1 µ l della soluzione tracciante su di esso. Avanzare la pipetta di vetro e riempirlo con almeno 0,5 µ l della soluzione tracciante rapidamente.</li>
		<li>Inserire la pipetta di vetro in modo che la profondità di punta è di 3,0 mm dalla superficie del cervello.</li>
		<li>Iniettare 0,5 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Rimuovere la pipetta di vetro dal cervello.</li>
		<li>Eseguire 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fissazione e rifilatura
<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale sodio pentobarbital (60 mg/kg di peso corporeo) in un mouse (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9, con o senza l'iniezione tracciante come descritto nel passaggio 2. Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.</li>
	<li>Eutanasia il mouse umanamente irrorando il mouse via20 con soluzione fisiologica allo 0,9%.</li>
	<li>Difficoltà il mouse20 irrorando paraformaldeide al 4% (PFA) in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.5).</li>
	<li>
Tagliare il cuoio capelluto utilizzando un paio di forbici per esporre il cranio come descritto20.
	<ol>
<li>Tagliare la linea mediana del cranio esposto utilizzando un paio di forbici. Rimuovere il cranio usando il forcipe.</li>
		<li>Se contrassegnare la posizione del bregma e lambda è necessario, prima di rimuovere un emisfero del cranio. Inserire gli aghi sottili di tungsteno nel cervello alle posizioni del bregma e lambda sul cranio restanti sul cervello, quindi rimuovere il cranio rimanente. Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per eseguire la macchiatura dell'anticorpo dei neuroni inibitori, tagliare a fette i campioni di cervello.
	<ol>
<li>Posizionare il campione di cervello su un vibratomo.</li>
		<li>Tagliate le fette fino a 500 µm di spessore in PBS a temperatura ambiente e procedere al passaggio 5 (il AbScale metodo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se la macchiatura dell'anticorpo è necessaria, trim il campione di cervello a blocchi (fino a 3 mm di spessore) con una lama di rasoio (Figura 3) e procedere al passaggio 4 (metodo SeeDB). Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ° C dopo il taglio o rifilatura. Il metodo di SeeDB è preferibile quando la macchiatura dell'anticorpo non è necessaria perché richiede meno tempo rispetto al metodo dil. e AbSca.</li>
</ol>4. compensazione senza anticorpi (metodo SeeDB)
<ol><li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80% (w/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica di 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80,2% di fruttosio (w/w) e incubare per 24 h con agitazione delicata a temperatura ambiente. Nota: Maneggiare il campione accuratamente per evitare deformazioni più piccolo possibile. Non Incubare i campioni più lunghi rispetto a quanto indicato, come campioni possono rapidamente diventare opachi.</li>
	<li>Incorporare il campione in una camera di imaging riempita con la soluzione di fruttosio 80,2% (Figura 1B). Se necessario, correggere l'esempio mettendo piccoli pezzi di adesivo di gomma intorno. Se la camera è troppo profonda, mettere un piatto piano in Aula prima di mettere i campioni.</li>
	<li>Mettere la capsula di Petri con un coperchio di vetro sulla camera imaging e mettere l'acqua nel piatto e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione filtri sono descritti nella tabella 1. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.</li>
</ol>5. schiarimento con anticorpo che macchia (il AbScale metodo)
<ol><li>Preparare i reagenti come descritto in tabella 2.</li>
	<li>Trasferire le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL di soluzione di Sca/eS0 e li Incubare per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C (Figura 4B).</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 36 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eB4 e incubare le fette per 24 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare con gli anticorpi primari (tabella 3) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48-72 h a 37 ° C (Figura 4) con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 5 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare in 4 mL di soluzione di AbScale per 2 h 2 volte a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari con etichetta fluorescente (Tabella materiali, 1: 100) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48 h a 37 ° C con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL della soluzione elAbSca con cautela e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL della soluzione elAbSca e incubare le fette per 2 h 2 volte con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di 4% PFA e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca-eS4 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Posizionare il distanziale su un vetrino e mettere le fette nel distanziale e immergere le fette con Sca-eS4 soluzione. Sigillare il distanziatore con un vetro di copertura (Figura 1).</li>
	<li>Mettere l'acqua sul vetro di copertura e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato. Nota: Controllare se le parti profonde del campione sono etichettate allo stesso modo per le parti superficiali per confermare l'assenza di una significativa distorsione d'etichettatura. Nota: La penetrazione degli anticorpi testati è descritto nella tabella 3.</li>
</ol>6. determinazione della posizione di cella
<ol><li>Per ciascuna posizione in immagini digitalizzate, calcolare i valori di correlazione utilizzando un'immagine tridimensionale filtro14 (Figura 5A-5D).</li>
	<li>Determinare le posizioni dei picchi del valore di correlazione (Figura 5).</li>
	<li>Indagare le immagini intorno alle cime per individuare le celle (Figura 5E).</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo presentato le procedure per ottenere immagini tridimensionali su larga scala dell'organizzazione cellulare specifico del tipo dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5. Rispetto alla fetta convenzionale macchiatura, il metodo è più utile nel determinare l'organizzazione tridimensionale della neocorteccia. Il metodo consente acquisizione immagini dalla più ampia e le regioni del cervello più profonde rispetto al tipico in vivo microscopia 2-fotone o microscopia confocale convenzionale e, quindi, possono permettere l'analisi completa del cellulare neocortical organizzazione.
Un passaggio fondamentale del metodo è la penetrazione dell'anticorpo. Un sottoinsieme degli anticorpi Mostra scarsa penetrazione nella spessi esemplari (tabella 3) e, pertanto, non può essere utilizzato per il metodo dil. e AbSca. Per ottenere l'etichettatura uniforme con gli anticorpi utilizzati in questo studio, è stato necessario tagliare il cervello a 500 µm fette. L'uso di più piccoli frammenti di anticorpo, per esempio, Fab F(ab') 2 frammenti e/o altri metodi21,22,23,24,25,26, di compensazione 27,28 può migliorare i risultati.
Specificità dell'anticorpo antigene-legante è caratterizzato solitamente in fettine di tessuto sottile ma potrebbero essere diversi in tessuti spessi elaborati per schiarimento. Per controllare la specificità dell'anticorpo, abbiamo co-etichettato tessuti con tracciante iniezione e indicatore di espressione genica in animali transgenici e anche eseguiti esperimenti di blocchi utilizzando antigene proteine e peptidi14. Tali procedure e gli esperimenti di controllo utilizzando animali mutanti carenti gli antigeni bersaglio dovrebbe essere utili per confermare la specificità degli anticorpi.
Una limitazione del metodo è che qualche deformazione del provino è inevitabile dovuto la manipolazione dei campioni di massa morbida. Come ottenere immagini in vivo prima della fissazione e utilizzare queste immagini come riferimenti aiuterà a correggere tali deformazioni.
Le procedure presenti sono state progettate per l'analisi dello strato neocortical 5. Recenti analisi hanno identificato molti marcatori molecolari che tipi di un neurone delle cellule di etichetta in altri strati4,5,6,7, e l'applicazione di questi creatori per il presente metodo può consentire identificazione di importante organizzazione cellulare negli altri strati. Inoltre, dovrebbe essere possibile eseguire analisi simili nelle regioni del cervello diverso da neocorteccia e in altri organi rispetto al cervello, di indagare se una precisa organizzazione cellulare simile a microcolonne è presente.

La neocorteccia dei mammiferi è composta da un gran numero di tipi di cellule, ognuna con il pattern di espressione genica specifici, proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni1,2 ,3,4,5,6,7. Se questi tipi di cellule sono organizzati in strutture ripetute è stato poco chiaro. Colonne corticali, comprese le colonne di orientamento visivo e somatosensoriali botti, hanno ripetuto le strutture, ma la loro organizzazione cellulare rimane poco chiaro8,9. Questi sono presenti nelle specifiche aree corticali e non sono un sistema di tutto il cervello.
Nello strato neocortical 5, la grande maggioranza dei neuroni è classificata in quattro tipi principali. Un tipo principale di neuroni eccitatori, neuroni di proiezione Sub-cerebrale, proietta assoni subcortical obiettivi inclusi pons, midollo spinale e il collicolo superiore e, pertanto, rappresenta i principali output corticale via10. Neuroni di proiezione corticale, un altro tipo di neuroni eccitatori, innervano la corteccia10. Neuroni inibitori contengono anche due grandi classi: le cellule che esprimono parvalbumina ed esprimendo la somatostatina11.
Recenti analisi indicano che i tipi di quattro cellule sono organizzati in strutture ripetute12,13,14. Sia sub-cerebrale proiezione neuroni12,13,14 e proiezione corticale neuroni14 organizzare in cellula-tipo microcolonne specifico con un diametro di 1 – 2 celle. Le cellule che esprimono parvalbumina e somatostatina-esprimendo allineare specificamente con microcolonne dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale ma non con microcolonne di proiezione corticale neuroni14. Microcolonne stessi allineare periodicamente a forma esagonale della grata di matrice14 e sono presenti in più aree corticali, comprese le zone visivi, somatosensoriali e motori nel cervello del mouse12,14 e in lingua aree del cervello umano13. Neuroni nella microcolonna singolo esibiscono l'attività sincronizzata e avere risposte sensoriali simili14. Queste osservazioni indicano che tipi di cellule strato 5 organizzano in una struttura di reticolo microcolonna che rappresenta l'organizzazione di tutto il cervello nota prima di ripetere moduli funzionali.
Microcolonne hanno un raggio di circa 10 µm e hanno una periodicità spaziale di circa 40 µm. Inoltre, l'orientamento delle microcolonne è parallelo alla loro dendriti apicali e cambia a seconda della loro posizione nella corteccia14. Pertanto, il sistema microcolonna è difficile da analizzare utilizzando fette corticali convenzionale con uno spessore tipico di poche decine di micrometri. Inoltre, l'analisi della periodicità richiede dati tridimensionali da una vasta gamma di aree cerebrali e, pertanto, l'area di imaging tipico di microscopia confocale o in vivo imaging 2-fotone è troppo stretta.
Recentemente, le tecniche sono state sviluppate per deselezionare tessuti spessi15,16. Qui descriviamo l'applicazione di questi metodi per ottenere immagini tridimensionali, su larga scala dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5 che compongono il sistema microcolonna. Neuroni di proiezione subcerebral sono etichettati dall'etichettatura retrograda o dall'espressione della proteina fluorescente verde avanzata in Crym-egfp topi transgenici12e proiezione corticale neuroni sono etichettati da entrambi il retrogrado etichettatura o dall'espressione del tdTomato Tlx3-cre/Ai9 topi17. Le cellule che esprimono parvalbumina e che esprimono somatostatina sono etichettate da immunohistochemistry. Il metodo (anticorpo scala S) AbScale18 viene utilizzato per l'anticorpo che macchia esperimenti, mentre il metodo SeeDB (vedere cerebrale profonda)19 viene utilizzato per altri esperimenti. Questi metodi superare le suddette difficoltà dei metodi convenzionali di formazione immagine e rivelano l'organizzazione accurata di strato 514.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons injection</td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior colliculus injection</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical silk</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Liquid, light</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Inter medical</td><td>&amp;Phi;0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastic tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastic tube</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastic tube</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Tokyo chemical industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Cyclodextrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

La neocorteccia dei mammiferi è composta di molti tipi di neuroni eccitatori ed inibitori, ognuno con specifiche proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni, ma loro basic funzionale e anatomica organizzazione dal cellulare alla scala di rete è capita male. Qui descriviamo un metodo per l'imaging tridimensionale dei neuroni fluorescente etichettati attraverso grandi aree del cervello per l'indagine l'organizzazione corticale. Specifici tipi di neuroni sono contrassegnati tramite l'iniezione di traccianti fluorescenti di un neurone retrogradi o l'espressione di proteine fluorescenti in topi transgenici. Campioni di blocco del cervello, per esempio, un emisfero, sono preparati dopo la fissazione, reso trasparenti con tessuto metodi di compensazione e sottoposti a immunolabeling fluorescente dei tipi cellulari specifici. Grandi aree vengono scansionati usando microscopi confocale o due-fotone dotati di grande lavoro distanza obiettivi e fasi motore. Questo metodo può risolvere l'organizzazione periodica dei moduli funzionali di tipo-specific microcolonna di cella nella neocorteccia del mouse. La procedura può essere utile per lo studio di architettura cellulare tridimensionale in aree cerebrali diverse e altri tessuti complessi.

Abbiamo etichettato neuroni di proiezione corticale di espressione di tdTomato in Tlx3-cretopi transgenici /Ai9 e visualizzati i neuroni di proiezione Sub-cerebrale iniettando il tracciante retrogrado CTB488 nel ponte. L'emisfero sinistro del cervello è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionati usando un microscopio a due fotoni dotato di un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (25 X, N.A. 1.1, distanza di lavoro 2 mm) e un tavolino motorizzato. Una pila di 401 immagini (512 x 512 pixel; pixel size = 0.99 µm) z-Step = 2.8 µm a ciascuno dei 30 posizioni di scansione è stato ottenuto. I corpi cellulari dei due tipi cellulari erano visibili sopra una vasta gamma di aree cerebrali (Figura 6) e le sezioni ottiche ha mostrate microcolonne periodico (figura 7A). Inoltre, i cervelli dei topi Crym-egfp (mantenuti come eterozigoti con uno sfondo di C57BL/6J) sono stati liquidati con il metodo SeeDB ed imaged come sopra. I corpi cellulari e apicale dendriti dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale che esprimono EGFP erano visibili nelle sezioni ottiche (figura 7B).
Abbiamo anche effettuato etichettatura retrograda dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale in topi C57BL/6J utilizzando CTB488. Il cervello fisso è stato tagliato a fette coronali con uno spessore di circa 500 µm e sottoposte al metodo dell'AbScale, per marcare le cellule che esprimono parvalbumina (Anti-parvalbumina, 1: 1000; Anti-mouse IgG-fluorescente etichettato,). Stack di immagini (512 x 512 pixel, dimensione del pixel = 1,24 µm; z-passo = 2.17 µm, 268 immagini/stack) sono stati ottenuti usando la microscopia confocal con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (20 X, 1.0 N.A., distanza di lavoro 2 mm). Neuroni di proiezione Sub-cerebrale e cellule che esprimono parvalbumina erano entrambi visibili nelle fette (Figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig1.jpg"> Figura 1: Imaging chambers e distanziali. Parte superiore (A): fatto a mano con fondo di vetro della piastra di Petri (a destra) e una capsula di Petri senza un fondo di vetro (a sinistra). Fondo: Una camera (a destra) e le piastre del pavimento (a sinistra) in strati di silicone. (B) un emisfero del mouse sottoposta al metodo del SeeDB dopo iniezione di CTB555 nel collicolo superiore è impostato nella camera. Il campione è stato risolto con un pezzo di adesivo riutilizzabile. Vetrino (C), A (in alto) e un distanziatore in un foglio di silicone con uno spessore di 0,5 mm (in basso). (D) due fette della corona del cervello del mouse sono stati impostati nel distanziatore e coperto con un vetro di copertura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig2.jpg"> Figura 2: iniezione dell'elemento tracciante. (A) A pipetta di vetro collegato ad una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica. (B), un mouse è posizionato su uno strumento stereotassica. La pipetta di vetro viene inclinata a 60° circa posteriormente rispetto all'asse verticale per iniezione nel collicolo superiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig3.jpg"> Figura 3: taglio di campioni del cervello. (A) campione intero cervello dopo l'iniezione di CTB555 nel collicolo superiore e fissazione. Il bregma e lambda sono stati contrassegnati con aghi di tungsteno (frecce). (B), lo stesso campione tagliato per ottenere un emisfero. Si noti che gli aghi di tungsteno rimangono (frecce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig4.jpg"> Figura 4: Immersione di campioni di cervello in soluzioni per i metodi di elSeeDB e AbSca. (A) un campione di emisfero immerso in 0,5% α-thioglycerol e fruttosio 20% (p/v) per il metodo di SeeDB. (B) fette coronali immerse nella soluzione di Sca/eA2 per il metodo dil. e AbSca. (C) fette coronali immerse nella AbScale soluzione contenente anticorpi per il metodo dil. e AbSca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig5.jpg"> Figura 5: determinazione delle posizioni cell. Neuroni di proiezione Sub-cerebrale sono stati etichettati, iniettando il tracciante retrogrado CTB488 in ponte a 5 settimane dell'età. L'emisfero sinistro è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionato con microscopia del due-fotone (512 x 512 pixel, dimensione del pixel = 0.99 µm; z-passo = 2,8 µm, 601 immagini/stack). (A), A immagine singola. (B) cinque immagini da una pila di singola immagine. (C) l'immagine filtro utilizzato per rilevare i neuroni di proiezione Sub-cerebrale con etichetta CTB. (D) i valori di correlazione calcolata per le cinque immagini in (B) utilizzando il filtro in (C). (E) esempi di neuroni di proiezione Sub-cerebrale rilevato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig6.jpg"> Figura 6: risultati rappresentativi dell'imaging su larga scala. Neuroni di proiezione corticale (verdi) sono stati etichettati da tdTomato-espressione di Tlx3-cre/Ai9 topi transgenici, e neuroni di proiezione Sub-cerebrale (magenta) sono stati visualizzati iniettando il tracciante retrogrado CTB488 ponte a 7 settimane di età. L'emisfero sinistro è stato sottoposto al metodo SeeDB e la zona 1.250 µm a 2.690 µm laterale e-3,400 µm a 1.230 µm anteriormente il bregma è stati digitalizzati usando microscopia del due-fotone. Vista superiore (A). Posizione approssimative delle zone corticali sono stati indicati. (B–D) Vista obliqua della fluorescenza CTB 488 risultati neuroni di proiezione Sub-cerebrale (B), tdTomato fluorescenza mostrando neuroni di proiezione corticale (C) e l'immagine unita (D). R: anteriore; P: posteriore; M: mediale; D: dorsale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig7.jpg"> Figura 7: fotografie ad alto ingrandimento di risultati rappresentativi. (A) una sezione ottica dell'immagine nella Figura 6. Immagine di spessore = 20 µm. (B) neuroni di proiezione Sub-cerebrale EGFP-identificato in un topo eterozigote Crym-egfp a 6 settimane dell'età. Spessore di immagine = 30 µm. (C) proiezione Subcerebral neuroni (magenta) sono stati etichettati iniettando CTB488 nel ponte dei topi C57BL/6J al giorno postnatale 49 e che esprimono parvalbumina cellule (verde) sono state visualizzate dal metodo elAbSca. Spessore di immagine = 55 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58027/58027fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fluoroforo</td>
			<td>Es (nm)</td>
			<td>Filtro (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFP</td>
			<td>910</td>
			<td>500-550 (FF03-525-25/50, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>tdTomato</td>
			<td>1.000</td>
			<td>578-633 (D605 / 55m, Chroma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>750</td>
			<td>500-550 (FF03-525-25/50, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 555</td>
			<td>750</td>
			<td>563-588 (FF03-575-25/25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>750</td>
			<td>601-657 (FF01-629/56, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>700</td>
			<td>400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Lunghezze d'onda di eccitazione e filtri per microscopia del due-fotone.
Tabella 2: reagenti per il metodo di e AbScal. <a href="/files/ftp_upload/58027/JoVE_Table2_AbScaleReagents0411_1829_RE0425_1806.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigene</td>
			<td>Animali immunizzati</td>
			<td>ID prodotto</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>blocco di 3 mm</td>
			<td>Fetta di 500 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>CTIP2</td>
			<td>Ratto</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L6</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Statb2</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>ab51502</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAD67</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1: 200</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>GABA</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>A2052</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>235</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Capra</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>ab11427</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Somatostatina</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>T-4103</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>c-Fos</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>PC38</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: penetrazione degli anticorpi testati. Risultati per blocchi di spessore mm 3 viene visualizzato come segue; L1-L6: penetrazione nello spessore dell'intero corticale; L1-L2/3: penetrazione fino a layer 2/3; -: nessuna etichettatura; ND: non determinato. Risultati per 500 µm di spessore fette viene visualizzato come segue; +: etichettatura uniforme; -: nessuna o limitata etichettatura.

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  RIKEN Brain Science Institute. Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Video: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biologia

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Micro-TC del cervello neonatale del topo Scansione ed elaborazione delle immagini

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Autore in primo piano: Imaging ad alta risoluzione del cervello di un neonato di topo - Un protocollo Micro-CT con l&#39;agente di contrasto in soluzione di Lugol

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Imaging micro-CT e analisi morfometrica del cervello neonatale del topo

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...