Biz Atsushi Miyawaki ve Hiroshi Hama AbScale deneyler, Charles Yokoyama yazması, düzenleme için onların tavsiye için Eriko Ohshima ve Miyuki Kishino onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Japonya'nın bilimsel araştırma için T.H. RIKEN araştırma fonlarından T.H. ve Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (yenilikçi alanları "Mezoskopik Neurocircuitry"; 22115004) ve S.S. (25890023).

Tüm deneysel yordamlar RIKEN Wako hayvan deneyleri Komitesi ve RIKEN genetik rekombinant deneyi Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan imkanları RIKEN beyin bilim kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen Enstitüsü.
1. hazırlık Chambers'ı görüntüleme
<ol><li>
Odası19 görüntüleme
	<ol>
<li>Silikon kauçuk sayfalarını kullanarak, bir oda çeşitli kalınlıklarda yaklaşık 5 mm ve zemin plakaları kalınlığı ile hazırlayın. Ayrıca, Petri yemekler ve cam alt (Şekil 1A) olmadan hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dilim rondela
	<ol>
<li>Silikon kauçuk yaprak kalınlığı 0,5 mm (Şekil 1 c) kullanarak örnekleri, tutmak için boşluk ekleyiciler hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izleme enjeksiyon
Not: enjeksiyonları pons (2.1) veya üstün olacaklar (2.2) içine alın. Görsel bölgede üstün olacaklar etiketleri alt beyin projeksiyon sinirlerde içine enjeksiyon sırasında görsel ve motor alanlar da dahil olmak üzere geniş beyin bölgesi pons etiket alt beyin projeksiyon nöronlarda içine enjeksiyon. Kontrol deneyleri için fluorescently etiketli Kolera toksini alt birim B. yerine serum enjekte Steril koşul bakım için steril ekipmanları ve etanol ile temizlenmiş plastik eldiven kullanın.
<ol><li>
Yetişkin fareler pons içine enjeksiyonu yapmak.
	<ol>
<li>Bir fluorescently etiketli Kolera toksini alt birimi B 1 µL çizmek (25 µg/µL PBS içinde) 26 G Hamilton şırınga içine.</li>
		<li>Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.</li>
		<li>Şırınga ve pompa stereotaksik araç üzerinde yerleştirilen bir manipülatör araç sahibinin yerleştirin. Manipülatör 12 ° dikey eksenden özafagusu eğ.</li>
		<li>İntraperitoneally sodyum Fentobarbital enjekte edilerek bir erkek veya kadın yetişkin (C57BL/6J veya fare Tlx3-cre/Ai9) anestezi (60 mg/kg vücut ağırlığı) veya isoflurane (2-%3) yönetmek. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.</li>
		<li>Stereotaksik araç üzerinde fareyi getirin.</li>
		<li>Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi, 10 mm bregma ve lambda görünecek şekilde kesilmiş bir jilet kullanarak saç dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir pipet kullanarak %1 lidokain 0.1 mL yönetmek. Böylece bregma ve lambda aynı z düzeyde sahip stereotaksik cihazda ağızlık dikey konumunu ayarlayarak baş açısını ayarlamak.</li>
		<li>Manipülatör konumunu kaydetmek ve şırınga ucu bregma yakın olması stereotaksik araç üzerinde kaydırarak manipülatör konumunu ayarlayın. Şırınga manipülatör üzerinde araç tutucu taşıyarak geri çek.</li>
		<li>Manipülatör hareket 5.4 mm özafagusu ve 0.4 mm yanal. Böylece kafatası üzerinde giriş noktası ucu yakındır şırınga ilerlemek. Şırıngayı geri çekmek ve giriş noktası işareti.</li>
		<li>İşaretli konumda yaklaşık 1 mm çapında bir delik.</li>
		<li>Bu bregma ölçülen daha fazla ipucu derinlik 6.9 mm böylece şırınga ucu delikten yerleştirin.</li>
		<li>0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 1 µL enjekte.</li>
		<li>Şırınga beyinden kaldırın.</li>
		<li>Gerekirse, maruz kalan beyin microfibrillar hemostat ve anlık yapışkan küçük parçaları ile kapak.</li>
		<li>Bir pipet ile teslim salin enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi dikiş kullanarak maruz beyin durulayın.</li>
		<li>Fare stereotaksik araç kaldırın. Fareyi anestezi genellikle için 1 h 30 ˚C adlı bir kuluçka kurtarmak izin verir. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi sahipsiz bırakmayın. Tam olarak kurtarıldı sonra fare diğer hayvanlar şirkete geri dönün.</li>
		<li>Fare 3-7 gün boyunca korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yetişkin fareler üstün olacaklar içine enjeksiyonu yapmak.
	<ol>
<li>Cam Pipet ucu çapı 30 – 50 µm ile hazırlayın.</li>
		<li>Cam Pipet Hamilton şırınga plastik tüp (Şekil 2A) aracılığıyla bağlayın.</li>
		<li>Cam Pipet, plastik tüp ve Hamilton şırınga parafin sıvı ile doldurun.</li>
		<li>Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.</li>
		<li>Cam Pipet manipülatör yerleştirin ve manipülatör özafagusu dikey eksen (Şekil 2B) üzerinden 60 ° tilt.</li>
		<li>2.1.4–2.1.9 gerçekleştirin. Manipülatör 1.4 mm arka, 0,5 mm lateral lambda için konumdur.</li>
		<li>Kafatasında bir küçük plastik parafin film yeri, sonra yaklaşık 1 µL izleyici çözüm üzerine koydum. Hızlı bir şekilde Cam Pipet ilerlemek ve izleyici çözüm en az 0,5 µL ile doldurun.</li>
		<li>İpucu derinliğidir beyin yüzeyinden 3.0 mm Cam Pipet ekleyin.</li>
		<li>0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 0.5 µL enjekte.</li>
		<li>Cam Pipet beyinden kaldırın.</li>
		<li>2.1.13–2.1.16 gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fiksasyon ve düzeltme
<ol><li>Sodyum Fentobarbital (60 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneally (C57BL/6J veya Tlx3-cre/Ai9, ya da 2. adımda açıklandığı şekilde tracer enjeksiyon olmasın. bir fare içine enjekte. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.</li>
	<li>Fare fare transcardially%20 0,9 serum fizyolojik ile ventriküler tarafından insanca ötenazi.</li>
	<li>Ventriküler tarafından20 fare saptamak 0.1 M fosfat tampon (pH 7.5) % 4 paraformaldehyde (PFA).</li>
	<li>
Kafatası açıklanan20olarak ortaya çıkarmak için makas kullanarak kafa derisi kesilmiş.
	<ol>
<li>Makas kullanarak maruz kafatasının orta hat kesilmiş. Forseps kullanarak kafatasını.</li>
		<li>Bregma ve lambda konumunu işaretleme gerekli ise, önce bir yarımküre kafatası kaldırın. Beyin bregma ve beyin üzerinde kalan kafatasındaki lambda pozisyonlarda ince tungsten iğne takın, sonra kalan kafatası kaldırın. Not: Beyin 4 ˚C PBS içinde depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İnhibitör nöronlar antikor boyama gerçekleştirmek için beyin örnekleri dilimler halinde kesin.
	<ol>
<li>Beyin örnek bir vibratome yerleştirin.</li>
		<li>En fazla 500 µm oda sıcaklığında PBS içinde kalın dilimler kesin ve adım 5 (AbScale yöntemi)'e devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antikor boyama gereksizdir, trim beyin örnek (ilâ 3 mm kalınlığında) engeller bir tıraş bıçağı (Şekil 3) kullanarak ve adım 4 (SeeDB yöntemi)'e devam edin. Not: Beyin PBS içinde 4 ° C'de kesme veya düzeltme sonra saklanır. AbScale yöntemi daha az zaman gerektirir çünkü antikor boyama gerekmediğinde SeeDB yöntemi tercih edilir.</li>
</ol>4. takas antikor boyama (SeeDB yöntemi)
<ol><li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %20 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve % 40 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %60 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %100 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80.2 (w/w) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 24 h için kuluçkaya. Not: örnek dikkatle deformasyonlar olabildiğince küçük tutmak için baş. Örnekleri hızla opak olabilirsiniz gibi örnekleri belirtilenden daha uzun kuluçkaya değil.</li>
	<li>Örnek %80.2 fruktoz çözüm (Şekil 1B) ile dolu bir görüntüleme odası katıştırın. Gerekirse, örnek kauçuk yapıştırıcı küçük parçalar koyarak düzeltmek. Odası örnekleri yerleştirmeden önce odasında bir yere plaka koymak çok derin değilse.</li>
	<li>Görüntüleme odası cam kapaklı Petri kabına yerleştirin ve çanak ve görüntü confocal veya iki fotonlu mikroskobu uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile kullanarak su koyun. Uyarma dalga boylarında ve emisyon filtreler Tablo 1' de açıklanmıştır. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.</li>
</ol>5. (AbScale yöntemi) boyama antikor ile takas
<ol><li>Reaktifler Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Bir spatula 4 mL ani kalp durması/eS0 çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri aktarın ve onlara nazik 37 ° C'de (Şekil 4B) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 36 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eB4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 24 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>1 ml AbScale çözüm 48-72 h 37 ° C'de nazik sallayarak ile (Şekil 4 c) için birincil antikorlar (Tablo 3) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak bir 5 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>AbScale çözüm için 2 h 2 kez oda sıcaklığında hafif sallayarak ile 4 ml kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Fluorescently etiketli ikincil antikorlar (Tablo malzemeler, 1: 100) AbScale çözüm 37 ° C'de nazik sallayarak ile 48 saat için 1 ml ile kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir spatula 4 mL AbScale çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri kaldırmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve 4 mL AbScale çözeltisi ekleyin ve 2 kez nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 2 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırın ve 4 mL % 4'lük ekleyin PFA ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eS4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Bir cam slayt üzerinde spacer yer ve dilimleri içinde spacer yer ve ani kalp durması/eS4 çözüm dilimlerle batırmayın. Rondela (Şekil 1 d) bir cam ile kapatın.</li>
	<li>Su cam ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile confocal veya iki fotonlu mikroskobu kullanarak resim koymak. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın. Not: örnek derin bölgelerinde önemli bir etiketleme önyargı yokluğu onaylamak için yüzeysel bölümlerine benzer şekilde etiketli olup olmadığını kontrol edin. Not: Penetrasyon test antikorların Tablo 3' te tanımlanmıştır.</li>
</ol>6. hücre konumu belirleme
<ol><li>Taranan görüntülerde her bir pozisyon için bir üç boyutlu görüntü filtresi14 (Şekil 5A-5D) kullanarak korelasyon değerleri hesaplar.</li>
	<li>Correlation değeri (Şekil 5 d) doruklarına konumları belirler.</li>
	<li>Görüntüleri hücreleri (Şekil 5E) bulmak için zirveleri etrafına araştırmak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462 (2015).</li><li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity.">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+Challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortical+column:+a+structure+without+a+function.">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li><li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+cortical+column+would+that+be?.">Whose cortical column would that be?.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li><li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron.">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li><li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V.">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex.">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li><li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex.">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li><li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors.">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling.">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li><li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits.">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kim, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent.">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex,+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+(Ce3D).">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz büyük hücre tiplerinin fare neocortical tabakasında 5 hücre türüne özgü organizasyonun büyük ölçekli üç boyutlu görüntü elde etmek yordamlar sundu. Geleneksel dilim boyama için karşılaştırıldığında, yöntem yeni korteksimiz üç boyutlu organizasyonu belirlemede daha yararlı olur. Yöntem resim alma üzerinden daha geniş ve daha derin beyin bölgeleri tipik vivo içinde 2-foton mikroskopi veya geleneksel confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında ve böylece, neocortica...

Memeli yeni korteksimiz çok sayıda hücre tipleri, her biri belirli bir gen ifade desenleri, elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, oluşur ve in vivo 1,2 işlevleri ,3,4,5,6,7. Bu hücre türleri tekrarlanan yapılarına olup olmadığını düzenlenir belirsiz oldu. Görsel yönü sütun ve somatosensor varil, birlikte, kortikal sütunlarını yapıları tekrarladık, ancak belirsiz8,9hücresel kuruluşlarındaki kalır. Bunlar belirli kortikal alanlarda mevcut ve beyin çapında bir sistem değildir.
Neocortical katmanında 5, nöronlar büyük çoğunluğu dört önemli türe sınıflandırılmaktadır. Eksitatör nöronlar, alt beyin projeksiyon nöronlar, büyük bir tür aksonlar subcortical hedeflerine pons, spinal kord ve üstün olacaklar gibi projeler ve bu nedenle, büyük kortikal çıkış yolu10temsil eder. Kortikal projeksiyon nöronlar, eksitatör nöronlar, başka bir ana türü korteks10innervate. İnhibitör nöronlar da iki büyük sınıflar içerir: parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri11.
Son analizler dört hücre tipleri tekrarlanan yapıları12,13,14düzenlenir gösterir. Alt beyin projeksiyon nöronlar12,13,14 ve kortikal projeksiyon nöronlar14 hücre tipi belirli microcolumns 1-2 hücreleri çapında organize etmek. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri özellikle alt beyin projeksiyon nöronların microcolumns ancak değil microcolumns kortikal projeksiyon nöronlar14hizalayın. Microcolumns kendilerini düzenli olarak altıgen bir dizi14 örgü ve fare beyin12,14 ve dilinde görsel, somatosensor ve motor alanları da dahil olmak üzere birden çok kortikal alanlarda mevcut formuna hizalayın. insan beyni13alanları. Bireysel microcolumn nöronlarda eşitlenmiş aktivite sergilemek ve benzer duyusal tepkiler var.14. Bu gözlemler katmanı 5 hücre tipleri fonksiyonel modüller yinelenen ilk bilinen beyin çapında organizasyonu temsil eden bir microcolumn kafes yapısına düzenlemek gösterir.
Microcolumns yaklaşık 10 µm bir yarıçap ve yaklaşık 40 µm kayma bir periodicity var. Buna ek olarak, microcolumns yönünü paralel onların apikal dendrites ve korteks14konumlarına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, microcolumn sistem birkaç mikrometre onlarca tipik bir kalınlık ile geleneksel kortikal dilimleri kullanarak analiz etmek zordur. Ayrıca, bir çeşitli beyin bölgeleri ve bu nedenle, confocal mikroskobu tipik görüntüleme alanını üç boyutlu verileri periodicity analiz gerektirir veya vivo içinde 2-foton görüntüleme çok dardır.
Son zamanlarda, teknikleri kalın doku15,16temizlemek için geliştirilmiştir. Burada fare neocortical katmanı 5 büyük hücre tiplerinde microcolumn sistemi oluşturan büyük ölçekli, üç boyutlu görüntüleri elde etmek için bu yöntemlerin uygulanması açıklanmaktadır. Subcerebral projeksiyon nöronlar retrograd etiketleme veya Crym-egfp transgenik fareler12ve kortikal projeksiyon nöronların her iki tarafından retrograd etiketlenir gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade etiketlenir etiketleme veya Tlx3-cre/Ai9 fareler17tdTomato ifadede. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri immünhistokimya tarafından etiketlenir. (Antikor ölçek S) AbScale yöntemi18 antikor (bkz: derin beyin) SeeDB yöntemi19 diğer deneyler için kullanıldığı gibi deneyler, boyama için kullanılır. Bu yöntemler konvansiyonel görüntüleme yöntemleri yukarıda belirtilen zorlukları aşmak ve katmanı 514doğru hücresel organizasyonu ortaya koyuyor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crym-egfp transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>012003-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlx3-cre transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>36547-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX #7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-01</td>
			<td>0.5 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-02</td>
			<td>1.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-05</td>
			<td>3.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C022241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 310</td>
			<td>Pons injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 100</td>
			<td>Superior colliculus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Toyo Associates</td>
			<td>HP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene microfibrillar hemostat</td>
			<td>Davol Inc</td>
			<td>1010090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alonalfa</td>
			<td>Daiichi-Sankyo</td>
			<td>Alonalpha A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Liquid, light</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26132-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Otsuka</td>
			<td>1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26126-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>Inter medical</td>
			<td>&#934;0.1 *L200 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-thioglycerol</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33709-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-) Fructose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>16315-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BluTack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>CKBT-450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>COMS</td>
			<td>PT100C-50XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-492/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-575/25-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-629/56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>D605/55m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic tube</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>VIO-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tube</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35905-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyserol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>191612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-sorbitol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-14735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo chemical industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Cyclodextrin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td>
			<td>Skin Essential Actives</td>
			<td>33996-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>13445-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTIP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Statb2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Frontier Institute</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin</td>
			<td>Peninsula Laboratories</td>
			<td>T-4103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fos</td>
			<td>CalbioChem</td>
			<td>PC38</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

Memeli yeni korteksimiz eksitatör ve inhibitör nöronlar, her biri belirli elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, birçok türde oluşmaktadır ve in vivo fonksiyonları, onların temel fonksiyonel ve anatomik Organizasyon hücresel ağ ölçek kötü anlaşılmaktadır. Burada beyin kortikal hücresel organizasyon incelenmesi için geniş alanlar arasında fluorescently etiketli nöronlar üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronlar belirli türleri floresan retrograd nöronal izleyiciler enjeksiyon veya transgenik farelerde floresan proteinlerin ifade tarafından etiketlenir. Blok beyin örnekler, Örneğin, bir yarımküre fiksasyon sonra hazırlanan, yöntemleri takas doku ile şeffaf yapılmış ve belirli hücre tiplerinin floresan immunolabeling tabi. Geniş alanlarda büyük çalışma mesafe hedefler ve motorlu aşamaları ile donatılmış confocal veya iki fotonlu mikroskoplar kullanılarak taranır. Bu yöntem hücre türüne özgü microcolumn fonksiyonel modüller içinde fare yeni korteksimiz periyodik organizasyonu çözebilirsiniz. Yordamı üç boyutlu hücresel mimarisi farklı beyin bölgeleri ve diğer karmaşık doku çalışma için yararlı olabilir.

Kortikal projeksiyon nöronlar tdTomato Tlx3-creiçinde ifade tarafından /Ai9 transgenik fareler etiketli ve retrograd izleyici CTB488 pons enjekte edilerek alt beyin projeksiyon nöronlar görüntülenir. Beynin sol hemisfer SeeDB yöntemine maruz bırakıldı ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile donatılmış iki fotonlu mikroskop kullanarak inceden inceye gözden geçirmek (25 X, N.A. 1.1, çalışma mesafesi 2 mm) ve motorlu bir sahne. 401 görünt?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex at JoVE.com

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Görüntüleme.  RIKEN Brain Science Institute. Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Video: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Nörobilim

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Davranış

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biyoloji

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Fare Yenidoğan Beyin Mikro-BT Tarama ve Görüntü İşleme

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Yazar Spotlight: Fare Yenidoğan Beyinlerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi - Lugol&#39;un Solüsyon Kontrast Maddesi ile Bir Mikro-BT Protokolü

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...